专利名称：用于检测二醇的设备和方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测污染物的方法和设备，具体涉及一种提供测定分析的方法和设备，该测定分析用于检测消费者产品中的二醇。
背景技术：
各种产品和材料的污染会对人类和财产造成严重损害。例如，诸如乙二醇 (ethylene glycol (EG))和二甘醇(diethylene glycol (DEG))的有毒物质对于通常的家居产品和药物造成的污染近年来已经在全世界杀死了数千人。另外，工艺材料的污染，例如核反应堆中使用的蒸发器和供给水，会造成昂贵设备的腐蚀和提前失效。因此需要能够在诸如EG和DEG的污染物产生破坏之前在各种材料中检测到它们。
发明内容
本发明提供一种方法和设备，用于确定在测试样品中一种或多种污染物的存在和
/或存在量。一个实施例中，提供一种检测试样中乙二醇和二甘醇中至少一种的方法，其包括在醇脱氢酶的存在下使得二醇与NAD+反应以产生NADH，利用氧化酶氧化NADH以产生过氧化氢，在过氧化氢和过氧化物酶存在下氧化荧光底物以将染料转化成荧光形式，以第一波长照射试样，在第二波长检测光发射，并且提供与检测到的光的量相对应的信号。另一个实施例中，提供一种检测乙二醇和二甘醇的方法，其包括在醇脱氢酶的存在下使得试样与辅酶反应以产生测量溶液，以电致发光的形式产生单波长紫外光，以单波长紫外光照射测量溶液，检测通过测量溶液传递的紫外光，并且产生与检测到的光的量相对应的信号。另一个实施例中，提供一种装置，包括第一和第二小池空间，每个小池空间包括 单波长光源，其构造和设置成照射小池空间的至少一部分；第二光源，与第一光源波长不同，第二光源构造和设置成照射小池空间的至少一部分；光探测器，定位成检测来自第二光源穿过小池空间传递的光；和荧光探测器，定位成接受以与任一个光源发射的波长不同的波长从小池空间发射的光。另一个实施例中，提供一种检测试样中污染物的方法，其包括间歇性地产生场致发光的紫外光，间歇性的产生场致发光的可见光，检测穿过试样传递的紫外光的量，检测从试样荧光发射的波长与紫外光和可见光不同的光的量，并且利用传递的光的量以及发荧光发出的光的量来确定污染物的浓度。这里公开的方法和设备可包括多个不同特征中的一个或多个。例如，任何下列元素可以加入本发明的实施例中产生醛；醇脱氢酶是酵母醇脱氢酶；氧化荧光底物包括将 N-乙酰基-3，7- 二羟基吩F恶嗪(AMPLEX RED )或者AMPLEX ULTRARED 转化成它的荧光形式；二醇与NAD+在碱性环境中反应；二醇与NAD+在大于或等于7. 5的pH值下反应；二醇与NAD+在7. 3和9之间的pH值下反应；二醇与NAD+在具有大约7. 8pH值的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中反应；二醇与NAD+在从包括下列成分的组中选择的缓冲液中反应三羟甲基氨基甲烷(Tris)，N- 二羟乙基甘氨酸(bicine)，Tris碱(Tris Base) HCl, N- 二羟乙基甘氨酸NaOH，碱性pH “Good’ s”，以及磷酸盐缓冲液；将信号拟合到V(t) =βθΧΡα/τ)+νο的步骤；通过对于纯二醇的时间常数将对于试样的时间常数归一化的步骤；信号包括电压信号；通过将电压信号除以在时间等于零时记录的第二电压信号，将电压信号归一化；将归一化的电压信号拟合到v(t) =l-a*eXp(b*t)；确定在时间等于零时的归一化电压信号的初始斜率-dV/dt ；装置由便携式电池供电；装置能够同时在两个不同的试样中测量荧光；重复步骤一和二至少两次，且在产生可见光之前消除紫外光，在产生紫外光之前消除可见光。结合附图，根据下面对于本发明的详细描述，本发明的其它优点、新特征和目的将显而易见。为了清楚起见，当对于本领域技术人员理解本发明来说并不必要时，附图中并未标出每个部件，也没有示出本发明每个实施例的每个部件。
图1示出了本发明一个实施例中使用的酶反应路径。图2示出了本发明一个实施例中使用的酶反应路径。图3示出了根据本发明一个实施例的吸光率方法。图4示出了用于荧光方法一个实施例的反应和酶路径。图5示出了根据本发明一个实施例的荧光方法。图6a是根据本发明一个实施例的电压相对时间的曲线。图6b是根据本发明一个实施例的归一化的酶活性相对于乙二醇浓度的曲线。图7a是根据本发明一个实施例的电压相对时间的曲线。图7b是根据本发明一个实施例的归一化酶活性相对二甘醇浓度的曲线。图8是根据本发明一个实施例的探测器的示意图。图9是根据本发明一个实施例的探测器的电路图。图10示出了根据本发明一个实施例的光源和光探测器的布置。图11是根据本发明一个实施例的测量装置的等角视图。图1 是根据本发明一个实施例的测量装置的侧视图。图12b是根据本发明一个实施例的测量装置的剖视图。图13是根据本发明一个实施例的测量装置的底部等角视图。图14是根据本发明一个实施例的测量装置的底部等角视图。
具体实施例方式家用产品和消费者产品被诸如乙二醇(EG)和/或二甘醇(DEG)之类有毒物质污染是一个致命的公共健康风险，已经偶发地杀死了数百至数千人。如果没有立刻得到检测和救治，即使摄入少量，也会导致中枢神经系统抑制、心肺功能衰竭、以及肾衰竭。这个污染在过去几十年全世界范围内已经导致了数个大规模中毒事件。目前，没有简单特定的方法来以工业规模检测诸如EG和DEG的污染物的相关水平，特别是在第三世界国家，它们最容易受到受污染货物的威胁，并且健康系统不能做出反应。标准的通用检测方法，例如气相色谱或者色谱/质谱分析法，非常昂贵，速度较慢，有具体的能量要求且需要专门训练的人员，所以它们甚至很少用在发达国家用于识别商业产品中的污染。这里描述了多个装置和过程，它们可提供可靠的、确定的和/或廉价的测试，用以在宽范围的家用和其它材料中检测诸如EG和DEG的污染物。“检测”或“探测”表示确定目标化合物或者化合物的类的存在或者量。例如，“检测”试样中的EG可表示识别EG的存在和/或试样中EG的阈值水平和/或确定试样中存在的EG的量或浓度。“单波长”表示80%的输出落在20nm范围内。例如，“单波长”光可使得它的输出的80%落在350和370nm之间。“场致发光地产生”表示利用场致发光装置来发光，例如发光二极管(LED)或者激光器。“试样”包括任何可包括污染物和/或感兴趣的物种的物质。本发明提供用于检测基底中一种或者多种污染物的方法和装置。该方法和装置可基于酶活性测定(enzyme assay)，该测定根据存在的污染物的浓度在光吸收和/或荧光 (light fluorescence)中产生可测量的变化。例如，在一个方面，提供一种吸光率方法，其使用动态测定来产生吸光率变化，该吸光率变化随着污染物浓度而变化。吸光率变化可利用廉价的单波长装置来测量。另一个方面，提供一种荧光方法，其使用动态测定来产生荧光变化。荧光变化可利用廉价的单波长装置来确定。任意这些方法和装置可以以成套部件的形式来提供，其例如包括包装，这里公开的试剂的任意组合，试样制备材料，反应容器和/ 或小池(cuvette)，检测装置和使用说明。试剂可以是稳定的形式，可密封在胶囊中或者小瓶中。在一组实施例中，底物(substrate)可以是任意类型材料，包括液体，凝胶，溶胶，悬液，泡沫，乳剂，和弥散物(dispersion)。另一组实施例中，底物可以是任意类型的家用产品或工业材料。在家用产品中，底物可以例如是下列中的任一种或者组合药物，食品， 酒精饮料，非酒精饮料，护肤液，清洁剂，空气清新剂，或者任何其它的会与人或其它生物接触的家用产品。另一个实施例中，测试的底物可具有任何的流变能力(rheology)、密度和热特性。 例如，底物可具有牛顿或者非牛顿流变能力。底物也可具有对于工业材料和家用产品来说常见的任何特定的重力。在一个典型实施例中，特定的重力将大约为1.0。关于热特性，底物可以是热传导或者隔热的。一个实施例中，检测的污染物可以是包括一个或多个羟基的任何化合物。另一个实施例中，污染物可包括醇(alcohol)、二醇(glycol)、和/或甘油(glycerol)中的任何类型或者组合。另一个实施例中，污染物可以是乙二醇和/或二甘醇。另一个实施例中，污染物可以是可以在其它羟基化的(hydroxylated)化合物存在下被检测的乙二醇和/或二甘醇，所述化合物例如醇，甘油和丙二醇。另一个实施例中，污染物可以在一种或多种其它羟基化的化合物(非污染物)的存在下被检测。例如，底物可以是含有乙醇的饮料，例如葡萄酒，且检测的污染物可以是二醇，例如乙二醇和/或二甘醇。另一个实施例中，污染物可以是可在其它二醇的存在下被检测的乙二醇和/或二甘醇，所述其它二醇例如丙二醇和甘油。检测的污染物的浓度可以从低于FDA限制直到100%的污染物。一个实施例中，乙二醇在从低于大约重量百分比到大约100%重量百分比的范围中被检测。另一个实施例中，二甘醇在从低于大约3%重量百分比到大约100%重量百分比的浓度范围中被检测。在另外的方面，本公开提供了酶活性测定，用于检测底物中一种或多种污染物。用于测定的一类有用的酶是脱氢酶。一些实施例中，酶可包括醇脱氢酶和/或醛脱氢酶。例如，酶可包括酵母醇脱氢酶，例如酵母醇脱氢酶USB 10895。另外的实施例中，酶活性测定可包括辅酶。辅酶可以是但不限于NAD+。例如，辅酶可以是NADP+。一个实施例中，酶活性测定包括一个或多个缓冲剂。例如，使用的缓冲剂可以是三羟甲基氨基甲烷缓冲液或者N-二羟乙基甘氨酸缓冲液。另外，缓冲剂可以是Tris碱HC1， N-二羟乙基甘氨酸NaOH，N-二羟乙基甘氨酸HCl，一种或多种碱性pH范围的“Good’ s缓冲液”和/或磷酸盐缓冲液。测定材料的PH可以从大约4. 0到大约10. 0。一组实施例中， pH可以在大约6. 0到10. 0之间，7. 0禾Π 9. 0之间，7. 5禾Π 8. 6之间，或者大约7. 8。测试中，测定材料的温度可以从大约零度到大约100摄氏度。一个实施例中，测试材料的温度范围在大约10到大约40摄氏度之间。另外，测试材料的温度可以接近室温(大约20摄氏度)，并且保持在大约正负0. 5摄氏度内。一组实施例中，诸如EG和DEG的污染物可以借助于吸光率方法100(图1)采用动态测定来检测。吸光率方法100允许测量的EG和DEG的浓度从低于美国食品药品管理局 (FDA)规定的安全限制一直到高于各种历史污染事故中检测到的浓度的水平。一组实施例中，在酵母醇脱氢酶的存在下，吸光率方法100可将分析物例如EG和DEG转化成它们相应的醛，如图1对于EG所示以及如图2对于DEG所示。这些反应中，辅酶NAD+可以被转化成 NADH0通过监测NADH浓度的增加来确定EG和/或DEG浓度，NADH浓度可通过利用分光测光仪测量在大约MOnm处的吸收来获得。一个实施例中，如图3，吸光率方法100在步骤110以收集包括一种或多种二醇的测试样品开始。在步骤120，测试试样与酶和辅酶结合，酶例如酵母醇脱氢酶，辅酶例如 NAD+。在步骤130，测试试样、酶、和辅酶被放置在小池(cuvette)中。在步骤140，试样中的一种或多种二醇被转化成一种或多种醛，且NAD+被转化成NADH以形成测量溶液。在步骤150，可以利用诸如发光二极管(LED)的装置场致发光地产生单波长光。在步骤160，用单波长光照射小池和测量溶液。在步骤170，检测穿过小池和测量溶液传递的光的量。在步骤 180，提供与检测到的光的量相对应的信号，且在步骤190，根据检测到的光的量确定试样中二醇的浓度。这个动态测定中吸光率改变可与存在的污染物的量成比率。
上述的以及图3中的步骤110-190中的一个或多个可以是可选的，并且步骤 110-190的顺序并不重要。另外，虽然上述方法100可以用于检测二醇，它也可用于检测可包括一个或多个羟基的任何其它污染物。另外的实施例中，来自步骤180的信号可通过在时间为零时的信号值来归一化 (normalized)。具体的，该信号例如可以是电压，并且全部时刻的电压可以除以在时间为零时的电压。这样，背景被归一化，从而例如如果在步骤150产生的光的强度逐月改变，这个变化不会影响分析结果。如果电压直到在该时间之后才能得到和/或被记录，时间为零时的电压可通过外推法确定。来自步骤180的数据可以通过利用函数形式将其拟合(fitting)而被进一步处理。一个实施例中，函数形式可以是指数函数，例如V(t) = l-a*eXp(b*t)，其中V可以是归一化的电压(相对于t = 0时的电压)，t是时间，a和b是待定常量，例如，通过最小二乘法曲线拟合确定。一旦函数形式已经通过时间历史数据被拟合，该数据可以被进一步分析以例如外推电压值到没有进行测量的时刻。另外，函数形式可用于例如获得不同时刻的电压之间的差和/或比。t = 0时刻的电压可以是在t = 0时刻测量的电压，或者例如可以是外推到t = 0时刻的电压，而不是t = 0时刻测量的实际电压。在被放置到小池中之前，测试试样可被加热以去掉一些非目标污染物，或者被离心。当试样含有颗粒例如硅酸盐颗粒(例如牙膏中)，可使用离心，这些颗粒会散射光并干涉光学测量。利用酵母醇脱氢酶的实施例可要求相对大的底物浓度(例如1. 5-1000mM)以实现合理的反应速率。利用酵母醇脱氢酶，定义Michaelis-Menten常数KM为酶活性最大值的一半时的底物浓度，对于EG和DEG来说KM都比较大。为了迅速检测少量的底物，可使用测量初始吸收率的动态测定，而不是等待直到反应完成并且对整体吸收变化进行量化。相比于等待终点测定来说，这可在较短时间内提供准确结果。吸光率方法100可用于具有不同的PH值和离子强度的水溶液。一些实施例中，pH 保持在7和9之间。可重复的精确结果已经利用在8.0附近的pH获得。一个实施例中，吸光率方法100利用了缓冲液，例如三羟甲基氨基甲烷-盐酸。其它实施例中，可使用生物相容的缓冲液，例如磷酸盐或者N- 二羟乙基甘氨酸。吸光率方法100可用于测量溶液中的污染物浓度，该溶液的温度在大约0和100 摄氏度之间。优选的，温度在大约10和40摄氏度之间。当温度保持恒定时，例如在大约1 摄氏度内，诸如26士0. 5摄氏度内，已经获得了极好的结果。对于吸光率方法100的一个实施例，醇脱氢酶-NAD试剂可通过市场上可买到的用于乙醇确定的成套试剂盒来制备(no. 331-CMA ;Sigma化学公司，St. Louis, MO 63178)。 向NAD-ADH Multitest Vial (Sigma no. 331-10)添加5. 3ml的三羟甲基氨基甲烧-盐酸缓冲液，ρΗ8· 8 (Biorad, 0. 1M，从1. 5M利用ddH2稀释)。试剂的最终成分大致为(每升) 1. 5X10"5U的醇脱氢酶(EC 1. 1. 1. 1)，1. 89mmol的NAD，以及IOOmmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(PH 8.8)。试剂可以在室温下稳定至少8小时。通常的测量中，乙二醇底物可以以1比2的比率被添加到NAD-ADH溶液(例如300和600微升，或者120和240微升)。吸收率的变化例如可以在340nm处被监测10分钟。另一组实施例中，可利用荧光方法200来检测诸如EG和DEG的污染物，该方法使用了酶偶联测定法来产生荧光发射中的变化。例如，诸如EG和/或DEG的污染物可用于将荧光底物(染料)间接转化成它的荧光形式，且EG和/或DEG的浓度可根据来自试样的荧光发出的光的量来确定。图4示出了对于荧光方法200的一个实施例的反应和酶路径。在反应a和b中， EG和DEG分别与醇脱氢酶反应以产生醛和NADH。通过使用酵母醇脱氢酶作为特定类型的醇脱氢酶，已经发现，可以使得与存在的甘油、丙二醇和/或聚乙二醇发生的干扰最小化， 或者消除。反应c中，NADH然后可利用NADH氧化酶被转化回到NAD+，其对于NADH的每个等效物产生了过氧化氢的一个等效物。过氧化氢然后分解以产生两个自由基。反应d中， 在辣根(horseradish)过氧化物酶(HRP)的存在下，自由基将诸如荧光底物的染料从它的非荧光形式转化成它的发荧光形式。荧光底物包括这样的材料，其可以在自由基和过氧化物酶的存在下从非荧形式转化成发荧光形式。荧光底物可以来自刃天青(resazurin)/试卤灵(resorufin)族，实例包括N-乙酰基-3，7-二羟基吩ρ恶嗪(dihydroxyphenoxazine) (Amplex Red)，可以从InvitrogenA36006获得，以及它的衍生物以及相关化合物，例如 AmplexUltraRed0过氧化物酶可包括HRP，例如类型1和类型2。图5示出了荧光方法200的另一个实施例，用于检测诸如二醇的污染物。在步骤 210，包括二醇的试样被收集。在步骤212，二醇被转化成醛，NAD+被转化成NADH。在步骤 214，NADH被氧化以产生化学当量的过氧化氢。在步骤216，在过氧化氢的存在下，Amplex UltraRed染料利用辣根过氧化物酶被氧化以产生含有试卤灵的测量溶液。在步骤218，例如利用LED场致发光的产生具有大约530nm频率的单波长光。在步骤220，利用单波长光照射测量溶液。在步骤222，检测从测量溶液以大约590nm的不同波长荧光发射的光的量。在步骤224，提供与检测的光的量相对应的信号。在步骤226，确定二醇的存在或者浓度。在步骤228，确定是否继续测量。上述的图5中的步骤210-2 中的一个或多个是可选的，且步骤的顺序可以变化。 另外，虽然上述方法200可用于检测二醇(一种或多种)，它也可用于检测具有羟基的任何其它污染物。另一组实施例中，背景扣除过程可以在来自步骤224的信号上进行。具体的， 两个不同时间点之间的信号的变化可以例如通过下面的方法确定将较早时间时的信号从较晚时间的信号中减去。例如，如果信号是电压，三分钟和八分钟之间的绝对电压变化是八分钟时的电压减去三分钟时的电压。利用这个方法，可以去除恒定的荧光背景，允许更高的测试灵敏度。许多类型的家用材料和药品，例如牙膏和止咳糖浆，会含有甘油或者丙二醇。这里描述的测试能够分析这些试样中的EG和DEG，而不存在来自甘油和/或丙二醇产生的显著的干扰。其它情况中，试样制备也是有帮助的。虽然吸光率方法100和荧光方法200可用于分析任何类型的底物材料，测试样品制备过程可取决于待分析的底物的特定类型。例如， 当制备用于荧光方法200的牙膏试样时，牙膏试样可溶解在缓冲液中并被离心。例如，通过使得混合物产生涡流运动(VOrtexing)，3g的牙膏试样可溶解在20ml的三羟甲基氨基甲烷-盐酸0. IM pH 7.8缓冲液中。试样然后可以3000rpm的速度被离心十分钟，从而去除硅酸盐颗粒，该颗粒会散射光且干扰测量。试样然后可利用缓冲液被进一步稀释。表1示出了缓冲液的总量，其可以被添加以获得给定量的牙膏和DEG浓度。
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权利要求
1.一种检测怀疑含有二醇的试样中乙二醇和二甘醇中至少一种的方法，该方法包括 在醇脱氢酶的存在下使得二醇与NAD+反应以产生NADH ；利用氧化酶氧化NADH以产生过氧化氢；在过氧化氢和过氧化物酶的存在下氧化荧光底物从而将荧光底物转化为荧光形式； 以第一波长照射试样； 以第二波长检测光发射；和提供与检测到的光的量相对应的信号。
2.如权利要求1所述的方法，其中，使二醇反应的步骤包括产生醛。
3.如权利要求1所述的方法，其中，醇脱氢酶是酵母醇脱氢酶。
4.如权利要求1所述的方法，其中，使得荧光底物氧化的步骤包括将N-乙酰基-3， 7-二羟基吩囔嗪(Amplex Red)或者Amplex Ultrared转化成其荧光形式。
5.如权利要求1所述的方法，其中，二醇在碱性环境中与NAD+反应。
6.如权利要求1所述的方法，其中，二醇在大于或等于7.5的pH与NAD+反应。
7.如权利要求1所述的方法，其中，二醇在7.3和9之间的pH与NAD+反应。
8.如权利要求1所述的方法，其中，在具有大约7.SpH的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中，二醇与NAD+反应。
9.如权利要求1所述的方法，其中，二醇与NAD+在从下列组中选择的缓冲液中反应，该组包括三羟甲基氨基甲烷，N- 二羟乙基甘氨酸，Tris碱HC1，N- 二羟乙基甘氨酸NaOH，碱性pH “Good’ s”，以及磷酸盐缓冲液。
10.如权利要求1所述的方法，其还包括将信号拟合到V(t) = i3eXp(t/T)+V0的步骤。
11.如权利要求10所述的方法，其还包括通过对于纯二醇的时间常数将对于试样的时间常数归一化的步骤。
12.—种检测怀疑含有二醇的试样中乙二醇或二甘醇的方法，该方法包括 在醇脱氢酶的存在下使试样与辅酶反应以形成测量溶液；场致发光地产生单波长紫外光； 利用该单波长紫外光照射测量溶液； 检测穿过测量溶液传递的紫外光；和产生与检测到的光的量相对应的信号。
13.如权利要求12所述的方法，其中，该信号包括电压信号。
14.如权利要求13所述的方法，其包括通过下列方法来归一化该电压信号将该电压信号除以在时刻为零时记录的第二电压信号。
15.如权利要求14所述的方法，其包括将归一化的电压信号拟合到V(t)= l-a*exp(b氺t)。
16.如权利要求15所述的方法，其包括确定在时刻为零时归一化电压信号的初始斜率-dV/dt。
17.一种装置，包括第一和第二小池空间，每个小池空间包括 单波长光源，其构造和设置成照射小池空间的至少一部分；波长与第一光源不同的第二光源，第二光源构造和设置成照射小池空间的至少一部分；光探测器，定位成检测来自第二光源穿过小池空间传递的光；和荧光探测器，定位成接收以与任一个光源发射的波长不同的波长而从小池空间发出的光。
18.如权利要求17所述的装置，其中，该装置由便携式电池供电。
19.如权利要求17所述的装置，其中，该装置能够同时在两个不同的试样中测量荧光。
20.一种检测试样中污染物的方法，包括 间歇性地产生场致发光的紫外光；间歇性的产生场致发光的可见光； 检测穿过试样传递的紫外光的量；检测以不同于紫外光和可见光的波长从试样荧光发射的光的量；和利用传递的光的量和荧光发射的光的量，确定污染物的浓度。
21.如权利要求20所述的方法，其包括至少两次重复步骤一和步骤二，且在产生可见光之前消除紫外光，且在产生紫外光之前消除可见光。
全文摘要
提供一种检测各种材料中污染物的方法和设备，该污染物例如乙二醇和二甘醇，该材料包括家用产品和药物。污染物可利用酶活性测定来检测，该测定在光吸收和/或光荧光方面产生了可测量的变化。
文档编号G01N33/00GK102282465SQ200980154551
公开日2011年12月14日 申请日期2009年11月13日 优先权日2008年11月14日
发明者亚历山大.H.斯洛克姆, 彼得.J.卢, 梅拉尼.M.赫尔 申请人:亚历山大.H.斯洛克姆, 彼得.J.卢, 梅拉尼.M.赫尔