中间苍白杆菌的脂多糖及其作为哺乳动物免疫刺激剂的用途的制作方法

专利名称：中间苍白杆菌的脂多糖及其作为哺乳动物免疫刺激剂的用途的制作方法
中间苍白杆菌的脂多糖及其作为晡乳动物免疫刺激剂的用
途本发明涉及从中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)菌株LMG3306中分离、纯化和表征脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，以及其作为哺乳动物免疫剌激剂的用途、制备用于治疗和/预防败血症的药物化合物的方法和用于免疫抑制动物中和对抗利士曼原虫(Leishmania)的疫苗佐剂。
背景技术：
苍白杆菌(Ochrobactrum)属的成员包括在变形菌(Proteobacteria)域(domain)的α-2亚群中。它们主要存在于土壤中，已知其仅在病情危重或免疫力低下的患者中或在留置导管的患者中具有致病性。虽然在这些情况下苍白杆菌可引发脑膜炎、骨髓炎、菌血症和败血症，但这些细菌本身不能造成慢性感染，并且在导管去除之后从正常宿主中被清除(Cieslak，T. J.，C. J. Drabick 和 M. L Robb. 1996. Pyogenic infections due toOchrobactrum anthropi. Clin. Infect. Dis. 22 :845-847.) 0因为所有脂多糖(革兰氏阴性细菌外膜的主要成分)的组成遵循一般原则，即其包含通过特异性糖(称为2-酮基-3-脱氧辛酮糖酸(KD0，2-keto-3-deoxyoctulosonicacid))连接至脂质组分(称为脂质 A)的多糖(Rietschel，E. T.，Schade，U.，Jensen, Μ.，Wollenweber,H. W. ,Luderitz, 0.和Greisman，S. G. 1982. Bacterial endotoxins chemicalstructure，biological activity and role in septicaemia. Scand. J. Infect.Dis.Suppl. 3 8)，因此已假定所有LPS分子都具有相同的生物学效应。然而，这一观念已经被研究所改变，所述研究显示，几种LPS产生细胞因子合成的能力存在很大差异，该作用与其脂质A部分的结构特征相关(Netea，M. G.，van Deuren，Μ.，Kullberg, Β· J.，Cavaillon，J. Μ·和 van der Meer, J. W. M. 2002. Does the shape oflipid A determine the interaction of LPS with Toll-like receptors TrendsImmunol. 23 :135.)。嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)是革兰氏阴性的兼性细胞内细菌，就低细胞内毒性和其LPS的化学结构而言，其也类似于布鲁氏菌(Brucella)，并且显著低于肠杆菌的 LPS 所引起的毒性(Zahhnger，U.，Knirel，Y. A.，Lindner, B.，Helbig,J. H.，Sonesson, A.，Mane, R.和 Rietschel，Ε. Τ. 1995. The lipopolysaccharide ofLegionella pneumophila serogroup I (strain Philadelphia I) chemical structureand biological significance. Prog. Clin. Biol. Res. 392 :113. 26)。人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)已知与布鲁氏菌亲缘关系最近(Velascoet al. International Journal of Systematic Bacteriology 48(1998)759-768)。尽管其种系进化关联性接近，B. abortus与苍白杆菌在OM特征上显著不同，并且这些广泛的差异至少部分是由LPS中的微小变化所引起的(Velasco等Infection and Immunity68(2000)3210-3218)。测定了来自中间苍白杆菌LMG 3301的LPS的完整核心脂质A主链(backbone)和来自人苍白杆菌 LMG 3331 的 LPS 的 O 链(Velasco et al. Carbohydrates Research306(1996) 123-126 ；Velasco et al. Carbohydrates Research 306(1998)283-290;Velasco et al. Infection and Immunity 68(2000)3210-3218)。Velasco 等描述了中间苍白杆菌的菌株 LMG3306 (International Journal ofSystematic Bacteriology 48 (1998) 759-768)，然而,以前尚无对来自中间苍白杆菌LMG3306的LPS的描述。另一方面，仅在美国每年就有大约900，000例败血症病例，引起大约210，000例死亡，并花费几乎170亿美元。败血症是一种发生率在上升的常见疾病，死亡率为27 48%。败血症性休克(septic shock)是败血症的后果，其经常是致命的。败血症中伴随感染而发生的严重炎症是多种治疗性干预的靶标。然而，对败血症的炎症方面，使用一般抗炎剂超过20年的临床试验已经证明，该方法并不成功。导致败血症的病理机制是复杂的，且远未被理解。败血症涉及全身性的炎性应答， 继之以补偿性抗炎应答。它们之间的平衡对于宿主的存活是关键的。此外，败血症的动物模型不容易模拟人类患者中败血症的复杂性。据认为，败血症性休克的多数结果与循环内毒素(LPS)的大量释放有关，因此，最近已经进行了一些通过Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)拮抗剂来治疗该作用的尝试。因此，正处于II期的作为TLR4拮抗剂而发挥作用的Eritoran (LPS的脂质A部分的结构类似物)在严重败血症患者中显示出对死亡率的降低。此外，TAK-242是TLR4信号转导抑制剂，其降低促炎细胞因子的水平，并且还在高IL-6水平的严重败血症患者的亚组中降低死亡率。目前，很多感染性疾病尚无疫苗。这些情况中的一些是因为缺乏正确的佐剂来诱导正确和适宜的免疫应答。对于一些感染剂，例如细胞内细菌、病毒和多数原生动物，保护性免疫应答为以产生IFN-Y为特征的T辅助细胞I型(THl)。相反，对抗多数寄生虫的保护性应答是以产生IL-4为特征的类型2(TH2) (Fresno, Μ.，M. Kopf和L. Rivas. 1997.Cytokines and infectious diseases. Tmmunol Today 18:56-58)。可用于人类疫苗制剂的佐剂很少，因为它们中的很多由于加剧的Thl诱导是有毒性的。其实并非佐剂的明矾(alum)用在多数人类疫苗制剂中。最近，Toll样受体(TLR)的激动剂已经引起了很大关注(Hoffman,Nature Reviews Drug Discovery 4,879,2005)(Kwissa ；Expert Vaccine Rev.,6，G73，2007)。当前正在分析几种抗原和各种TLR的几种激动剂。最终，任何疫苗制剂(包括已经被许可的那些疫苗)的主要问题之一是其在免疫抑制的对象中基本没有作用。此外，其中的一些在这些患者中具有继发作用(Kwissa，等2007)。Velasco 等 Carbohydrates Research 306 (1998) 283-290 描述了来自中间苍白杆菌LMG 3301的野生型的深-粗糙(de印-rough) LPS (不存在O链并且外核心部分缺乏一些单糖的LPS)的完整核心脂质A主链；确定了来自人苍白杆菌LMG 3331 LPS野生型的光滑(smooth) LPS 的 O 链(Velasco 等 Carbohydrates Research 306 (1996) 123-126);并且Velasco 等 Infection and Immunity 68 (2000) 3210-3218 发表了脂质 A和完整 LPS 的分子量。Velasco 等描述了中间苍白杆菌 LMG 3306 的菌株(International Journal ofSystematic Bacteriology 48 (1998) 759-768)，然而，以前尚无对中间苍白杆菌 LMG 3306的野生型光滑LPS的描述。

发明内容
目前，已经证明中间苍白杆菌菌株LMG3306的脂多糖(頂)可有效用于治疗和/或预防败血症，以及在用于免疫抑制动物和在对抗利什曼病的疫苗中用作佐剂。因此，根据本发明的第一个方面，其涉及中间苍白杆菌菌株LMG 3306的脂多糖(IM)在制备用于治疗和/或预防败血症的药物，以及用于免疫抑制动物中和对抗利什曼病的佐剂疫苗中的用途。根据本发明的一个实施方案，其提供了中间苍白杆菌菌株LMG 3306的脂多糖(IM)在制备用于治疗和/或预防败血症性休克和内毒素性休克的药物中的用途。根据本发明的另一个实施方案，其提供了中间苍白杆菌菌株LMG 3306的LPS(IM) 作为用于人类和动物的感染性疾病之疫苗佐剂的用途。根据本发明的一个具体实施方案，其提供了 IM在制备用于治疗和/或预防免疫抑制动物(包括人)之感染的药物的用途。根据本发明，中间苍白杆菌菌株LMG 3306的脂多糖中的所述用途适用于人类和动物。因此，在整个本发明中，所提及的在动物中的应用也包括在人中的应用。总而言之，在免疫抑制的动物中，治愈和预防败血症和内毒素血症的哺乳动物免疫刺激剂具有疫苗佐剂的特性，并且，在足垫利什曼病的实验性小鼠模型中具有疫苗佐剂的特性以及保护性和治疗性作用。已经证明，頂(来自中间苍白杆菌菌株LMG3306的脂多糖)作为免疫刺激剂，具有广泛的活性，包括-诱导巨噬细胞中产生IL-12。-本发明的LPS所诱导的TNF水平远低于肠LPS，不引起病理作用。-本发明的LPS诱导T辅助细胞I(THl)刺激和Y -IFN的产生。该化合物与哺乳动物中激发免疫应答的能力相关联。因此，本发明提供免疫刺激剂组合物，其包含中间苍白杆菌菌株LMG3306的脂多糖，和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂。优选地，免疫应答的调节在于增强人的免疫功能。本发明涉及頂(哺乳动物的免疫刺激剂)的用途，其用作预防和治愈败血症和内毒素血症的化合物。本发明特别涉及其作为佐剂改善在正常的和实验性免疫抑制的动物中接种的用途。在这方面，作为其佐剂特征的一个例子，本发明特别涉及IM作为疫苗佐剂用于实验性利什曼病感染和使用硕大利什曼原虫(Leishmania major)足垫利什曼病的实验性小鼠模型对皮肤利什曼病的治疗性和保护性作用。本发明涉及由中间苍白杆菌菌株LMG3306制备LPS的方法，所述LPS作为化合物用于医药领域，用作哺乳动物的免疫刺激剂。本发明提供了作为免疫刺激剂在牛、猪、奶牛和小鼠中的实验领域的试验开发中的特异性活性-联合本发明进行特异性接种之后，在增加针对IBR病毒的中和抗体中的影响-诱导巨噬细胞分化
-在巨噬细胞中诱导TNF-在巨噬细胞中诱导IL-12-诱导脾淋巴细胞产生IFN-Y-通过TLR4和TLR2受体的免疫刺激作用-以剂量依赖的方式影响T细胞的刺激因此，本发明涉及中间苍白杆菌菌株LMG3306脂多糖(LPS)能够在哺乳动物中激发免疫应答的能力。因此，本发明提供免疫刺激剂组合物，所述组合物包含中间苍白杆菌菌株LMG3306的脂多糖和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂。优选地，免疫应答的调节在于增强哺乳动物的免疫活性(immunocompetence)。
本发明还涉及在哺乳动物中调节免疫应答的方法，包括给哺乳动物施用中间苍白杆菌菌株LMG3306的LPS或含有所述LPS的药物组合物。因此，本发明还涉及免疫刺激剂组合物在制备用于在哺乳动物中诱导一般细胞免疫的药物中的用途。本发明还涉及本发明的免疫刺激剂组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在哺乳动物中诱导巨噬细胞分化、产生1即、产生11^-12、脾淋巴细胞产生正^￥和刺激病毒特异性⑶8和⑶4 T细胞，其包括给哺乳动物施用中间苍白杆菌LMG3306的LPS。根据另一个实施方案，本发明的免疫刺激剂组合物用作疫苗的佐剂，用于改进针对所述疫苗中含有的特异性病毒或细菌的免疫。与以低的亚致死剂量或其他较低毒性的LPS预防内毒素性休克相关的多数工作已证明，需要事先接种(Hatao, F.,等，The induction of super-resistance usingsynthetic lipopolysaccharide receptor agonist rescues fatal endotoxemia in ratswithout excessive immunosuppression. Shock2005 ；23(4) :365-70.)。发明人惊奇地发现，中间苍白杆菌菌株LMG 3306的脂多糖不需要在前的脱敏期，而仅连同LPS —起接种中间苍白杆菌菌株LMG 3306的脂多糖即避免了该毒性作用。此外，大多数已发表的数据发现了体外或细胞系中TNF抑制与体内的脱敏作用之间存在相关性(参见例如，Lehner, MD，等,Lipopolysaccharide and Highly PurifiedLipoteichoic Acid Via Different Toll-Like Receptors Independent of ParacrineMediators. 2,001. J. Immunol. 166 :5161-5167)。然而,发明人现已证明中间苍白杆菌菌株LMG3306的脂多糖虽然在体内保护LPS的作用，但并不降低巨噬细胞系和腹腔巨噬细胞或脾脏细胞中TNF或IL-12的分泌。体内的初步结果还提示中间苍白杆菌菌株LMG 3306的脂多糖(頂)能够以某种方式显著降低LPS所诱导的TNF水平。不论如何，TNF水平和保护作用之间没有直接的相关性。这些结果是出人意料的。另一些假说给出了 IL-10或TGF- β产量增加产生脱敏作用的原因(Randow，F.等，Mechanism of endotoxin desensitization involvement of 35 interleukin 10and transforming growth factor beta. J. Exp. Med 1995. 181,1887-1892)。然而，情况似乎并不是这样，因为实际上IM在体外几乎不诱导IL-10，事实上，似乎有某物抑制了外周巨噬细胞或脾脏细胞中IL-10的产生(尽管其不显著)，并且，除了在C57BL/6小鼠的脾脏细胞中的情况之外，LPS诱导的IL-10水平并未通过頂而显著增加。另外一个有趣的方面是頂调节病原体之间免疫应答的能力。因此，使用硕大利什曼原虫感染的系统，显现出頂促进免疫原性利士曼原虫抗原提取物的作用，其方式与CpG不类似。已知CpG为免疫调节剂，其通过与TLR9联合而增强Thl应答(其对于诸如利士曼原虫和许多其他病原体而言是保护性的)，并且已经作为免疫调节剂和疫苗佐剂而获得专利。然而，体内頂不像CpG那样明显地改变Thl/Th2的比例。这可表明，在体液(Th2)和细胞(Thl)具有重要保护作用的感染中，頂可比CpG佐剂更好。或许更重要的是证明了頂不仅可以诱导保护性应答，而且可直接诱导保护作用，即对利士曼原虫感染具有治疗性作用。在整个说明和权利要求书中，词语“包含”及该词的变化形式并不意在排除其他技术特征、添加物、成分 或步骤。对于本领域技术人员来说，经过查看本说明书，本发明的其他目的、优点和特征会变得显而易见，或可通过实施本发明而得知。以下实施例和附图通过举例说明来提供，且其并不意在限制本发明。此外，本发明涵盖了本文中描述的具体实施方案和优选实施方案的所有可能的组合。附图简述图I显示因使用頂而对大肠杆菌(E.Coli)LPS所引起的毒性作用的预防。用LPS (I. 75mg)或IM (中间苍白杆菌的LPS)，以O. 6 μ g/Kg (剂量60)或3 μ g/Kg (剂量300)单独或联合处理每组5只小鼠的组，并评价存活率。图2显示对LPS内毒素性休克的治疗。以LPS (2mg/动物)处理5只动物的组。24小时后，给他们注射IM (中间苍白杆菌的LPS) O. 6 μ g/Kg (剂量60)或3 μ g/Kg (剂量300)，并评价存活率。图3显示对大肠杆菌性腹膜炎的预防。以大肠杆菌(I X IO7菌落形成单位，CFU)感染每组5只小鼠的组；在此24小时之前，用IM(中间苍白杆菌的LPS)O. 6 μ g/Kg(剂量60)或6 μ g/Kg(剂量600)接种动物，并评价存活率(上图)和临床症状(下图)。图4显示对大肠杆菌性腹膜炎的治愈。以大肠杆菌(I X IO8菌落形成单位，CFU)感染每组5只小鼠的组；4小时之后，用IM(中间苍白杆菌的LPS)6 μ g/Kg(剂量600)接种动物，并评价存活率(上图)和临床症状(下图)。图5显示针对利什曼病的保护性免疫和作用过程中免疫模式的一般特征。如该图所示，寄生虫与巨噬细胞的相互作用产生免疫应答，所述免疫应答如果主要基于Thl淋巴细胞的刺激，那么所述应答对寄生虫是有效和成功的，但如果Th2的应答是典型的，则会表现出感染。图6显示用于评价利什曼病疫苗之潜在佐剂頂25 (中间苍白杆菌LMG 3306的脂多糖)的免疫接种方案。在第O、15和30天，以单独的SLA抗原或与CpG或IM —起接种每组5只小鼠的组。在第60天,给每只动物在每个足垫中接种1000个前鞭毛体(promastigote),并评价损伤的发展和免疫参数。图7显示以SLA和SLA-CpG(上图)或以SLA-頂为佐剂接种的动物中损伤的发展。其对沿着感染的足垫肿胀进行定量。图8显示相对于对照(PBS)而言，以SLA和SLA_CpG、SLA-M接种的动物的足垫中损伤的宏观状态。图中包括感染6周内对照组动物、以SLA接种的一只、以SLA-CpG接种的一只和以SLA-IM接种的6只动物的照片。图9显示对脾和淋巴结(DLN)中寄生虫数目的定量，其中，与对照组相比，用SLA免疫接种对所述器官中计数的寄生虫数目不产生任何降低，而SLA-CpG可使该计数降低大约2个对数(log)的量级，并且其中SLA-IM组获得了类似的降低效果。


图10显示对来自被处死动物之脾的细胞中，以及这些分离的细胞和以SLA体外刺激的细胞中Thl应答(IFN-Y)和/或Th2(IL-4)应答之评价的图示结果。图11显示在特异性抗体同种型IgG2a(Thl)和IgGl (Th2)方面，基于对利士曼原虫水平的分析而对Thl/Th2应答的评价。图12显示评价IM对利士曼原虫实验性感染的治疗效果的实验方案。图13(A)显示以頂接种的动物中损伤的发展。其对沿着感染的足垫肿胀进行量化。(B)显示与对照组(PBS)相比，以IM接种的动物之足垫损伤的宏观状态。其中包括感染6周内属于对照组的一只动物、以CpG接种的一只动物和以SLA-IM接种的全部6只动物。(C)显示7周之后，脾和淋巴结(DLN)中对寄生虫数目的定量。图14显示PBS对照样品、CpG和頂之间的IgGl和IgG2a(包括它们之间的比值)的对比表格。
图15显示用于在免疫抑制动物中分析佐剂RT之作用的实验方案的概要。以地塞米松免疫抑制每组5只动物的组，并用SLA、SLA-CpG或SLA-頂接种。24小时后，感染所述动物，并随后在第8天再次感染。在第60天处死后，评价损伤的发展和免疫参数。图16显示以SLA接种之后，M在小鼠脾细胞中的佐剂作用。用或不用抗原SLA (10g/ml)培养所述脾细胞72小时，并通过在72小时的时间内将trimidina整合进DNA来评价增殖。结果显示三次重复的两个实验的平均值，每个实验中使用6只动物。图17显示对接种动物的脾细胞产生IL-4的影响。所述脾细胞分离自多种动物，且用SLA(10g/ml)刺激，并用ELISA分析IL-4的分泌。图18显示对接种的和用地塞米松(DEX, dexamethasone)处理的小鼠脾细胞的IL-4和IFN-Y的作用。图19显示被接种的动物中对SLA的细胞应答。其显示在体外添加SLA之后17天，对抗IFN-Y的特异性应答和对SLA的应答。其显示IFN-Y分泌(Thl)/IL_4 (Th2)的比例。图20显示与Raw巨噬细胞中的大肠杆菌LPS相比添加免疫刺激化合物之后J774细胞的分化。本发明的免疫刺激化合物诱导对J774巨噬细胞之分化的剂量依赖性抑制。该作用比在J774或Raw巨噬细胞中基于重量/体积使用大肠杆菌LPS所观察到的作用(未显示)低约500。图21显示未受刺激的巨噬细胞不合成可通过ELISA检测的TNF。在J774巨噬细胞(图21a)和在raw细胞中(未显示)，本发明的免疫刺激剂组合物在剂量为O. I 10 μ g/ml时，以剂量应答的方式诱导显著的TNF产生，反应性水平高达4000pg/ml。本发明的免疫刺激剂的作用虽然高度地显著，但比大肠杆菌的LPS弱约500倍(图21b)。图22显示本发明的免疫刺激剂组合物在来自Balb/c和C57B16品系小鼠的巨噬细胞中诱导TNF的产生，但是在同等浓度下比大肠杆菌LPS的效能低(图3)。图23显示本发明的免疫刺激剂在剂量为IOm μ g/ml时，在来自C57B1/6和Balb/c的腹腔巨噬细胞中诱导大量的IL-12(图4)。图24显示A刺激诱导来自两个品系小鼠的脾细胞大量分泌IFN-Y，提示激发了以IFN-Y产生为特征的Thl应答。本发明的免疫刺激剂组合物在剂量为I IOm 口 g/ml时，诱导来自C57B1/6和Balb/c脾淋巴细胞的大量IFN-Y。图25显示本发明的免疫刺激剂组合物在来自C57B1/6的腹腔巨噬细胞中诱导TNF,而TLR-2缺陷仅部分地阻止该活性，并且巨噬细胞中缺乏TLR4强烈地降低了所述诱导。图26显示本发明的免疫刺激剂组合物在来自C57B1/6的腹腔巨噬细胞中诱导IL-12，而TLR-2缺陷仅部分地阻止该活性，并且巨噬细胞中缺乏TLR4强烈地降低了所述诱导。图27显示A刺激诱导IFN- Y的分泌，其在来自C57B1/6 tlr2_/_的脾细胞中被显著地抑制，并且当使用IOmg免疫刺激化合物用于C57B1/6 tlr4_/_细胞时，所述分泌几乎完全消失。图28显示在来自B6 C57小鼠的脾细胞中，用淋巴丛脑膜炎(Lymphochoremeningitis)病毒感染并添加不同的刺激物之后诱导的⑶4(图28a)或⑶8(图28b)T细胞应答；从左至右无肽；LCMV NP 396肽(肽NP 396);单独的培养基；PMA 加离子霉素(ionomycing);和不同浓度的免疫刺激化合物。
具体实施方案术语“免疫刺激剂组合物”在本文中广义地定义为能够在接种了该制品的哺乳动物中激发免疫应答的可施用形式的任何类型的生物剂。本文中使用的术语“纯化的”，当其涉及LPS时，表示所述LPS已经过分级或纯化过程(例如但不限于上文中公开的那些过程)，以除去各种其他成分，并且所述组合物基本保持其所表现的生物活性。在使用术语“基本纯化的”时，该术语是指这样的组合物，其中LPS形成所述组合物的主要非溶剂组分。例如，“基本纯化的LPS”表示溶液或组合物中超过约50 %、约60 %、约70 %、约80 %、约90 %、约95 %的非溶剂组分是本发明的LPS。根据本发明的一个优选的实施方案，所述免疫刺激剂组合物包含基本纯化形式的中间苍白杆菌菌株LMG3306的LPS，其中非溶剂组分未被超过O. 2%的其他化合物(DNA、RNA、蛋白质、葡聚糖、脂质……)所污染。“免疫学有效量”是指在哺乳动物中免疫原性足以诱导可检测的细胞或体液免疫应答的量。本文中使用的“保护性免疫应答”是指阻止或延缓特异性病原体所引起的感染或疾病的细胞或体液免疫应答。可使用基于赋形剂、pH和浓度的常规制备技术来制备本发明的化合物。根据本发明的一个实施方案，按照以下步骤从中间苍白杆菌LMG3306中提取脂多糖a)将中间苍白杆菌LMG3306的灭活培养物离心；b)将所获得的沉淀物重悬在盐水悬浮液中；c)用纯水和聚乙二醇透析；d)用四体积的甲醇和I %的醋酸钠饱和甲醇沉淀；e)冷冻干燥以获得粗制LPS。根据一个优选的实施方案，一旦所述粗制LPS已被冰冻干燥，就按照以下步骤对其进行纯化I.在缓冲液(IOmM Tris-HCI pH 7.5)中溶解粗制LPS，任选地以超声辅助；
2.添加蛋白酶K并在室温下孵育；3.通过超速离心收集纯化的LPS4.冷冻干燥该样品。如下的流程图中显示了对本发明的免疫刺激化合物之生产方法的优选实施方案的更详细描述中间苍白杆菌LMG 3306 LP提取方法的流程图
中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium )
LMG 3 3 06培养物(静止期)_
甲 0.4% vA
ψ
连续离心
ι_ /Xr^
I提取物上清液除去
I
\
重悬(200g/l于 15mM的NaCl中)
I
Ψ
权利要求
1.一种来自中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)LMG3306的脂多糖,其能在哺乳动物中激发免疫应答，用于治疗和/或预防败血症。
2.用于制备权利要求I的脂多糖的方法，其包括用胰酪胨大豆肉汤培养来自中间苍白杆菌菌株LMG 3306的细菌
3.根据权利要求2的方法，还包括按以下步骤提取所述脂多糖 a)将中间苍白杆菌LMG3306的灭活培养物离心； b)将所获得的沉淀物重悬在盐水悬浮液中； c)用纯水和聚乙二醇透析； d)用四体积的甲醇和I%的醋酸钠饱和甲醇沉淀；和 e)冷冻干燥以获得粗制LPS。
4.根据权利要求2的方法，还包括按以下步骤纯化粗制LPS a)在缓冲液(IOmMTris-HCI pH 7.5)中溶解粗制LPS，任选地以超声辅助； b)添加蛋白酶K并在室温下孵育； c)通过超速离心收集纯化的LPS;和 d)冷冻干燥该样品。
5.一种免疫刺激剂组合物，其包含权利要求I的来自中间苍白杆菌LMG3306的脂多糖和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂。
6.根据权利要求5的组合物，其特征在于，其包含化学纯的中间苍白杆菌LMG3306的LPS，其中非溶剂组分未被超过0. 2%的其他化合物所污染。
7.根据权利要求5 6中任一项的组合物，其特征在于，其包含0.5 120 u g/ml的来自中间苍白杆菌菌株LMG3306的LPS。
8.根据权利要求5 7中任一项的组合物，其中所述脂多糖处于均匀的悬浮液中，其中胶束相在4°C下稳定超过I年。
9.根据权利要求5 8中任一项的组合物，其中所述组合物的pH在2 12之间。
10.根据权利要求5 9中任一项的组合物在制备用于调节哺乳动物免疫应答的药物中的用途。
11.根据权利要求10的用途，其中所述调节包括在所述哺乳动物中增强免疫活性。
12.根据权利要求11的用途，其中所述免疫应答调节在于诱导巨噬细胞分化、产生TNF、产生IL-12、脾淋巴细胞产生IFN- Y和/或刺激病毒特异性的⑶8和⑶4T细胞。
13.根据权利要求11的用途，其中所述调节包括在所述对象中抑制促炎细胞因子的产生。
14.权利要求13的用途，其中所述促炎细胞因子为IL-12。
15.根据权利要求5 9中任一项的组合物作为疫苗佐剂用于改进对抗所述疫苗中所含有的特异性病毒和/或细菌之免疫的用途。
16.根据权利要求5 9中任一项的组合物在制备用于治疗和/或预防败血症的药物中的用途。
17.根据权利要求5 9中任一项的组合物在制备用于治疗和/或预防内毒素血症的药物中的用途。
18.根据权利要求5 9中任一项的组合物在制备用于治疗和/或预防感染性疾病的药物中的用途。
19.根据权利要求18的组合物在制备用于在免疫抑制的动物中治疗和/或预防感染的药物中的用途。
20.根据权利要求18 19中任一项的组合物作为用于对抗利什曼原虫感染之疫苗佐剂的用途。
21.根据权利要求20的组合物作为用于对抗利什曼原虫皮肤感染之疫苗佐剂的用途。
全文摘要
本发明涉及从中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)菌株LMG3306中分离、纯化和表征脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，以及其作为哺乳动物免疫刺激剂的用途、制备用于治疗和/预防败血症的药物化合物的方法和用于免疫抑制动物和对抗利士曼原虫(Leishmania)的疫苗的佐剂。
文档编号A61K31/739GK102802639SQ200980160301
公开日2012年11月28日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年6月4日
发明者胡安·伊格纳西奥·奥韦赫罗吉萨索拉, 曼努埃尔·弗雷斯诺埃斯库德罗 申请人:奥韦赫罗实验室公司