土壤降解菌及其组合对耕地胡敏酸降解的实验方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种土壤胡敏酸降解特征的实验方法，具体地说，涉及一种土壤降解 菌及其组合对耕地胡敏酸降解的实验方法。
【背景技术】
[0002] 胡敏酸（humicacid，HA)是土壤腐殖酸中分子量中等，结构较复杂，化学及生物学 性质较活跃的组分。HA与土壤微生物的关系密切，其结构中所含有的脂肪C、小分子碳水化 合物、芳香环支链中的C、N均能够充当C、N源以供微生物代谢。以往有关降解菌与HA相互 关系的研宄主要集中在HA降解菌分离鉴定方面。本研宄自五种植被类型（农田、油松、刺 槐、沙棘、混交林）土壤分离5株HA降解菌，进一步选取B.licheniformis、M.resistens、 S.maltophilia3株降解菌，探讨这3株菌及其组合对耕地HA的降解程度。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种土壤降解菌及其组合对耕 地胡敏酸降解的实验方法，首先，以耕地土壤HA作为培养基唯一C、N源，而以往的研宄所用 培养基往往选用单一物质补充C源（葡萄糖）及N源（酵母浸出粉、酒石酸铵、順4勵3等）。 第二，对3株土壤HA降解菌进行了单菌落及不同组合处理，结合红外光谱研宄了降解菌对 HA中C的降解程度及结构特征的影响。以期为耕地HA降解过程中结构特征变化及有机碳 固定提供依据。
[0004] 其具体技术方案为：
[0005] -种土壤降解菌及其组合对耕地胡敏酸降解的实验方法，包括如下步骤：
[0006] (1)呼吸量碳测定：将90mm培养皿组合，连接处使用阿拉伯胶封口，外层粘贴封口 膜以保证气密性，HA固体培养基粘附在顶部，以1.Omol?I71的NaOH10.OmL收集降解菌呼 吸所释放的C02，每24h用0. 5mol?L-1的HC1滴定一次，HC1具体浓度用Na2B407 ? 10H20标 定，于28°C培养14d，滴定过程中为培养基补充3min无菌空气，该时间内所损失的0)2量通 过30min的C02吸收量换算；
[0007] (2)培养结束后选取一个典型重复，将所有菌落挑出，之后使用NaOH与Na4P207混 合浸提剂进行HA二次提取，NaOH及Na4P207&度均为0.lmol*L―1，首先使用40mL浸提剂缓 慢冲洗HA固体培养基，边冲洗边以0. 45ym微孔滤膜过滤，该过程持续4h，之后使用100mL 混合浸提剂分5次浸泡HA固体培养基，第4次时培养基已经透明，此时浸提工作已经基本 完成，浸泡时间均为24h，所有浸提溶液均转移至150mL容量瓶用于测定红外光谱。
[0008] 进一步，呼吸量碳指降解菌通过呼吸作用消耗的C量。按照下式计算：
[0009] RC= (2V「VV〇)WX6
[0010] 式中：VpVyV。分别表示空白、3minC02损失量、处理滴定所消耗HC1体积mL;W为 HC1浓度mol?L4#为转换系数；
[0011] 微生物生物量碳指降解菌机体的C量，采用熏蒸培养法测定，以皿为单位换算，按 下式计算：
[0012]MBC= (MrM〇)/k
[0013] 式中：MpM。分别代表熏蒸及未熏蒸培养基释放的C0 2量mg?皿是常数，取 0. 411〇
[0014] 实验结果使用Excel2013、SAS8. 1完成数据处理及方差分析，红外光谱吸收峰 面积使用OPUS6. 5软件计算。
[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0016] 1)3号菌的生长状况最好，在129~226CFU?皿―1之间，说明3号菌对HA有很强 的适应能力。各组合处理中1号菌长势稳定，落差较小，2号菌在组合处理中长势最差，尤以 在T12与T123中明显，所占比重仅为总菌落数的25. 00%与1.94%。组合处理中各菌落之 间无相互覆盖现象，说明不同菌落之间可共存。
[0017] 2)各处理呼吸量碳均存在显著差异（P< 0.05)，表现为组合处理大于单菌落处 理，T1的呼吸量碳较T2与T3高出105. 69%及26. 87%，说明1号菌的呼吸能力较强。T3、 T1及T13的MBC明显高于其他处理（P< 0. 05)，T2的MBC最低，仅为T3的26. 61 %，可见 1、 3号菌的固碳能力较强，2号菌固碳能力较弱。T23与T13总降解率明显高于其他处理（P< 0? 05)，分别为 59. 78%及 56. 71%，T123、T12、T3 及T1 总降解率在 42. 68%~50. 91% 之间，T2仅为21. 73%。
[0018] 3)培养结束HA红外光谱显示，各处理多糖类及醇类物质增加，尤其以T12、T123增 幅明显。含1号菌的各处理对芳香碳有较强的降解能力，使得HA结构趋于简单，腐殖化程 度降低。2号菌的1151/1637、（1045+1075)/1637及1357/1637三处吸收峰强度区域比值 均高于降解前水平，但是增幅低于其他处理。
【附图说明】
[0019]图 1 是扫描电镜图，图la为B.licheniformis，图lb为M.resistens，图lc为 S.maltophilia；
[0020] 图2是降解菌菌落数随时间变化图；
[0021] 图3是呼吸量碳随时间变化趋势图；
[0022] 图4是降解结束后HA红外光谱。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0024] 1材料与方法
[0025]1. 1土样采集
[0026] 供试土样来自陕西永寿县马莲滩林场，按照典型性和恢复阶段相近的原则，于5 种植被类型（农田、油松、刺槐、沙棘、混交林）表层〇 -l〇cm土壤中各取3个土样。将土样 分2部分处理，一部分于室内风干，过2mm筛制备HA。另一部分于4°C冷藏，待用时室温培 养24h，过2mm筛制备土壤菌悬液。
[0027] 1. 2 土壤HA降解菌的分离与鉴定
[0028] 按照文启孝所用方法提取土壤HA，利用各植被类型土壤所提取HA为唯一C、N源 制作培养基，具体成分包括：拟0.2300左右8、恥(：10.258、4 8&1'1.0(^、(11120 50.01111，调 节pH为7. 3。0.IMPa蒸汽灭菌30min后无菌操作转移至90mm培养皿，每皿15.OmL。研宄 所用HA培养基含碳量均为28. 34mg。称10. 00g土样于250mL三角瓶，加入100.OmL无菌 蒸馏水，摇床震荡30min后，吸取100uL上清液均匀涂于上述HA固体培养基，培养14d，期 间测定了降解菌对HA的降解率（表1)。待菌落明显后分离菌种，经作者之前的研宄，共得 到Bacilluslicheniformis(99. 65%)、Rhizobiumnepotum(99. 78%)、Microbacterium resistens(98. 71 %)、Stenotrophomonasmaltophilia(99. 23 %)、Streptomyces azureus(99. 78% ) 5 株降解菌。
[0029] 1.3实验用菌选择
[0030] 实验中以选用的菌种菌落数之和占总体的比重较大、长势较好为标准（表1)，选 取B.licheniformis、M.resistens及S.maltophilia3 株降解菌，分别编号 1 号、2 号、3 号 (图1)，设7处理Tl、T2、T3、T12、T13、T23、T123,进一步研宄这3株降解菌及其组合对耕 地HA中C的降解状况，为便于表达，将T1、T2、T3合称单菌落处理，1'12、1'13、123、1'123合 称为组合处理。耕地HA固体培养基组分同1. 2。0.IMPa蒸汽灭菌30min，稍冷却无菌操作 转移至90mm培养皿，每皿15.OmL，每个处理设4重复。耕地HA中含C为41. 08%，含N为 4. 32%〇
[0031] 用接种环自菌种1号、2号、3号纯化后菌落点取少量降解菌，转移至含有10.OmL 耕地HA液体培养基的灭菌小试管（HA液体培养基除无agar外，组份同前述），于37°C摇床 培养，每24h取15yL定容于150mL容量瓶，充分摇匀后，取100yL菌液均匀涂于HA固体 培养基。观察各降解菌在培养基中的菌落数（colonyformingunit，CFU)，数量以皿为单 位计数。待各降解菌菌落数稳定后（第5天，图2)，T1、T2、T3各取15. 0yL相应降解菌的 HA液体培养基定容于150mL容量瓶，充分摇勾，吸取100yL涂于HA固体培养基。T12取含 1号、2号降解菌的HA液体培养基各7. 5yL定容于150mL容量瓶，其余过程同T1 (T23、T13 同理），T123则各取5. 0yL，操作过程同上述。每皿HA含C为28. 34mg，菌液稀释倍数为 1X104 倍。
[0032] 表1供试菌种形态特征
[0033]
【主权项】
1. 土壤降解菌及其组合对耕地胡敏酸降解的实验方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 呼吸量碳测定：将90_培养皿组合，连接处使用阿拉伯胶封口，外层粘贴封口膜以 保证气密性，HA固体培养基粘附在顶部，以I.Omol?I71的NaOH10.OmL收集降解菌呼吸所 释放的CO2，每24h用0. 5mol?I/1的HCl滴定一次，HCl具体浓度用Na2B407 ?IOH2O标定， 于28°C培养14d，滴定过程中为培养基补充3min无菌空气，该时间内所损失的CO2量通过 30min的CO2吸收量换算； (2) 培养结束后选取一个典型重复，将所有菌落挑出，之后使用NaOH与Na4P2O/混合浸 提剂进行HA二次提取，NaOH及Na4P207&度均为0.Imol吨―1，首先使用40mL浸提剂缓慢冲 洗HA固体培养基，边冲洗边以0. 45ym微孔滤膜过滤，该过程持续4h，之后使用IOOmL混合 浸提剂分5次浸泡HA固体培养基，第4次时培养基已经透明，此时浸提工作已经基本完成， 浸泡时间均为24h，所有浸提溶液均转移至150mL容量瓶用于测定红外光谱。
2. 根据权利要求1所述的土壤降解菌及其组合对耕地胡敏酸降解的实验方法，其特征 在于，呼吸量碳指降解菌通过呼吸作用消耗的C量；按照下式计算： RC=(2Y,-Y2-Y0)^X6 式中：V1J2Jtl分别表示空白、3minCO2损失量、处理滴定所消耗HCl体积mL;W为HCl浓度mol 为转换系数； 微生物生物量碳指降解菌机体的C量，采用熏蒸培养法测定，以皿为单位换算，按下式 计算： MBC= (M1-M0)/k 式中：M1 Jtl分别代表熏蒸及未熏蒸培养基释放的CO2量mg?皿、k是常数，取0.411; 实验结果使用Excel2013、SAS8. 1完成数据处理及方差分析，红外光谱吸收峰面积 使用OPUS6. 5软件计算。
【专利摘要】本发明公开了土壤降解菌及其组合对耕地胡敏酸降解的实验方法，选取3株土壤胡敏酸降解菌，研究三者及其不同组合对耕地HA的降解程度及结构性质的影响。降解14天后，菌落数总量为T13＞T3＞T123＞T23＞T1＞T2＞T12，T1、T2的菌落数为T3的53.95％及26.98％，含1号菌的处理对芳香碳结构有较强的降解能力，HA培养基的腐殖化程度低于降解前，结构趋于简单，而2号菌这种能力。各处理脂类及含氮类物质较降解前分别增加了2.33-3.23倍及1.48-1.74倍，更说明了1号菌及其与3号菌的组合对于复杂有机碳的讲解能力和趋势。
【IPC分类】G01N21-3577
【公开号】CN104819951
【申请号】CN201510244441
【发明人】刘梦云, 付东磊, 石志华, 吴健利, 刘丽雯, 刘效栋, 虞亚楠
【申请人】西北农林科技大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月9日