专利名称：人苍白杆菌及其在降解植物秸秆或重要酶的制备中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)，以及所述菌种在降解植物秸秆或重要酶的制备中的应用。
背景技术：
植物纤维，作为一类大量存在的天然纤维质的重要资源，它的再生利用研究受到了广泛的关注。由于利用物理或化学方法处理甘蔗渣都存在许多缺点，于是许多专家将目光聚焦到了微生物处理上。尽管可以利用纤维素和半纤维素的微生物比较多，并且有很多微生物也可利用木质素，但相对来说都有一定的困难。如瑞氏木霉专利公开的菌种和绿色木霉文献报道的菌种，其所存在的一个显著缺陷是秸秆之所以很难在常规条件下降解，主要是因为秸秆中纤维素、半纤维素与木质素的结合方式木质素与半纤维素经共价键形式结合，将纤维素分子包埋在中间，使降解纤维素的酶不易与纤维素分子接触。木质素的水不溶性、复杂的化学结构，也给降解带来了很大困难。所以，要彻底降解纤维素，必须首先运用微生物解决木质素的降解问题。降解木质素的微生物种类在自然界中，能降解木质素并产生相应酶类的微生物只占少数。木质素的完全降解通常是真菌、细菌及相应微生物群落共同作用的结果，其中真菌起着主要作用。降解木质素的真菌主要有白腐真菌(使木材呈白色腐朽)、褐腐真菌(使木材呈褐色腐朽)和软腐菌，前两者属担子菌纲，而软腐菌属半知菌类。白腐真菌降解木质素的能力优于其降解纤维素的能力。
植物纤维，如甘蔗渣是制糖工业的主要副产品，是甘蔗机械压制后所剩的主要部分，属于农业固体废弃物中的一种，它的成分主要有纤维素、半纤维素和木质素，与木质材料差不多，可以作为替代部分木材的原料。因此，选择一种菌种，使其能够有效的降解植物纤维，达到再生利用的目的，是有关方面十分关注的课题。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种人苍白杆菌及其在降解植物秸秆或重要酶的制备中的应用，以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明的人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)是从华东理工大学校园内的法国梧桐树上的腐烂木块中通过如下的方法筛选获得的取样(腐烂木块-来在二球悬铃木)——摇瓶培养——涂平板(M9+甘蔗渣+琼脂)——摇瓶(M9+甘蔗渣)——涂平板分离——人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)。
所获得菌种在2006年5月10日，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 206046 Ochrobactrum anthropi IBL01。
本发明的菌种具有如下的特性1.形态特征(1)细胞的形态和大小短杆状，2.0～2.5×0.65～0.75μm；(2)孢子的形成无；(3)革兰氏染色性阴性。
2.在各种培养基上的生长状态(1)LB琼脂平板培养(30℃，48小时)菌落形状圆形(Circular)；菌落成粘液状扁平状(Flat)，平滑(Smooth)大小4～6mm；
色调浅黄色。
(2)修饰后的M9+甘蔗渣+琼脂平板培养(30℃，96小时)菌落形状圆形(Circular)；菌落成粘液状扁平状(Flat)，平滑(Smooth)大小1.5～2mm；色调乳白色。
3.生理生化特征(1)葡萄糖同化试验阳性(2)阿拉伯糖同化试验阳性(3)甘露糖同化试验阳性(4)甘露醇同化试验阳性(5)乙酰基葡萄糖氨同化试验阳性(6)麦芽糖同化试验阳性(7)苹果酸同化试验阳性(8)柠檬酸三钠同化试验阳性(9)羊蜡酸同化试验阳性(10)氧化酶阳性(11)尿素试验阳性(12)硝酸盐阴性(13)色氨酸阴性(14)氨基胍基戊酸阴性(15)枸橼酸盐阴性
(16)明胶阴性(17)葡萄糖酸钾同化试验阴性(18)脂肪酸同化试验阴性(19)苯乙酸同化试验阴性(20)4-硝基苯基-βD-葡萄糖酸试验阴性根据文献段永翔。API鉴定系统及其在细菌学检验中的应用，ModernPreventive Medicine，2004，Vol.31，No.5，提供的API 20 NE鉴定系统鉴定方法和上述的试验结果表明，本发明的菌种属于人苍白杆菌类群，但又与原人苍白杆菌有明显的不同，其主要不同之处在于原种基本都是医院从病人体内获得，而且它主要是极易造成医疗用具的污染，导致感染的发生，该菌主要感染创伤、器官移植、插入性操作以及使用抗肿瘤药物和免疫抑制剂的患者，并没有发现它在秸秆降解方面的作用。
其生理生化特性如下极易造成医疗用具的污染，导致感染的发生，该菌主要感染创伤、器官移植、插入性操作以及使用抗肿瘤药物和免疫抑制剂的患者。另外国外有文章报道它具有产乙内酰脲酶的能力，还可以分裂头孢菌素；本发明的人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)可以利用蔗糖、葡萄糖、果糖、滤纸、乙基纤维素、木糖、半乳糖、淀粉、甘油、琼脂等作为唯一碳源生长，但是它不能利用乳糖、甘氨酸、醋酸钠作为唯一碳源生长。
采用本发明的人苍白杆菌Ochrobactrum anthropi(保藏号CCTCC M206046 Ochrobactrum anthropi IBL01)降解植物秸秆或秸秆渣的方法包括如下步骤将人苍白杆菌(保藏号CCTCC M 206046 Ochrobactrum anthropiIBL01)单菌落接种到M9培养基与秸秆或秸秆渣的混合物的种子培养基中，种子培养基的pH为6.5～7.5，30～37℃、180～220rmp的条件下在摇瓶中培养2～6天，然后将种子培养物接种到M9培养基与秸秆或秸秆渣的混合物的发酵培养基中，发酵条件与种子培养相同，培养时间为4～6天，后细胞数可达1.4*109；种子培养基和发酵培养基中，秸秆或秸秆渣的含量为4～6g/L；基于1L发酵培养基的体积，种子培养物接种量为0.2～0.8ml；所说的秸秆包括玉米秆、麦秆、稻草、或高粱秆等，所说的秸秆渣包括甘蔗渣、玉米秆渣、或木屑；所说的M9培养基在组分和含量在文献Amira A.EI-Gammal，Zeinatkamel and Zenat Adeeb.Biodegradation of lignocellulosic substances andproduction of sugars and lignin degradation intermediates by four selectedmicrobial strains.Polymer Degradation n and Stability 61(1998)535-542.中已经有公开的报道，本发明的种子培养基和发酵培养基的重量百分比配方如下(1)液体培养基Na2HPO40.6％、KH2PO40.3％、NH4Cl 0.1％、NaCl0.05％、甘蔗渣0.5％，余量为蒸馏水。
(2)固体培养基Na2HPO40.6％、KH2PO40.3％、NH4Cl 0.1％、NaCl0.05％、甘蔗渣0.5％，琼脂1.5～2.0％，余量为蒸馏水。
按照本发明优选的方案，秸秆或秸秆渣先经过酸处理，在重量浓度10～20％的盐酸中，浸渍处理3小时，然后65～75℃烘干，粉碎，过筛。
人苍白杆菌产生纤维素酶应用滤纸法可以测得，人苍白杆菌产生木质素过氧化物酶Lip可参考如下方法测得0.2mol/L酒石酸缓冲液(pH3.0)1.5mL，15mmol/L藜芦醇1.0mL，粗酶液0.4mL，15mmol/L H2O20.1mL启动反应，25℃水浴3min，于310nm测其光密度，以1.0mL缓冲液代替藜芦醇作空白对照，定义每分钟使1μmol的藜芦醇氧化成藜芦醛所需的酶量为一个酶活力单位(U)。人苍白杆菌产生锰过氧化物酶Mnp可参考如下方法测得0.11mol/L乳酸钠缓冲液(pH4.5)3.4mL，40mmol/LMnSO40.1mL，粗酶液0.4mL，1.6mmol/L H2O20.1ml，启动反应，25℃水浴5min，于240nm测其光密度，以0.1ml缓冲液代替MnSO4作空白对照，定义每分钟氧化1μmol Mn2+成为Mn3+，所需的酶量为一个酶活力单位(u)。
人苍白杆菌中纤维素酶、木聚糖酶、木质素过氧化物酶、漆酶以及锰过氧化物酶粗酶的分离及制备的大致过程为人苍白杆菌发酵液超声破碎后离心得到上清液，上清液用饱和的硫酸铵沉淀的蛋白，将蛋白复性后过Bio-Gel P30凝胶柱过滤分离，然后将穿出的不同峰及洗脱的不同峰再分别过DEAE.Sephadex A50阴离子交换柱、CM.Sephadex A50阳离子交换柱、Sephadex G-25层析柱等不同的离子柱，最后经过透析、浓缩和干燥便可以得到纤维素酶、木聚糖酶、木质素过氧化物酶、漆酶以及锰过氧化物酶的粗酶制剂。
由上述公开的技术方案可见，本发明的菌种和采用本发明的菌种降解植物秸秆或秸秆渣，具有十分显著的降解效果，目前用来降解纤维素或木质素的微生物主要是霉菌或白腐菌、褐腐菌等真菌，而且这些菌体用来降解甘蔗渣的培养周期较长达约15天左右；我们筛得的人苍白杆菌是细菌，它的生长周期比较短大约一周左右，并且该人苍白杆菌不但可以产生降解纤维的酶类而且还可以产生降解半纤维素的酶类和降解木质素的酶类。
图1为人苍白杆菌在M9+甘蔗渣(5g/L)中的生长曲线图。
图2为菌体降解纤维素的效果图。
具体实施例方式
实施例1
人苍白杆菌的发酵试验从平板上挑取人苍白杆菌单菌落接种到M9+甘蔗渣(5g/L)的种子培养基中，种子培养基的pH为6.7，装液量为50ml/250ml摇瓶，30℃、200rmp的条件下在摇瓶中培养四天细胞数数可达8.0*109左右。取0.5ml接种到M9+甘蔗渣(5g/L)的发酵培养基中，发酵条件于种子相同，培养五天后细胞数可达1.4*1010。经测定我们制备的甘蔗渣中含有的淀粉、粗蛋白、可溶性糖和糖醛酸的总量为102mg/g，这些可供菌体生长的小分子物质仅仅可以供菌体上到109左右，由此可见菌体还利用了木质纤维素等大分子物质。此外我们已经测的菌体可以产生纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶。
种子培养基重量组分如下Na2HPO40.6％、KH2PO40.3％、NH4Cl 0.1％、NaCl 0.05％、甘蔗渣0.5％、余量为蒸馏水。
发酵培养基的重量组分和含量如下Na2HPO40.6％、KH2PO40.3％、NH4Cl 0.1％、NaCl 0.05％、甘蔗渣0.5％、余量为蒸馏水。
采用滤纸法进行检验，发酵培养物中，人苍白杆菌产生纤维素酶的含量为2000U/L，人苍白杆菌产生木质素过氧化物酶Lip的含量为1000U/L，其降解效果较明显。
实施例2～4人苍白杆菌在以煮沸处理、酸处理或碱处理的甘蔗渣为唯一碳源的“修饰的M9培养基“中的生长情况的比较试验甘蔗渣1甘蔗渣——煮沸30min(水体积∶甘蔗渣＝2∶1)连续煮沸三次——65℃烘干——粉碎——过40目筛。
甘蔗渣2甘蔗渣——重量浓度20％的盐酸中，浸渍处理3小时——70℃烘干——粉碎——过40目筛。
甘蔗渣3甘蔗渣——重量浓度2％NaOH中，浸渍处理2小时——70℃烘干——粉碎——过40目筛。
分别以甘蔗渣1、2、3为唯一碳源的“修饰的M9培养基“为发酵培养基，发酵条件同例1。
培养1天、2天、4天、6天后分别计数得出如下结论 用血球计数板计数可见甘蔗渣经过酸处理比碱处理更有利于人苍白杆菌的利用。
实施例5纤维素酶定性试验固体培养基Na2HPO40.6％、KH2PO40.3％、NH4Cl 0.1％、NaCl0.05％、羧甲基纤维素钠1％、琼脂2％、余量为蒸馏水。
种子培养基Na2HPO40.6％、KH2PO40.3％、NH4Cl 0.1％、NaCl0.05％、甘蔗渣0.5％、余量为蒸馏水。
种子发酵条件同实施例1相同。种子发酵两天后取种子液0.1ml稀释适当的梯度后涂平板，平板放置到37℃的培养箱培养一周后菌落约1.5mm，向平板中加入0.1％的刚果红染色半小时候用1当量的NaCl脱色1.分钟结果见图2，出现明显的透明圈，因为刚果红可以与羧甲基纤维素结合所以平板显红色，如果菌体可以降解纤维素那么菌体周围就会出现透明圈。
实施例6
种子培养条件及发酵培养条件同实施例1。
纤维素酶的制备取发酵液20ml超声破碎1小时，5000r/min离心10min取上清液加入65％饱和硫酸铵沉淀蛋白，5000r/min离心10min.沉淀蛋白复性后过Bio-Gel P30凝胶柱，根据分子量的差异得到几种蛋白组分，据纤维素酶的分子量取其中一种组分过DEAE.Sephadex A50阴离子交换柱后再经过透析、浓缩和干燥便得到1.2～1.3mg纤维素酶的粗酶制剂。
木聚糖酶的制备发酵液处理同上，取过Bio-Gel P30凝胶柱后的另一种蛋白组分分别过DEAE.Sephadex A50阴离子交换柱、CM.Sephadex A50阳离子交换柱后再经过透析、浓缩和干燥便得到1.5～1.7mg木聚糖酶的粗酶制剂。
木质素酶的制备条件同上，分别过Bio-Gel P30凝胶柱、DEAE.Sephadex A50阴离子交换柱、CM.Sephadex A50阳离子交换柱和G-25为Sephadex G-25层析柱，最后的2.0～2.3mg木质素酶的粗酶制剂。
权利要求
1.一种人苍白杆菌(Ochrobactrum anthrop)CCTCC M 206046Ochrobactrum anthropi IBL01。
2.采用权利要求1中所述的人苍白杆菌(Ochrobactrum anthrop)CCTCCM 206046 Ochrobactrum anthropi IBL01可用于生产具有高活性的纤维素酶、木质素酶和半纤维素酶。
3.从人苍白杆菌中分离提取纤维素酶、木聚糖酶、木质素过氧化物酶、漆酶以及锰过氧化物酶等粗酶的方法。
4.采用人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)CCTCC M 206046Ochrobactrum anthropi IBL01降解植物植物秸秆的方法，其特征在于，包括如下步骤将人苍白杆菌CCTCC M 206046 Ochrobactrum anthropi IBL01单菌落接种到M9培养基与秸秆或秸秆渣的混合物的种子培养基中培养，然后将种子培养物接种到M9培养基与秸秆或秸秆渣的混合物的发酵培养基中培养。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，种子培养基和发酵培养基的pH为6.5～7.5。
6根据权利要求2所述的方法，其特征在于，种子培养基和发酵培养基中，秸秆或秸秆渣的含量为4～6g/L。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所说的秸秆包括玉米秆、麦秆、稻草或高粱秆，所说的秸秆渣包括甘蔗渣、玉米秆渣、或木屑等。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，基于1L发酵培养基的体积，种子培养物接种量为0.2～0.8ml。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，秸秆或秸秆渣先在重量浓度10～20％的盐酸中，浸渍处理3小时，然后65～75℃烘干，粉碎，过筛。
全文摘要
本发明公开了一种人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)CCTCC M206046 Ochrobactrum anthropi IBL01及其在降解植物秸秆方面的应用。本发明的菌种和采用本发明的菌种降解植物秸秆或秸秆渣，具有十分显著的降解效果，同时可生产高活性的纤维素酶、木质素酶和半纤维素酶。本发明还公开了人苍白杆菌中纤维素酶、木聚糖酶、木质素过氧化物酶、漆酶以及锰过氧化物酶的粗酶制备方法。本发明筛得的人苍白杆菌是细菌，它的生长周期比较短大约一周左右，并且该人苍白杆菌不但可以产生降解纤维的酶类而且还可以产生降解半纤维素的酶类和降解木质素的酶类。
文档编号C12N9/42GK1932005SQ20061002714
公开日2007年3月21日 申请日期2006年5月31日 优先权日2006年5月31日
发明者童望宇, 魏东芝, 刘晓玲 申请人:华东理工大学