人源化抗PD-1及c-MET双特异性抗体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属生物技术领域，具体涉及一种人源化抗ro-1及C-MET双特异性抗体及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]现有技术公开了单克隆抗体已被广泛应用于肿瘤治疗。研究显示，传统的单克隆抗体主要通过招募具有Fe Y受体的免疫效应细胞、激活补体、诱导凋亡、抑制生长因子等机制杀伤肿瘤细胞；然而由于T细胞表面不具有Fe Y受体，所以传统的单克隆抗体无法招募T细胞用于治疗，因而限制了单克隆抗体的治疗效果。
[0003]研究表明，T细胞在肿瘤治疗中具有很重要的作用，诱导动物模型中的T细胞反应可以引起肿瘤消退并抑制肿瘤复发。有研究报道将肿瘤诱导产生的特异性T细胞输回到黑色素瘤患者体内可以有效地防止肿瘤转移。细胞毒细胞T淋巴细胞(CTL)杀伤靶细胞主要经过两个阶段:效-靶细胞结合阶段和细胞裂解阶段，因此，能够桥接T细胞与肿瘤相关抗原(TAA)并介导靶向性细胞毒T淋巴细胞(rCTL)杀伤肿瘤细胞的双特异性抗体具有广阔应用前景。
[0004]T细胞的激活需要双重信号。第一信号(识别信号)来自TCR和抗原肽的结合；第二信号(激活信号)来自协同刺激受体与其配体的结合。其中协同刺激受体包括激活性受体(主要是⑶28)和抑制性受体(包括CTLA-4、PD-1和BTLA等)两种。I3D-1即程序性细胞死亡蛋白I (Programmed cell death proteinl),属于免疫球蛋白超家族成员，表达于活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞，主要参与抑制活化T细胞的免疫应答。
[0005]抗肿瘤药物由于其靶点通常也表达于在正常组织中，容易引起正常组织的毒性反应，因而产生严重的毒副作用。c-MET即肝细胞生长因子受体(HGFR)，由原癌基因c-Met编码，是一种受体酪氨酸激酶(RTK)，在正常组织中几乎没有活性，但在多种肿瘤中通常处于异常激活状态。
[0006]随着计算机科学的迅猛发展，近年来计算机辅助药物设计成为研究与开发新药的崭新技术，明显加快了新药设计的速度和效率。蛋白质结构的不断解析，PDB数据不断增长，为计算机辅助设计蛋白质药物成为可能。基于蛋白质空间结构的蛋白质药物研究倍受重视。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供通过合理选择靶点，筛选、改造、设计、表达并纯化靶向ro-1与c-MET的双特异性人源化抗体及其制备方法。
[0008]本发明的另一目的是提供所述双特异性抗体在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
[0009]本发明通过比对人源抗体库，计算机分子结构模拟、分子对接模拟及序列分析，设计重组人源化抗ro-ι及抗C-MET双特异性抗体分子，包括亲和力成熟、结构优化、人源化及密码子优化，并在优化信号肽序列及质粒表达载体复制子的基础上，构建重组人源化抗PD-1及抗c-MET双特异性抗体的表达质粒。
[0010]更具体的，本发明通过通过比对人源抗体库和计算机分子模拟软件DiscoveryStud1对筛选噬菌体文库得到的抗体序列进行改造，在保持其特异性的同时进行亲和力成熟及人源化改造。通过缺失完整抗体中的某些结构域(如CL、CHl等)设计两种不同的抗体形式(Full Antibody, SMIP Antibody),利用不同长度的连接短肽片段Gly4Ser连接同一特异性的轻链与重链。同时结合计算机分子模拟结果，利用定点突变技术对其Fe区进行改造，应用“Knobs into Holes”技术使具有不同祀向特异性的两条抗体链能够相互作用形成异源二聚体。
[0011]本发明的技术方案通过下述方法和步骤进行:
[0012]I)计算机辅助设计人源化抗ro-1及c-MET双特异性抗体；
[0013]2)双特异性抗体轻链与重链之间连接肽的选择及Fe区的改造，
[0014]利用不同长度的连接短肽片段Gly4Ser连接同一特异性的轻链与重链；同时结合计算机分子模拟结果，利用定点突变技术对其Fe区进行改造，应用“Knobs into Holes”技术使具有不同靶向特异性的两条抗体链能够相互作用形成异源二聚体；
[0015]3)人源化抗ro-Ι及C-MET双特异性抗体的哺乳动物细胞表达表达，
[0016]本发明所述的人源化抗ro-Ι及C-MET双特异性抗体不限于特定的表达系统，包括真核表达系统与原核表达系统；
[0017]4)人源化抗ro-Ι及C-MET双特异性抗体的纯化
[0018]细胞培养上清，上rProteinA亲和层析柱，经0.02M PB (pH7.0)缓冲液平衡，然后用0.1M Glycine-HCl (pH3.0)缓冲液洗脱,收集洗脱峰。冷冻干燥rProteinA亲和层析洗脱峰收集液，冻干粉于低温保存待用；
[0019]5)人源化抗ro-Ι及C-MET双特异性抗体活性测定。
[0020]本发明中，进行了人源化抗ro-Ι及C-MET双特异性抗体的测定实验，包括，I)特异性及亲和力分析测定；2)刺激T细胞增殖及细胞因子分泌；3)体外抑制肿瘤细胞增殖实验；4)体内抑制成瘤实验；以及5)药效学实验；实验结果表明，本发明的人源化抗ro-1及c-MET双特异性抗体同时具备免疫原性低，且制备过程简便、安全，产品得率、纯度、活性高等特性。可进一步制备治疗非小细胞肺癌的特效新药。
【附图说明】
[0021]图1，是Full Antibody瞬时表达的SDS-PAGE电泳鉴定。
[0022]图2，是 Full Antibody 纯化的 SDS-PAGE 电泳鉴定。
[0023]图3，是SMIP Antibody瞬时表达的SDS-PAGE电泳鉴定。
[0024]图4，是 SMIP Antibody 纯化的 SDS-PAGE 电泳鉴定。
[0025]图5，是Full Antibody特异性的流式检测。
[0026]图6，是SMIP Antibody特异性的流式检测。
[0027]图7，是Full Antibody与SMIP Antibody抑制肿瘤细胞c_MET下游信号转导通路激活的Western Blot分析。
【具体实施方式】
[0028]实施例1
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