专利名称：源自记忆b细胞的人单克隆抗体的快速表达克隆的制作方法
技术领域：
本申请大体上涉及不利用杂交瘤细胞技术来产生人单克隆抗体(mAb)的方法，以及使用该抗体来治疗或预防疾病(例如病原体、如人类免疫缺陷病毒的感染)的方法。
背景技术：
虽然经过20多年的努力人类免疫缺陷病毒-1型(HIV-I)疫苗仍然是难以获得的，但是它仍是唯一最有希望阻止疫情的措施[1’2]。近期基于5型腺病毒(Ad5_)载体的细胞免疫(CTL)疫苗的失败和早期膜蛋白(gpl20)亚单位疫苗的失败也反映了这个任务的困难度[2]。由于这些失败，研究重点又回到研究某些能自发地控制感染病毒的HIV-I感染者群体的保护性体液反应及其抗原表位。这些群体包括保持稳定的CD4T淋巴细胞数量的多年不发病的长期不进展者(LTNP)[3]，以及罕见病毒控制者(EC)[4]即在申请人的研究组里称为的天然病毒抑制者(NVQ [5]，这类人感染者无需抗逆转录病毒治疗就可以自发地将病毒复制控制在极低的水平。最近的几项研究试图识别在某些罕见的HIV感染者的血浆或血清中发现的具有高中和活性的抗膜蛋白抗体的抗原表位[6’7]。然而，体液中抗体的特异性有可能因HIV包膜蛋白的高度易变而随着时间发生明显改变和/或减少[8]，特别是在抗原血症起限制作用的情况下。因此，在慢性HIV-I型感染者体液中的抗体的特异性不大可能完全体现出早期急性感染阶段的病毒所诱导产生的抗体特性。此外，在急性感染的关键时期发生的可能的关键抗体反应可能无法通过在病毒载量已经下降到检测下限后进行的血清样本分析而检测到。例如，有文献显示EC具有比慢性进展者更低的HIV-I特异性抗体的滴度 [9’1(1]。因此，需要采取新的方法来评估HIV感染个体中的现在和过去的免疫反应，以寻找新的有益于治疗的抗体。同样的问题对于已经感染了其他病原体或有自身免疫性疾病的个体来说也是很重要的。一旦这种抗体被鉴定，就需要有一种可靠的方法来进行制备，优选将其制成供人类使用的完全人抗体。有五种通用方法来分离人单克隆抗体，它们都存在各种的技术性缺陷，使它们难以与用来制备小鼠单克隆抗体的原Kohler-Milstein的杂交瘤技术相比。这些方法包括杂交瘤细胞法_、利用Epstein-Ban 病毒(EBV)的B细胞转化、噬菌体展示 [42]、酵母展示[43]和小鼠单克隆抗体的“人源化”[44]。由于缺乏适用的人细胞融合受体细胞， 用常规的杂交瘤细胞法分离人单克隆抗体已被证明非常艰难，虽然这种方法已被证实是可能成功的(参见最近一个令人关注的例子。EBV转化已被证明具有同样困难，但其原因不同。EBV转化的B细胞系往往是遗传不稳定的，由此产生的高克隆损失率使得这种方法非常麻烦。最近公布了一种改进的EBV转化方法，该方法使用EBV来从免疫的记忆B细胞(Bfcffl)中转化富集的BMa/26]。这种方法适用于多种免疫原，但它需要健康的Bfcm，而这在如 HIV-I感染的慢性感染过程中经常是缺乏的[18]。噬菌体和酵母展示技术克服了这些问题， 但这些方法在筛选过程中依赖于Fab片段或单链Fv (scFv)片段，从而无法通过诸如病毒中和的功能分析来进行筛选。噬菌体展示还存在这样的问题，即它对可以稳定地表达为重组噬菌体的抗体特性有未知的结构性限制[46]。最后，可以通过移植编码人抗体可变区基因上的抗原结合区的基因片段来“人源化”小鼠单克隆抗体。这是一个高度繁琐的劳力密集的工作，超出了大多数研究实验室的所能达到的水平。因此，需要有一种新的方法来快速克隆全长的人单克隆抗体以解决这些问题。
发明内容
本发明所提供的方法可用于快速克隆全长的人单克隆抗体，其可用于治疗疾病和病症，如病原体感染、癌症以及自身免疫性疾病。在第一方面，本发明提供了一种用于制备特异性结合特定的已知抗原的单克隆抗体的方法。该方法包括如下步骤(a)从一个已接触过该特定已知抗原的动物中获取血液样本；(b)从该血液样本中分离出记忆B细胞；(c)在一定条件下培养所分离出的记忆B细胞一定时间，直到所述记忆B细胞分化为能稳定生产单克隆抗体的浆细胞；(d)确定浆细胞是否能产生特异性结合该特定已知抗原的单克隆抗体；(e)如果浆细胞能产生特异性结合该特定已知抗原的单克隆抗体，则从浆细胞中分离出总RNA，而如果浆细胞不产生该单克隆抗体，则重复步骤(b)-(d)，直到所分离出的多个记忆B细胞被鉴定为可分化成能稳定产生单克隆抗体的浆细胞；(f)使用在步骤(e)中分离出的总RNA来制备总RNA中的编码抗体重链可变区(VH)的mRNA分子的cDNA和编码抗体轻链可变区(VL)的mRNA分子的cDNA ； (g)将VH链cDNA克隆到真核表达载体，并将VL链cDNA克隆到真核表达载体；(h)选择包含VH链cDNA的表达载体制备VH链微型库，并选择包含VL链cDNA的表达载体制备VL链微型库；(i)用包括来自VH链微型库的VH链cDNA的表达载体的混合物和包括来自VL链微型库的VL链cDNA的表达载体的混合物共转染恰当的宿主细胞，并在一定条件下使共转染细胞生长达足够长的时间，以允许这些细胞能稳定地产生抗体；(j)确定共转染细胞产生特异性结合该特定已知抗原的单克隆抗体；(k)鉴定编码有如步骤(j)中单克隆抗体的VH链的VH链cDNA，其包括步骤⑴用从VH链cDNA微型库中获得的特定VH链cDNA表达载体和包括来自VL链微型库的VL链cDNA表达载体的混合物共转染恰当的宿主细胞，并在一定条件下使该共转染细胞生长达足够长的时间，以允许该共转染细胞形成能稳定产生抗体的克隆；(ii)确定该克隆是否产生特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体；(iii)如果该共转染细胞产生了特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体，则继续进行步骤(k)之(iv)，而如果该共转染细胞不产生单克隆抗体，则使用不同的特定VH链cDNA表达载体来重复步骤 (k)之⑴和步骤(k)之(ii)，直到特定VH链cDNA表达载体被鉴定为可产生单克隆抗体； (iv)鉴定产生单克隆抗体的VH链cDNA，并选择用来制备产生特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体的克隆的VH链cDNA表达载体；(1)鉴定编码如步骤(k)中的单克隆抗体的VL 链的VL链cDNA，包括步骤⑴用在步骤(k)之(iv)中鉴定的VH链cDNA的表达载体和选自VL链微型库的特定VL链cDNA表达载体共转染恰当的宿主细胞，并在一定条件下使该共转染细胞生长达足够长的时间，以允许该共转染细胞形成能稳定地产生抗体的克隆；(ii)确定该克隆是否产生特异性地结合特定已知抗原的单克隆抗体；(iii)如果该克隆产生了特异性地结合特定已知抗原的单克隆抗体，则继续进行步骤(1)之(iv)，而如果该共转染细胞不产生单克隆抗体，则用不同的特定VL链cDNA的表达载体重复步骤(1)之(i)和步骤(1)之(ii)，直到特定的VL链cDNA表达载体被鉴定出产生单克隆抗体；(iv)鉴定编码单克隆抗体的VL链的VL链cDNA，并选择用于制备产生单克隆抗体的克隆的VL链cDNA表达载体；以及(m)用步骤(k)之(iv)所鉴定的VH链cDNA的表达载体和用步骤⑴之(iv) 所鉴定的VL链cDNA的表达载体共转染恰当的宿主细胞，以制备能够产生特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体的宿主细胞，从而产生结合特定已知抗原的单克隆抗体。在上述方法中，VL链可以是V κ链或V λ链。宿主细胞例如可以是细菌细胞、273Τ细胞或中国仓鼠卵巢细胞，而真核表达载体例如可以是IgGl、κ或γ真核表达载体。 在上述方法中，VH链cDNA和VL链cDNA可以被克隆到相同的表达载体中。该特定已知抗原可以是来自病原体如病毒、细菌、朊病毒、真菌、酵母菌或寄生虫的抗原。例如，该病原体可以是人类免疫缺陷病毒(HIV)，例如HIV-I或HIV-2。在上述方法中，分离出的记忆B细胞例如可以约100个记忆B细胞/孔的密度培养。从中获得B记忆细胞的动物可以是以前曾以针对病原体的疫苗免疫的方式暴露于病原体，或该动物可以是以前曾自然地被病原体感染。在某些例子中，该动物将被人类免疫缺陷病毒感染，并且该动物将能够自发地控制病毒。从中获取B记忆细胞的动物可以患有可针对自体抗原产生抗体的自身免疫性疾病，这种疾病是选自包括系统性红斑狼疮(SLE)、1型糖尿病、克罗恩病、多发性硬化症和重症肌无力的集合体中的一种。这些自身抗体可用作自身免疫性疾病的治疗标靶。从中获取B记忆细胞的动物在获取B记忆细胞之时或在之前患有肿瘤或癌症。B记忆细胞如任其成长为可产生抗体的浆细胞，则可以产生特异性结合肿瘤或癌细胞的抗体。抗原可以是包含碳水化合物、脂类、蛋白质、肽、核酸和小分子(有机和无机)的集合体中的一种。动物可以是人，在这种情况下，单克隆抗体是完全人单克隆抗体。在第二方面，本发明提供了用上述方法分离的单克隆抗体。该单克隆抗体可具有可变重链(VH)的第三互补决定区，其包括由从SEQ ID NO 73到SEQ ID NO :115中的至少一个氨基酸序列。该单克隆抗体可具有可变轻链(VL)的第三互补决定区，其包括由从SEQ ID NO 116到SEQ ID NO :163中的至少一个氨基酸序列。在第三方面，本发明提供了一种治疗或预防由个体中的人类免疫缺陷病毒造成的感染的方法，包括对个体施用由上述方法分离出来的单克隆抗体。在第四方面，本发明提供了一种鉴定用于治疗或预防由人类免疫缺陷病毒(HIV) 感染引起的疾病的治疗用单克隆抗体的方法。该方法包括(a)从其本身是HIV的精英控制者天然病毒抑制者的动物中获得血液样本；(b)确定该血液样本中是否包含任何结合特定已知病原体的抗体；(c)从血液样本中分离记忆B细胞；(d)在一定条件下培养多个分离出的记忆B细胞达足够长的时间，以允许记忆B细胞分化为能稳定生产单克隆抗体的浆细胞；(e)确定浆细胞是否产生特异性结合HIV的单克隆抗体；(f)将由浆细胞产生的单克隆抗体与血液样本中的抗体进行比较；以及(g)如果由浆细胞产生的单克隆抗体与血液样本中的抗体不同，则鉴定并选择由浆细胞产生的该不同的单克隆抗体。可以用如上述第一方面所述方法中的步骤(e)到(m)选择上述步骤(g)中的浆细胞来制备能稳定地产生该不同的单克隆抗体的转化的宿主细胞克隆。在第五方面，本发明提供了一种在动物目前尚未有特异性结合特定已知抗原的体液抗体时确定动物是否曾被暴露于特定已知抗原下的方法。该方法包括(a)从动物中获得血液样本；(b)从血液样本中分离记忆B细胞；(c)在一定条件下培养分离出的记忆B细胞达足够长的时间，以允许记忆B细胞分化为能稳定生产单克隆抗体的浆细胞；以及(d)确定浆细胞是否产生特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体，其中该单克隆抗体的产生表明该动物曾暴露在该特定已知抗原下，无该单克隆抗体产生则表明动物可能没有暴露于该特定已知抗原下。该抗原可以是病原体如人类免疫缺陷病毒(HIV)的抗原。
本发明将以示例的方式并通过非限制性地结合附图部分予以说明，其中图1是抗HIV-I包膜蛋白的血浆抗体的特异性的检测。其中A)采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测针对FLSC、gpl20Ba_L和gpl40Ba_L的血浆抗体，以对数标度显示半饱和结合滴度。B)在存在亚抑制浓度的s⑶4的条件下，通过对HIV-27312A_v434M中和活性的增强来检测NVS供体的血浆中的CD4i抗体。示出了 IC90滴度，虚线是检测极限。C)上排图显示了通过针对bl2单克隆抗体的竞争性ELISA (左)、针对s⑶4-Ig的竞争性ELISA (中) 和针对结合到细胞表面CD4的gpl20-Ig的抑制(右)所检测的血浆中CD4bs抗体的结果。 下排图显示了通过针对17b单克隆抗体的竞争性ELISA (左)、针对ED47单克隆抗体的竞争性ELISA (中)和针对结合到细胞表面CCR5的FLSC-Ig的抑制(右)所检测的血浆中⑶4i 抗体的结果。NVS5、NVS9和NVSlO的结果分别以圆圈、方块和三角形标识。图2是HIV-I包膜蛋白特异性BMem的鉴定。对100个BMem/孔刺激2周，并利用抗 κ和抗λ抗体的混合物通过ELISA从上清液中筛选出总的⑶4i、⑶4bs和“其它”的HIV-I 包膜蛋白特异性的BMem。A)NVSlOBmem培养上清液的典型ELSIA数据。B)三个NVS供体中的 HIV-I包膜蛋白特异性的BMem以频率/百万总BMem表示。检出限为10个前体/百万BMem。 C)在一个饼图中显示了供体NVS5、NVS9和NVSlO中每一个的⑶4i (蓝色)、⑶4bs (红色) 和“其它”特异性(黄色)的Bfcm百分比。图3显示了三个⑶4i单克隆抗体的分离。如材料与方法部分中所述地从NVS5的 CD4i抗体阳性孔中克隆出三个单克隆抗体。图中示出了单克隆抗体对于FLSC(实心符号) 以及对于gpl20Ba<(空心符号)的选择性活性的ELISA曲线。图4显示了 NVS5、NVS9和NVSlO的病毒载量及⑶4计数。所有供体都有稳定的 CD4计数(圆圈，细胞/ml)。病毒载量(方形)的检出限为75拷贝/ml。在NVSlO的多个时间点(三角形)处采用敏感度较低的病毒载量检测(< 400拷贝/ml)。箭头指示为这项研究取样的时间点。图5显示了采用ELISA法鉴定⑶4i和⑶4bs单克隆抗体(mAb)。依照示例部分中所述的三种模式的HIV-I包膜蛋白ELISA法来检测代表性的⑶4i和⑶4bs单克隆抗体。A)右、中、左图分别显示出对于⑶4i单克隆抗体(17b，ED47，A32)、⑶4bs单克隆抗体 (bl2，M14，s⑶4-Ig)和单克隆抗体2G12的结果。还显示了对于FLSC(实心符号)和对于 gpl20Ba_L(空心符号)的反应性的ELISA曲线。B)显示了在0. 1 μ g/ml下用于所有这些代表性单克隆抗体的ELISA法的OD值。CD4i单克隆抗体是通过其与FLSC的强键结合和与 gpl20Ba_L或gpl40Ba_L的弱键结合进行鉴定，而⑶4bs单克隆抗体是通过其与gpl20Ba_L或 gpl40Ba_L的强键结合和其与FLSC的弱键结合的比较进行鉴定。除了⑶4i和⑶4bs外的单克隆抗体被标记为“其他”类。其中一个“其他”单克隆抗体2G12同样很好地结合FLSC和 gpl20Ba_L,因此可用来标化ELISA法。图6是用来鉴定分泌抗包膜蛋白抗体的浆细胞的步骤的示意图。图7是显示了查找正确的VH-VL基因对的复杂性的示意图。图8是显示了用来自VH(重链可变区)和VL(轻链可变区)微型库的cDNA混合物(池)进行细胞转染的示意图。图9显示了如何鉴定制备抗包膜蛋白抗体的VH链cDNA的示意图。图10显示了如何鉴定制备包膜蛋白抗抗体的VL链cDNA的示意图。图11是显示了用本发明所述的方法利用从人Bfcm细胞中克隆得到的抗HIV-I gpl20抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)检测的图。
具体实施例方式申请人:发现，记忆B细胞(BmJ分析可以用来鉴定针对特定已知抗原的已过抗体反应。这种抗体反应往往不能通过同期血浆抗体样本的分析来检测。申请人的研究结果表明，通过Bfcm分析单克隆抗体的多样性对将针对特定病原体或抗原的抗体特异性和保护免疫相关联的血清学研究形成了补充。因此，本发明的某些实施例涉及一种方法，用于鉴定特异性结合由已知曾经在过去暴露于抗原的动物产生的已知抗体的单克隆抗体，但是该单克隆抗体目前在从动物中获得的同期血清样本中无法检测出来。使用这种方法，申请人发现，属于感染了 HIV-I的罕见病毒控制者(EC)或天然病毒抑制者(NVQ的某些个体具有能够产生在同期血清样本中无法检出的抗包膜蛋白单克隆抗体的Bfcm。新近发现的抗包膜蛋白单克隆抗体具有治疗意义，因为它们是由能不借助药物治疗便可自我控制潜在致命的 HIV-I感染的罕见人群产生的。特别是，申请人发现抗原CD4i的单克隆抗体治疗HIV-I感染时特别有用。这种抗体包括阳-11、阳-12、阳-13、1713』047和A32(详见下文)。该新方法可用于制备针对可产生抗原、即能够诱导宿主产生免疫反应的任何分子的单克隆抗体。在申请人的研究过程中，申请人不仅鉴定出新的治疗用抗体，还开发出一种无需使用杂交瘤细胞融合、噬菌体展示或EBV转化就可制备特异性结合已知抗原的完全人单克隆抗体的新方法。一些实施例涉及这种新方法以及用这种方法重组单克隆抗体，特别是下面介绍的新发现的抗HIV包膜蛋白单克隆抗体。其他一些实施例涉及一种方法，用于在动物目前还不能产生特异性结合已知抗原的抗体时确定该动物是否曾经接触或感染已知抗原。早期急性HIV-I感染的关键窗口期内的抗病毒抗体反应性质对于疫苗和药物设计都很重要，但在本质上是难以评估的。一旦慢性感染已形成，特别是在复制和抗原血症受到自然过程或药物干预限制的条件下，抗体特异性有可能明显改变。因此，过去的反应不太可能在现在的样本中反映出来。几个研究组正在试图通过建立网络跟踪高危个体以期在急性感染后的最短时间内获得样本来克服这种限制。但是，这些努力面临许多实际上的和后勤上的限制，特别是在资源匮乏的环境中。长寿命的Bfcm提供了在宿主的大部分寿命期内产生的抗体特异性的历史档案[11]。 例如，Bfcm在接种牛痘疫苗后能持续50年[12]。相比之下，体液中抗体通常会在抗原清除后衰减。例如，多达一半的接种者在接种乙肝(HBV)疫苗后几年之内会失去保护性抗体[13]。 另一方面，在缺乏抗体时HBV特异性BMem可以持续，并为在暴露于HBV或疫苗下时的快速保护性抗体反应创造条件[14_17]。这些研究为Bfcm提供了先前抗体反应的高度稳定记录的方面提供了强有力的综合性证据。由于Bfcm可以在宿主的大部分寿命时间内持续，可推理认为他们可以提供这种早期反应的记录，并可提供一个新窗口，通过其可将抗体特异性与申请人的NVS人群中的病毒控制机制相关联。HIV-I感染者体内的BMem细胞的分析本质上很困难，因为HIV-I发病机理包含可以扩展至体液免疫的严重的免疫功能障碍[18’w]。幸运的是，可以维持一个相对完整的免疫系统的EC或NVS提供了一个可在感染期内由HIV-I包膜蛋白诱导产生的体液免疫的档案进行调查的机会。因此，申请人采用一个本地NVS人群[5]，针对gpl20和⑶4bs上的两个被高度保护性的交叉反应性中和标靶以及包含CD4诱导的(CD4i)抗原决定族的辅助受体结合位点来将存档的Bfcm特异性和同期血浆抗体反应来进行比较并对照[2°_23]。NVS志愿者在确定申请人的NVS人群里的抗包膜蛋白抗体反应的研究的早期阶段，申请人观察到在特异性结合HIV-I包膜蛋白表位的血浆抗体和Bfcm之间的特异性存在明显不一致性。对三名志愿者NVS5、NVS9和NVSlO进行了更详细的研究以探索这一观察结果。每个志愿者的临床特征见表1。自诊断之日起至今的时间NVS9(53岁的非裔美国男性，危险因素静脉注射吸毒)是5年，NVSlO (57岁的非裔美国女性，危险因素性行为)是13年，而 NVS5(50岁的非裔美国女性，危险因素性行为)是17年。这些个体在此期间没有接受过抗逆转录病毒治疗。总B细胞和Bfcm频率在正常范围内[19]，表明了这些人没有整体免疫失调(见表1)。无法检测到的病毒载量以及正常的CD4+T细胞计数也支持这一点。在全部试验时间内，NVS9和NVSlO将病毒复制抑制到检测不到的水平(< 75拷贝/毫升血浆)(图 4)。相比之下，NVS5在第一个三年观察期内曾出现高达约300拷贝/毫升血浆的低水平病毒的瞬态峰值，在随后的约四年内被控制到检测不到的水平(图4)。有趣的是，在样本被采集用于这里披露的研究后不久，就出现了约100拷贝/毫升血浆的病毒峰值。如下面所讨论的，这可能是很重要的，因为NVS5是三个志愿者中唯一具有明显的中和抗体滴度的。这可能反映出在诊断后的17年，NVS5成为本发明研究的三个NVS志愿者中受感染时间最长的。重要的是，在整个观测时间，所有三个供体都具有正常范围内的稳定的CD4+T细胞计数 (图幻。总之，这些数据表明，在没有抗逆转录病毒治疗的情况下，这三个NVS志愿者维持无法检测到的病毒载量多年，而且就总表型而言，他们的淋巴细胞亚群是正常的。表1三个NVS供体的特征
权利要求
1. 一种用于制备特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体的方法，包括步骤(a)从一个已接触过所述特定已知抗原的动物中获取血液样本；(b)从所述血液样本中分离出记忆B细胞；(c)在一定条件下培养所分离出的记忆B细胞一定时间，以允许所述记忆B细胞分化为能稳定生产单克隆抗体的浆细胞；(d)确定所述浆细胞是否能产生特异性结合所述特定已知抗原的单克隆抗体；(e)如果所述浆细胞能产生特异性结合所述特定已知抗原的所述单克隆抗体，则从所述浆细胞中分离出总RNA，而如果所述浆细胞不产生所述单克隆抗体，则重复步骤 (b)-(d)，直到所分离出的记忆B细胞被鉴定为分化成能稳定产生所述单克隆抗体的浆细胞；(f)使用在步骤(e)中分离出的总RNA来制备总RNA中的编码抗体重链可变区(VH)的 mRNA分子的cDNA和编码抗体轻链可变区(VL)的mRNA分子的cDNA ；(g)将VH链cDNA克隆到真核表达载体，并将VL链cDNA克隆到真核表达载体；(h)选择包含VH链cDNA的表达载体制备VH链微型库，并选择包含VL链cDNA的表达载体制备VL链微型库；(i)用包括来自VH链微型库的VH链cDNA的表达载体的混合物和包括来自VL链微型库的VL链cDNA的表达载体的混合物共转染恰当的宿主细胞，并在一定条件下使共转染细胞生长达足够长的时间，以允许这些细胞能稳定地产生抗体；(j)确定所述共转染细胞产生特异性结合所述特定已知抗原的单克隆抗体； (k)鉴定编码了如步骤(j)中单克隆抗体的VH链的VH链cDNA，其包括步骤 (i)用从VH链cDNA微型库中获得的特定VH链cDNA表达载体和包括来自VL链微型库的VL链cDNA表达载体的混合物共转染恰当的宿主细胞，并在一定条件下使该共转染细胞生长达足够长的时间，以允许该共转染细胞形成能稳定产生抗体的克隆； ( )确定该克隆是否产生特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体；(iii)如果该共转染细胞产生了特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体，则继续进行步骤(k)之(iv)，而如果该共转染细胞不产生单克隆抗体，则使用不同的特定VH链cDNA表达载体来重复步骤(k)之(i)和步骤(k)之(ii)，直到特定VH链cDNA表达载体被鉴定为可产生单克隆抗体；(iv)鉴定产生单克隆抗体的VH链cDNA，并选择用来制备产生特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体的克隆的VH链cDNA表达载体；(1)鉴定编码了如步骤(k)中的单克隆抗体的VL链的VL链cDNA，包括步骤 (i)用在步骤(k)之(iv)中鉴定的VH链cDNA的表达载体和选自VL链微型库的特定 VL链cDNA表达载体共转染恰当的宿主细胞，并在一定条件下使该共转染细胞生长达足够长的时间，以允许该共转染细胞形成能稳定地产生抗体的克隆；( )确定该克隆是否产生特异性地结合特定已知抗原的单克隆抗体； (iii)如果该克隆产生了特异性地结合特定已知抗原的单克隆抗体，则继续进行步骤 (1)之(iv)，而如果该共转染细胞不产生单克隆抗体，则用不同的特定VL链cDNA的表达载体重复步骤⑴之⑴和步骤⑴之(ii)，直到特定的VL链cDNA表达载体被鉴定出产生单克隆抗体；(iv)鉴定编码单克隆抗体的VL链的VL链cDNA，并选择用于制备产生单克隆抗体的克隆的VL链cDNA表达载体；以及(m)用步骤(k)之(iv)鉴定的VH链cDNA的表达载体和用步骤⑴之(iv)鉴定的VL 链cDNA的表达载体共转染恰当的宿主细胞，以制备能够产生特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体的宿主细胞，从而产生结合特定已知抗原的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述特定已知抗原是病原体的抗原。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述病原体是人类免疫缺陷病毒(HIV)。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于动物被人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，并能自发地控制病毒。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述动物是人，而所述单克隆抗体是完全人单克隆抗体。
6.一种根据权利要求1所述方法分离的单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体是完全人单克隆抗体。
8.根据权利要求7所述的单克隆抗体，其特征在于重链可变区(VH)的第三互补决定区包含SEQ ID NO 73到SEQ ID NO :115中的至少一个氨基酸序列。
9.根据权利要求7所述的单克隆抗体，其特征在于轻链可变区(VL)的第三互补决定区包含SEQ ID NO 116到SEQ ID NO :163中的至少一个氨基酸序列。
10.一种鉴定用于治疗或预防由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的疾病的治疗用单克隆抗体的方法，包括(a)从其本身是HIV的罕见病毒控制者或天然病毒抑制者的动物中获得血液样本；(b)确定该血液样本是否包含任何结合特定已知病原体的抗体；(c)从血液样本中分离记忆B细胞；(d)在一定条件下培养分离出的记忆B细胞一定时间，以允许记忆B细胞分化为能稳定生产单克隆抗体的浆细胞；(e)确定浆细胞是否产生特异性结合HIV的单克隆抗体；(f)将由浆细胞产生的单克隆抗体与血液样本中的抗体进行比较；以及(g)如果由浆细胞产生的单克隆抗体与血液样本中的抗体不同，则鉴定并选择由浆细胞产生的该不同的单克隆抗体。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于用如权利要求1所述方法中的步骤(e) 到(m)选择步骤(g)中的浆细胞，并制备能稳定地产生该不同的单克隆抗体的转化宿主细胞克隆。
全文摘要
本发明提供了无需利用杂交瘤细胞技术的人单克隆抗体的制备方法，采用所述的方法制备的抗体，以及采用该抗体治疗和预防病症(如人类免度缺陷病毒的病原体感染)的方法。
文档编号G01N33/569GK102272158SQ200980154443
公开日2011年12月7日 申请日期2009年11月12日 优先权日2008年11月12日
发明者乔治·K·刘易斯, 管永军 申请人:乔治·K·刘易斯, 管永军