专利名称：一种发酵生产2,3－丁二醇的方法
技术领域：
本发明涉及2，3-丁二醇的生产方法，特别涉及一种采用粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)发酵生产2，3-丁二醇的方法。
背景技术：
2，3-丁二醇(2，3-butanediol，简称BD，下同)广泛应用于化工、食品以及航空航天等各个领域。其热值27200kJ/kg，同乙醇(29100kJ/kg)接近，可用作燃料，还可用来制备聚合物、油墨、香水、防冻剂、香熏剂、增湿剂、炸药以及药物的手性载体等。
它脱水成甲乙酮，可用作树脂、油漆的溶剂；脱水成丁二烯，可用于合成橡胶；它还可以代替1，4-丁二醇，用于聚酯和聚亚安酯的合成；同甲乙酮缩合并进行加氢形成辛烷，可用来生产高级航空用油。2，3-丁二醇与乙酸反应生成2，3-丁二醇二乙酸酯，此酯类可加到奶油中改善风味；在我国2，3-丁二醇还被添到白酒中，以改善白酒的风味。
采用粘质沙雷氏菌发酵生产BD主要为meso-型。该种菌研究较少，产量不高，制约了产业化的进程，应用前景受到挑战。
发明人发现，培养基成分是影响2，3-丁二醇发酵水平的关键因素，原始的培养基配方为葡萄糖5％，麦芽糖提取物0.3％，酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，灭菌前pH 7.2-7.5。该配方不仅产量低，而且副产物较多。因此，急需对培养基成份进行优化。
发明人发现，发酵调控的好坏是影响2，3-丁二醇发酵水平的另一关键因素。由于2，3-丁二醇的发酵是属于微耗氧培养，过低的供氧会导致有毒副产物的产生，例如乙酸、乙醇，这样会减少生物量的形成，降低产量；但过量的氧会抑制产物形成过程中酶的活性。这就要求对发酵过程中氧的控制提出较高的要求，但是在微耗氧过程中，溶氧接近于0，这样就使得把溶氧作为参数来控制就显得极为不准确了。也有人曾采用氧传递速率作为控制参数，但是反应器的流体动力特性对于整个反应器氧的分配和利用有很大影响，反应器中不同位置的氧传递速率是不一致的。因此对于微耗氧培养，采用氧传递速率来控制同样也是不适合的。
因此，本领域迫切需要一种优化的培养基以及调控方法，以实现2，3-丁二醇的生产。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种发酵生产2，3-丁二醇的方法，以克服现有技术存在的发酵周期长和2，3-丁二醇的产量低以及转化率不高的缺陷。
本发明的构思是这样的通过静态优化，选择合适的培养基，从而促进细胞生长与糖耗速度，缩短了发酵周期，提高2，3-丁二醇的产量；在发酵时期的不同阶段，以细胞代谢流为控制点，采用合适的RQ值来控制菌体的代谢，使底物主要朝2，3-丁二醇产物生成途径转化。以克服不能有效了解菌体的需氧量，从而控制细胞的生长和代谢；通过在发酵过程中添加产物促进因子-乙酸钠来提高2，3-丁二醇的产量。
本发明的方法包括如下步骤(1)采用常规的方法培养粘质沙雷氏菌，优选的培养时间为9～15小时，培养温度为25℃～35℃，培养基其组分包括碳源、氮源、磷源和无机盐，优选的组分和重量含量包括葡萄糖0～3％；酵母粉0～1％；蛋白胨0～2％；(NH4)2SO40～2％；K2HPO40～3％；NaCl 0～2％；MgSO4，0～1％本发明中的所选粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)是由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供的，编号为粘质沙雷氏菌CICC10187；(2)将步骤(1)的粘质沙雷氏菌种子液基于培养基体积的5～7％(体积比)的接种量接种于培养基中，通入空气，搅拌，RQ控制在0.9～1.2之间，在25～35℃下发酵培养3-6小时，OD600值为5-11之间；RQ可以通过通入的空气流量，搅拌速度进行控制，优选的空气流量为20～120m3/hm3培养基，搅拌速度为100～500rpm；然后补入产物促进因子-乙酸钠，流速为(0.1g～15g)/hm3培养基，补充蔗糖水溶液使得RQ控制在1.5～1.8之间，在25～35℃下发酵培养15-18小时，OD600值为25-30之间；RQ通过通入的空气流量、搅拌速度、蔗糖水溶液和氨基酸粉水溶液补料量进行控制，优选的空气流量为100～150m3/hm3培养基，搅拌速度为300～800rpm，蔗糖水溶液补料量使培养基中的蔗糖的浓度维持在0～20g/L，蔗糖水溶液的浓度为(0.1～1g)/ml；当菌体比生长速率＜0.03时补入氨基酸粉水溶液，流速为(1g～10g)/hm3培养基，氨基酸粉水溶液的浓度为(0.1～0.8g)/ml，当OD600大于25～30时停止补入。
最后将RQ控制在1.9～2.2之间，在25～35℃下发酵培养12-20小时，OD600值为28-35之间，即获得含有2，3-丁二醇的发酵培养液，2，3-丁二醇产量达到107g/L以上，转化率达0.45g/g suc以上，生产能力为2.91g/L·h以上。RQ可以通过通入的空气流量、搅拌速度和蔗糖水溶液补料量进行控制，优选的空气流量为20～150m3/hm3培养基，搅拌速度为200～800rpm，蔗糖水溶液补料量使培养基中的蔗糖的浓度维持在0～20g/L，蔗糖水溶液的浓度为(0.1～1g)/ml；此过程中无需补充氨基酸水溶液。
pH值在发酵过程中用NaOH和H2SO4控制为5.5-6.5；“RQ”的规范的技术名称是呼吸商，指的是在一定时间内机体呼出的CO2的量与吸入的O2量的比值(CO2/O2)，在生物化学书中有详细的定义；“OD600”的规范的技术名称是菌体细胞密度，指的是由于微生物的生长引起培养物混浊度的增高，因此通过紫外分光光度计测定在600nm波长下的吸光值，判断微生物的生长状况，在微生物学书中有详细的定义；发酵培养基的组分和重量含量为蔗糖1～10％，蛋白胨0.5～2％，酵母粉0.1～0.5％，柠檬酸0.3～1.5％，MnSO40.002～0.01％，KH2PO40.01％～0.1％，FeSO4·7H2O 0.001～0.01％，MgSO40.01～0.1％，以及余量的水；优选的为蔗糖9％蛋白胨 2％酵母粉 0.5％柠檬酸 1％MnSO40.007％NaH2PO40.05％FeSO40.002％MgSO40.05％本发明采用的培养基是将正交实验和《实验设计与分析》书中公开的ResponseSurface Methodology方法相结合后所筛选的，包括如下步骤
首先采用单因素试验，考察碳源、柠檬酸对发酵水平的影响，然后根据正交实验，筛选出影响发酵水平的三个关键因素柠檬酸、MnSO4和酵母粉，最后是用ResponseSurface Methodology的方法，优化柠檬酸、MnSO4和酵母粉的最适培养浓度；本发明首次发现柠檬酸能促进细胞生长与糖耗速度，缩短发酵周期，提高2，3-丁二醇的产量。
与现有技术相比，本发明的方法的有益效果为采用单因子实验、正交实验、响应面实验相结合的静态优化方法，优化了培养基，并首次发现柠檬酸能促进细胞生长与糖耗速度，缩短了发酵周期，提高2，3-丁二醇的产量；在发酵过程中，采用呼吸商RQ来调控生产2，3-丁二醇的方法。由于呼吸商RQ是反映发酵系统中微生物细胞生理特性情况的参数，综合反映了菌体细胞对有关营养基质代谢情况的信息，RQ＝CER/OUR。在营养基质充足的条件下，在无氧条件下(1)；在有氧条件下(2)；结合电子传递系统(3)；结合(1)，(3)RQ＝1/(1/2)＝2，结合(2)，(3)RQ＝2/(1/2+1/2)＝2，发现无论在何种氧条件下，RQ值为2，但根据相关文献我们知道在无氧条件下，产乙醇量较多，其RQ值为4，在有氧条件下产有机酸较多，对于产物生成途径中的酶也有抑制作用，这就使我们需要把RQ值控制在2左右，来调控氧的供应。使用本方法不仅把发酵过程控制在微耗氧的培养条件下，又使得碳源朝2，3-丁二醇产物生成途径转化。在营养物质缺乏的情况下，RQ值会发生下降，本发明也依此来控制补料；采用了不同发酵阶段不同的RQ值来调控生产2，3-丁二醇的方法。增加细胞量能提高2，3-丁二醇的产量，但它们之间又有一个最佳平衡点。通过分阶段控制RQ，使第一阶段，以菌体生长为主；第二阶段，以菌体生长和产物生成相结合的生产模式；第三阶段，以产物生成为主。通过分阶段调控，使得2，3-丁二醇产量获得大幅提高；采用了产物促进因子-乙酸钠来提高2，3-丁二醇产量。和以往报道不同的是在粘质沙雷氏菌培养过程中，乙酸钠的加入如果没有较好的调控手段不仅大幅度降低2，3-丁二醇产量的产量，而且会抑制菌体生长。通过在第二阶段缓慢补入就能克服这一不利因素，加快乙酸钠的代谢，大幅提高2，3-丁二醇产量，降低乳酸、乙酸等副产物的积累。
本发明的方法，可使2，3-丁二醇产量达到107g/L以上，转化率达0.45g/g suc以上，生产能力为2.91g/L·h以上，具有工业化推广应用的前景。
图1为各发酵阶段RQ值的变化图。
具体实施例方式
本发明中的所选粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)是由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供的，编号为粘质沙雷氏菌CICC10187；蛋白胨、酵母粉为OXOID公司产品，蔗糖为海棠牌食用糖，其他试剂为国产分析纯试剂。
下面通过实施例对本发明作进一步的说明，其目的是为了更好的理解本发明的内容，因此，所列举的实例并不限制本发明的保护范围。
实施例1以下均为重量百分比。
将酵母粉0.5％、蛋白胨2％、柠檬酸1％、MnSO40.007％、KH2PO40.05％、MgSO40.05％加800ml水溶解；称取FeSO4·7H2O 0.002％加20ml水溶解，加3ml浓度为1/4(v/v)的盐酸助溶，使溶液较澄清，用无菌过滤膜过滤；将上述培养基混合，用5mol/l的NaOH溶液调至7.20，加水至1L，灭菌；将灭好菌的蔗糖与上述已冷却好的培养基混合，获得浓度为9％的蔗糖，即获得发酵培养基。
实施例2(1)粘质沙雷氏菌的种子培养培养时间为12小时，培养温度为28℃，培养基的组分和重量含量为葡萄糖1％；酵母粉0.1％；蛋白胨0.2％；(NH4)2SO40.6％；K2HPO41％；NaCl 0.05％；MgSO40.05％；以NaOH调pH 7.2。
(2)发酵培养初始发酵培养基体积1.8L，采用的初始培养基组成如下蔗糖9％
蛋白胨2％酵母粉0.5％柠檬酸1％MnSO40.007％NaH2PO40.05％FeSO40.002％MgSO40.05％补料液各成分浓度为补料1蔗糖水溶液500g/600ml；补料2工业氨基酸粉水溶液40g/200ml；(在第二阶段加入)以5％(体积比)的接种量接入粘质沙雷氏菌种子液，30℃培养5小时至OD600为8，此阶段RQ值控制在1.05±0.05；然后开始补入产物促进因子-乙酸钠，流速为1.0g/h.m3培养基，转速逐步升为600rpm，空气流量逐步升为120m3/h.m3培养基，通过转速、气体流量，补入蔗糖水溶液的手段把RQ值控制在1.65±0.05，此阶段培养至18小时，此时OD600为32，培养温度为30℃；当菌体比生长速率＜0.03时补入氨基酸粉水溶液，当RQ值出现下降或者发酵液中灵菌红素的量出现增加，则降低流速，当OD600大于28.5±2.25时停止补入。
最后进入调控后期，用上述同样的手段把RQ值控制在2.025±0.075。将蔗糖控制在0～20g/L，此阶段培养至35小时，此时OD600为30，培养温度为30℃；pH值在发酵过程中用重量浓度为160g/L的NaOH水溶液或H2SO4水溶液控制为6；采用本发明使得2，3-丁二醇产量达到107g/L，转化率达0.45g/g suc，生产能力为2.91g/L·h。副产物乙醇为5g/L，乙酸为0.5g/L，乳酸为7g/L，其它副产物的量也较低。图1为各发酵阶段RQ值的变化图，箭头处表示开始流加乙酸钠。
实施例3使用原始培养基培养粘质沙雷氏菌生产2，3-丁二醇。
培养基成分葡萄糖5％，麦芽糖提取物0.3％，酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，灭菌前pH调至7.2。
以5％(体积比)的接种量接入粘质沙雷氏菌种子液，30℃摇床，200rpm培养，用NaOH和H2SO4控制培养过程pH为6.0。42小时后糖耗完，测得2，3-丁二醇产量为15g/L。
实施例4使用不加柠檬酸的培养基，培养粘质沙雷氏菌生产2，3-丁二醇。
培养基成分蔗糖，9％；蛋白胨，2％；酵母粉，0.5％；MnSO4，0.007％；KH2PO4，0.05％；FeSO4，0.002％；MgSO4，0.05％。
以5％(体积比)的接种量接入粘质沙雷氏菌种子液，30℃摇床，200rpm培养，用NaOH和H2SO4控制培养过程pH为6.0。48小时后糖耗完，测得2，3-丁二醇产量为35g/L。
实施例5采用传统发酵补料方法，目的是与例2进行对比，从而看出本发明所说的调控策略的优点。
初始发酵体积1.8L，采用的初始培养基组成如下蔗糖9％蛋白胨 2％酵母粉 0.5％柠檬酸 1％MnSO40.007％NaH2PO40.05％FeSO40.002％MgSO40.05％补料液各成分浓度为补料1500g/600ml蔗糖；补料240g/200ml工业氨基酸粉；首先，以5％(体积比)的接种量接入粘质沙雷氏菌种子液，30℃培养7小时至OD600为14。
然后进行补料，以补蔗糖为主(补料1)，控制发酵液中的蔗糖浓度不低于30g/L，保证蔗糖的水解速度不低于菌体代谢糖的速度。工业氨基酸粉在整个补料过程中采用恒速补料(补料2)，补料速率为12ml/h，补12小时结束。
整个发酵过程控制pH为6.0，发酵完毕后2，3-丁二醇产量为75g/L，转化率为0.37g/gsuc。
实施例6采用本发明的RQ分段调控策略，补入产物促进因子-乙酸钠，但在调控中期，乙酸钠是一次性加入，目的是与例2进行对比，从而看出本发明所说的在调控中期控制补料速度的重要性。
初始发酵体积1.8L，采用的初始培养基组成如下蔗糖9％蛋白胨 2％酵母粉 0.5％柠檬酸 1％MnSO40.007％NaH2PO40.05％FeSO40.002％MgSO40.05％补料液各成分浓度为补料1500g/600ml蔗糖；补料240g/200ml工业氨基酸粉；以5％(体积比)的接种量接入粘质沙雷氏菌种子液，30℃培养5小时至OD600为8，此阶段RQ值控制在1.05±0.05，然后进入调控中期一次性补入产物促进因子-乙酸钠，通过转速、气体流量，补入料液的手段把RQ值控制在1.65±0.05。此阶段培养至18小时至OD600为25。
最后进入调控后期，用上述同样的手段把RQ值控制在1.95±0.15。由于乙酸钠不能被有效代谢，菌体生长受到抑制，3-羟基-2-丁酮的量也获得较大积累，达到28g/L，该阶段调控时间缩短，后期糖几乎不代谢，2，3-丁二醇产量为60g/L。副产物乙酸为9g/L，乳酸为11g/L。
权利要求
1.一种发酵生产2，3-丁二醇的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)采用常规的方法培养粘质沙雷氏菌；(2.1)将步骤(1)的粘质沙雷氏菌种子液基于培养基体积的5～7％的接种量接种于培养基中，通入空气，搅拌，RQ控制在0.9～1.2之间，在25～35℃下发酵培养3-6小时；(2.2)然后补入产物促进因子—乙酸钠，流速为(0.1g～15g)/h·m3培养基，RQ控制在1.5～1.8之间，在25～35℃下发酵培养15-18小时；(2.3)最后将RQ控制在1.9～2.2之间，在25～35℃下发酵培养32-36小时，即获得含有2，3-丁二醇的发酵培养液；pH值在发酵过程中用NaOH和H2SO4控制为5.5-6.5。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2.1)中，空气流量为20～120m3/h·m3培养基，搅拌速度为100～500rpm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2.2)中，空气流量为100～150m3/h·m3培养基，搅拌速度为300～800rpm，蔗糖水溶液补料量使培养基中的蔗糖的浓度维持在0～20g/L。当菌体比生长速率＜0.03时补入氨基酸粉水溶液，当RQ值出现下降或者发酵液中灵菌红素的量出现增加，则降低流速，当OD600大于25～30时停止补入。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2.3)中，空气流量为20～150m3/h·m3培养基，搅拌速度为200～800rpm，蔗糖水溶液补料量使培养基中的蔗糖的浓度维持在0～20g/L，此阶段不补入氨基酸粉水溶液。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，发酵培养基的组分和重量含量为蔗糖1～10％，蛋白胨0.5～2％，酵母粉0.1～0.5％，柠檬酸0.3～1.5％，MnSO40.002～0.01％，KH2PO4 0.01％～0.1％，FeSO4·7H2O 0.001～0.01％，MgSO4 0.01～0.1％，以及余量的水。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，培养基的筛选包括如下步骤首先采用单因素试验，考察碳源、柠檬酸对发酵水平的影响。其次根据正交实验，筛选出影响发酵水平的三个关键因素柠檬酸、MnSO4和酵母粉。最后是用ResponseSurface Methodology的方法，优化柠檬酸、MnSO4和酵母粉的最适培养浓度。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，培养基制备方法包括如下步骤(1).将酵母粉、蛋白胨、柠檬酸、MnSO4、KH2PO4、MgSO4加水溶解；(2)称取FeSO4·7H2O加20ml水溶解，加3ml浓度为1/4(v/v)的盐酸助溶，使溶液较澄清，用无菌过滤膜过滤；(3)将步骤1和2的产物混合，用3～7mol/l的NaOH溶液调至7.20，按照比例加水，灭菌；(4)将灭好菌的蔗糖与步骤3已冷却好的培养基混合。
全文摘要
本发明公开了一种发酵生产2，3－丁二醇的方法。将粘质沙雷氏菌种子液接种于培养基中，通入空气，搅拌，RQ控制在0.9～1.2之间；然后补入产物促进因子，补充蔗糖水溶液和氨基酸水溶液，RQ控制在1.5～1.8之间；最后补入蔗糖水溶液将RQ控制在1.9～2.2之间，发酵培养，即获得含有2，3－丁二醇的发酵培养液。本发明的方法采用单因子实验、正交实验、响应面实验相结合的静态优化方法，优化了培养基，并采用RQ来调控生产2，3－丁二醇的生产，通过分阶段调控，使得2，3－丁二醇产量获得大幅提高，2，3－丁二醇产量达到107g/L以上，转化率达0.45g/g suc以上，生产能力为2.91g/L·h以上，具有工业化推广应用的前景。
文档编号C12R1/425GK1884560SQ20061002714
公开日2006年12月27日 申请日期2006年5月31日 优先权日2006年5月31日
发明者沈亚领, 魏东芝, 曹学, 李元芳, 朱虎, 王学东 申请人:华东理工大学