人gfap抗原表位肽、抗原、抗体、用途及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及人GFAP抗原表位肽、抗原、抗体、用途及试剂盒。本发明的人GFAP抗原表位肽的氨基酸序列，为序列表SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示的序列之一。本发明的GFAP抗原由人GFAP抗原表位肽与蛋白载体偶联制得。本发明的GFAP单克隆抗体或多克隆抗体由本发明的GFAP抗原制得。本发明的GFAP单克隆抗体或多克隆抗体用于制备GFAP体外诊断试剂盒。本发明的人GFAP抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原（免疫原）免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，从而可应用于人GFAP的体外检测。
【专利说明】人GFAP抗原表位肽、抗原、抗体、用途及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于多肽化学和免疫学领域，具体涉及人胶质纤维酸性蛋白（GFAP)抗原表 位肽、用该抗原表位肽制备的GFAP特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体、所述抗 体在制备人GFAP体外诊断试剂盒上的用途，人GFAP体外诊断试剂盒，以及一种用于定量检 测待测物中人GFAP蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，对神经生化标志物的研究已引起许多研究者的注意，寻找一种可靠的、 非侵入性的、能反映中枢神经系统损害范围及预后的生化标志物是众多研究者的共同心 愿。通过对血液和脑脊液（CSF)的研究，目前已经发现一些生化标志物可以用来判断神经 系统的损害范围以及对预后进行预测，这在疾病的早期要优于CT以及MRI等影像学检查。 其中，胶质纤维酸性蛋白（GFAP)就是这样一种生化标志物。
[0003] 胶质纤维酸性蛋白（GFAP)是一种分子量为50_52KDa的酸性蛋白，其属于细胞骨 骼蛋白，是星形细胞的标志蛋白，在星形细胞中有丰富的、唯一的表达。胶质纤维酸性蛋白 是成熟星形胶质细胞特有的中间丝成分，其对神经生理功能和各种病理的发展过程具有重 要的作用。
[0004] 在正常情况下，GFAP受星形胶质细胞的动力调节。损伤后增生的GFAP阳性星形胶 质细胞能促进星形胶质细胞的有丝分裂，并使原始祖细胞分化成为成熟的星形胶质细胞。 各种中枢神经系统损伤均可引起星形胶质细胞反应。星形胶质细胞反应的标志为细胞数增 力口，细胞体肥大，星形胶质细胞分支增多，并且GFAP的表达增强。因此，GFAP可以作为中枢 神经系统损伤范围及预后的生化标志物。此外，GFAP在神经胶质瘤中的表达也会出现异常， 因此其也可以作为反映神经胶质瘤的恶性程度的特异性标志物。
[0005] 研究发现，GFAP与神经系统病理过程(如脑外伤、脑梗死、脑卒中、神经退行性病） 有明显的相关性。当患者的中枢神经系统发生损伤时，GFAP从受损伤的神经胶质细胞中溢 出，进入细胞间液，可溶性的GFAP由细胞间液进入脑脊液，穿过破坏的血脑屏障进入血液 循环。因此，可以由患者血清中的GFAP水平来判断神经系统损伤的病情及预后。
[0006] 检测血清中的GFAP水平的最理想的方法为免疫检测。因此，寻找合适的具有免疫 原性的GFAP抗原表位肽、制备特异性的GFAP抗原及抗体即成为了重点。
【发明内容】
[0007] 为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种人GFAP抗原表位肽， 用该抗原表位肽制备的GFAP特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体，其在制备人 GFAP试剂盒上的用途，以及人GFAP体外诊断试剂盒。
[0008] 具体而言，本发明提供了：
[0009] -种人GFAP抗原表位肽，其中所述GFAP抗原表位肽的氨基酸序列为如下两者之
[0010] (1)Thr-Val-Arg-Gln-Lys-Leu-Gln-Asp-Glu-Thr-Asn-Leu-Arg-Leu-Glu-Ala-Gl u-Asn-Asn-Leu-Ala-Ala-Tyr ；
[0011] (2)Tyr-Gln-Glu-Ala-Leu-Ala-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Gly-Gln-Ser-Leu-Lys-As P〇
[0012] 本发明还提供了一种GFAP抗原，其是通过使所述的人GFAP抗原表位肽（1)与载 体蛋白偶联制备而成的。
[0013] 本发明还提供了一种GFAP抗原，其是通过使所述的人GFAP抗原表位肽（2)与载 体蛋白偶联制备而成的。
[0014] 本发明还提供了一种人GFAP抗体，其是由所述的GFAP抗原制备而成的单克隆抗 体或多克隆抗体，其中所述GFAP抗原是通过使所述的人GFAP抗原表位肽（1)与载体蛋白 偶联制备而成的。
[0015] 本发明还提供了一种人GFAP抗体，其是由所述的GFAP抗原制备而成的单克隆抗 体或多克隆抗体，其中所述GFAP抗原是通过使所述的人GFAP抗原表位肽（2)与载体蛋白 偶联制备而成的。
[0016] 本发明还提供了根据所述的人GFAP抗体在制备人GFAP体外诊断试剂盒上的用 途。
[0017] 本发明还提供了一种人GFAP体外诊断试剂盒，其包含所述的人GFAP抗体作为包 被抗体，其中所述包被抗体优选为单克隆抗体。
[0018] 优选地，所述试剂盒还包含结合抗体，所述结合抗体为所述的人GFAP抗体，并且 该结合抗体优选为多克隆抗体，并且当所述结合抗体来源于所述的人GFAP抗原表位肽（1) 和（2)中的一者时，所述包被抗体来源于所述的人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的另一者。 [0019] 优选地，所述试剂盒还包含酶标记的第二抗体。
[0020] 本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
[0021] 1.本发明的人GFAP抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原）免 疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。
[0022] 2.用本发明制备的GFAP单克隆抗体和多克隆抗体能够高度特异地与血液样本中 的GFAP结合。
[0023] 3.本发明的人GFAP体外诊断试剂盒可以有效地检测血清中的胶质纤维酸性蛋白 GFAP的水平，可用来判断神经系统的损害范围和对预后进行预测。
[0024] 4.本发明将荧光分析技术与快速层析免疫技术相结合，提供了一种用于定量检测 待测物中人GFAP蛋白的荧光免疫层析试纸，用该试纸检测待测物中的人GFAP蛋白，操作简 便、快速，只需10分钟就能完成样品检测，并且检测范围宽、特异性高、灵敏度好，能够迅速 及时地帮助诊断病情，监测预后。
[0025] 5.本发明在制备所述人GFAP蛋白的荧光免疫层析试纸的过程中，通过大量的试 验摸索，优化了各方面的制备条件，使得用本发明的荧光免疫层析试纸进行检测时，荧光信 背比大大提高，从而提高了检测灵敏度和结果可信度；此外，本发明还通过试纸的检测区与 质控区的荧光强度比值的变化来反应样品中GFAP的含量，这与传统的层析技术只考查检 测区的绝对荧光强度相比，最大程度上减少了外界条件和背景等的影响，进一步提高了检 测结果可信度。
【具体实施方式】
[0026] 以下通过【具体实施方式】的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限 制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本 发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
[0027] 一、人GFAP抗原表位肽
[0028] 本文中所述的人GFAP蛋白是本领域已知的，其氨基酸序列是本领域已知的，可以 在NCBI等专业数据库中查到。
[0029] 本发明提供了一种人GFAP抗原表位肽（1)和（2)，其氨基酸序列分别如序列表SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示，为：
[0030] (1)T-V-R-Q-K-L-Q-D-E-T-N-L-R-L-E-A-E-N-N-L-A-A-Y ;和
[0031] (2)Y-Q-E-A-L-A-R-L-E-E-E-G-Q-S-L-K-D。
[0032] 本发明的发明人经过大量的理论研究和实验摸索，最终筛选得到两种具有良好的 抗原性的抗原表位肽。
[0033] GFAP抗原表位肽⑴是人GFAP蛋白N端第150至172位的一段含23个氨基酸的 肽段。
[0034] GFAP抗原表位肽（2)是人GFAP蛋白C端第324至340位的一段含17个氨基酸的 肽段。
[0035] 这两个肽段均具有亲水性、抗原性强并且易于合成的特点。
[0036] 目前，本发明研究发现，本发明的GFAP抗原表位肽具有如下功能：
[0037] 1.具有抗原性；2.与载体蛋白连接后作为免疫原刺激动物产生特异性的抗体； 3.用抗原表位肽制备的抗体可特异性地与人GFAP结合。
[0038] 本发明的GFAP抗原表位肽的制备方法可用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽 自动合成仪，通过固相法合成抗原表位肽。本发明的抗原表位肽（1)和（2)的分子量分别 为2690. 27、1979. 35,可用质谱进行确定，并通过多肽序列测定鉴定所合成的抗原表位肽序 列。肽段的纯度用薄层色谱和高效液相色谱进行评定，并测定抗原表位肽的浓度。
[0039] 二、GFAP 抗原
[0040] 本发明还提供了一种GFAP抗原，其通过使本发明的人GFAP抗原表位肽（1)和 (2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成。具体而言，本发明提供了 GFAP抗原（1)和（2)，所 述GFAP抗原（1)通过使本发明的人GFAP抗原表位肽（1)与载体蛋白偶联制备而成；所述 GFAP抗原（2)通过使本发明的人GFAP抗原表位肽（2)与载体蛋白偶联制备而成。本发明的 GFAP抗原具有免疫原性和特异性，是一种免疫原，可用来免疫动物从而制备特异性的GFAP 抗体。在本发明中，可用的载体蛋白的例子包括KLH(钥孔血蓝蛋白）、牛血清白蛋白（BSA)、 卵清蛋白0VA等。由于KLH (钥孔血蓝蛋白）免疫原性强，结合位点多，免疫效果较好，并且 与免疫动物亲缘关系较远，用其作为载体蛋白不易引起交叉反应，因此是优选的。
[0041] 三、GFAP单克隆抗体、GFAP多克隆抗体和人GFAP体外诊断试剂盒
[0042] 本发明还提供了人GFAP单克隆抗体和人GFAP多克隆抗体，所述抗体可以分别利 用本发明的GFAP抗原（1)和（2)(免疫原）免疫动物制备而得。制备方法可采用本领域的 常规技术，具体可参见实施例2。
[0043] 本发明的GFAP单克隆抗体和多克隆抗体可以用于制备人GFAP体外诊断试剂盒， 该试剂盒可以基于免疫方法对人体组织、细胞或体液中的GFAP进行检测，优选对血液标本 中的GFAP进行检测。
[0044] 因此，本发明提供了 一种人GFAP体外诊断试剂盒，其包含本发明的人GFAP单克隆 抗体或多克隆抗体。
[0045] 目前已知可用于临床检验的免疫实验方法主要包括以下几种：ELISA法、化学发 光法、荧光层析法、胶体金免疫测定法等。
[0046] 而ELISA法包括以下几种类型：双抗体夹心法检测抗原、双抗原夹心法检测抗体、 间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体等。
[0047] 本发明的人GFAP体外诊断试剂盒优选采用ELISA双抗体夹心法来检测GFAP蛋 白。该试剂盒可以包含包被抗体、结合抗体、酶标记的第二抗体和/或必要的工具和试剂 等。
[0048] 优选的是，所述人GFAP体外诊断试剂盒采用本发明的人GFAP单克隆抗体作为包 被抗体。在此，术语"包被抗体"是指包被于固相的酶标板上的抗体。此外，所述人GFAP体 外诊断试剂盒还优选包含人GFAP多克隆抗体以作为结合抗体，其中，当所述结合抗体来源 于本发明的人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的一者时，所述包被抗体来源于所述抗原表位 肽⑴和⑵中的另一者。在此，术语"结合抗体"是指试剂盒中可与待测抗原及酶标记第 二抗体结合的特异性抗体。所述试剂盒还可以包含酶标记的第二抗体，该第二抗体可以为 羊抗兔IgG抗体，所述酶标记可以为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。
[0049] 在本发明的试剂盒中，还可以包含检测所需的任何试剂或工具，例如预包被板、洗 涤液、显色剂、终止液等。
[0050] 四、用于定量检测人GFAP蛋白的荧光免疫层析试纸
[0051] 本发明还提供了一种用于定量检测待测物中人GFAP蛋白的荧光免疫层析试纸， 该试纸通过双抗体夹心法检测所述人GFAP蛋白，其中：
[0052] 所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一 GFAP单克隆抗体作为捕获抗体， 所述第一 GFAP单克隆抗体来源于人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的一者；并且
[0053] 所述双抗体夹心法还采用第二GFAP单克隆抗体作为检测抗体，所述第二GFAP单 克隆抗体来源于人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的另一者；
[0054] 所述人GFAP抗原表位肽（1)和（2)分别为：
[0055] (1)Thr-Val-Arg-Gln-Lys-Leu-Gln-Asp-Glu-Thr-Asn-Leu-Arg-Leu-Glu-Ala-Gl u-Asn-Asn-Leu-Ala-Ala-Tyr ；
[0056] (2)Tyr-Gln-Glu-Ala-Leu-Ala-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Gly-Gln-Ser-Leu-Lys-As P〇
[0057] 在本发明中，在双抗体夹心法荧光免疫层析试纸中，"捕获抗体"是指能够首先特 异性识别待测抗原的抗体，其通常设置在结合垫上；"检测抗体"是指另一种能够特异性识 别待测抗原的抗体，其与捕获抗体分别识别待测抗原分子上的不同的抗原表位，其通常固 定在反应膜的检测区上。
[0058] 在本发明中，所述第一 GFAP单克隆抗体可以由第一 GFAP抗原制备而成，该第一 GFAP抗原可以通过使所述人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的一者与载体蛋白偶联制备而 成；并且所述第二GFAP单克隆抗体可以由第二GFAP抗原制备而成，该第二GFAP抗原可以 通过使所述人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成。
[0059] 在本发明中，可用的载体蛋白的例子包括KLH (钥孔血蓝蛋白）、牛血清白蛋白 (BSA)、卵清蛋白0VA等。由于KLH (钥孔血蓝蛋白）免疫原性强，结合位点多，免疫效果较 好，并且与免疫动物亲缘关系较远，用其作为载体蛋白不易引起交叉反应，因此是优选的。
[0060] 优选地，本发明的荧光免疫层析试纸中所用的荧光微球的粒径为320nm至400nm， 优选为360nm，荧光微球上的荧光物质可为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰 酸罗丹明或X-罗丹明等，其中优选为X-罗丹明（可购自上海晶纯公司）。荧光微球的微球 材料可以为由聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚 物，其它单体的例子为苯乙烯等。突光微球的激发波长可以为350?600nm，优选为390nm ; 发射波长可以为500?700nm，优选为615nm。
[0061] 在本发明中，荧光微球的最大激发波长与发射波长差值较大，说明荧光微球有较 大的斯托克斯（Stokes)位移，这样，荧光试纸的背景干扰较低，以该微球做免疫层析标记物 有较强的优势。
[0062] 在一个具体的实施方案中，本发明的荧光免疫层析试纸具有底板，并且在该底板 上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置有：样品垫、结合垫、反应膜、吸水滤纸，所述样 品垫用于在使用时加载待测样品，所述结合垫设置有所述的标记有荧光微球的第一 GFAP 单克隆抗体，所述反应膜包括检测区和质控区，所述检测区包被有所述第二GFAP单克隆抗 体，所述质控区包被有能与所述的标记有荧光微球的第一 GFAP单克隆抗体特异性结合的 抗抗体。
[0063] 优选地，本发明的荧光免疫层析试纸的样品垫、结合垫、反应膜、吸水滤纸可以沿 使用时的层析方向依次搭接设置在底板上。反应膜上间隔设置的检测区和质控区可以为， 但不限于，线、带、块等形式，检测区和质控区优选间隔3mm至8mm。
[0064] 在本发明中，反应膜优选为在大于550nm的波长下基本上不发荧光的硝酸纤维素 膜。此外，底板优选基本上不具有荧光性质。
[0065] 通常，常规的层析试纸组件(反应膜、底板等)在550nm波长下具有较明显的荧光背 景，这对荧光信号的检测产生很大干扰。本发明通过采用在大于550nm的波长下基本上不 发荧光的硝酸纤维素膜和低荧光性质的底板，从而克服了常规荧光试纸的缺陷。此外，本发 明所用的荧光物质X-罗丹明可产生较强的荧光信号，从而进一步大大提高了荧光信背比， 使得能够很好地区分信号和背景，进而提高检测灵敏度。
[0066] 在本发明中，样品垫和结合垫的材料可采用本领域通常使用的材料，例如，样品垫 和结合垫可以为玻璃纤维。
[0067] 本发明所采用的能与标记有荧光微球的第一 GFAP单克隆抗体特异性结合的抗抗 体可以为羊抗鼠 IgG单克隆抗体或兔抗鼠 IgG单克隆抗体，其中优选为羊抗鼠 IgG单克隆 抗体，与多克隆抗体相比，单克隆抗体特异性更高。
[0068] 在一个具体的实施方案中，本发明的荧光免疫层析试纸在使用时，在样品垫上滴 加样品液(如含有GFAP的血样)，在毛细管作用下，样品液向吸水滤纸一端移动，在结合垫处 与所述的标记有荧光微球的第一 GFAP单克隆抗体形成免疫复合物，该免疫复合物进一步 移动，在检测线上与所述第二GFAP单克隆抗体结合形成双抗体夹心的免疫复合物，而未形 成免疫复合物的标记有荧光微球的第一 GFAP单克隆抗体则与质控线上的抗抗体结合。此 过程需要10分钟至15分钟，之后，用荧光检测仪进行检测，如果质控线处未出现条带，则说 明试纸失效；如果质控线处出现条带，而检测线处未出现条带，则说明样品中不含人GFAP 蛋白；如果在质控线和检测线上均出现条带，则说明样品中含有人GFAP蛋白。
[0069] 在另一个方面，本发明提供了一种制备用于定量检测待测物中人GFAP蛋白的荧 光免疫层析试纸的方法，其包括以下步骤：
[0070] 1)提供标记有突光微球的第一 GFAP单克隆抗体；
[0071] 2)提供结合垫，其中在所述结合垫上包被所述的标记有荧光微球的第一 GFAP单 克隆抗体；
[0072] 3)提供反应膜，其中在所述反应膜上沿使用时的层析方向间隔固定第二GFAP单 克隆抗体和抗抗体，以分别形成检测区和质控区；和
[0073] 4)在底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置样品垫、所述结合垫、所述 反应膜、吸水滤纸，从而制成所述荧光免疫层析试纸。
[0074] 本发明的方法还可以包括将制成的荧光免疫层析试纸切割成适当宽度的步骤5)。
[0075] 本发明的发明人通过大量的试验摸索，优化了制备本发明的用于检测人GFAP蛋 白的荧光免疫层析试纸的方法的各个步骤的条件，从而使得本发明的荧光免疫层析试纸能 够针对人GFAP蛋白获得符合临床检测要求的结果，S卩，检测范围宽、特异性高、灵敏度好。
[0076] 因此，优选的是，在本发明的方法中，所述步骤1)包括：
[0077] a)用碳二亚胺活化荧光微球，优选地，将荧光微球的水分散液或MES缓冲液分散 液经超声波处理并与碳二亚胺混合，从而活化所述荧光微球；
[0078] b)洗涤步骤a)所获得的活化的荧光微球，优选地，将步骤a)所获得的活化的荧光 微球用N-羟基硫代琥珀酰亚胺-柠檬酸缓冲液洗涤、分散，并经超声波处理；
[0079] c)用步骤b)所获得的荧光微球标记第一 GFAP单克隆抗体，优选地，将步骤b)所 获得的荧光微球与第一 GFAP单克隆抗体混合，用BSA-乙醇胺缓冲液封闭，离心，用BSA-吐 温水溶液分散，经超声波处理，从而得到标记有荧光微球的第一 GFAP单克隆抗体。
[0080] 在本发明的一个具体的实施方案中，所述步骤1)包括：
[0081] a)取1 (w/v)%的突光微球水分散液，lOOOOrpm至15000rpm低温(例如10°C )离心 5至10分钟，去上清，将沉淀物分散到500 μ 1的蒸馏水或初洗缓冲液（0. 1M的MES水溶液） 中，超声波（240W)处理1至2分钟，重复以上过程三次，加入碳二亚胺10mg至50mg，搅拌 10?15分钟，从而活化所述突光微球；
[0082] b)洗涤步骤a)所获得的活化的荧光微球，优选地，将步骤a)所获得的活化的荧光 微球在lOOOrpm至15000rpm下离心5至10分钟，将沉淀物分散到lml偶联缓冲液（20? 100mM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺-柠檬酸缓冲液)）中，超声波（240W)处理1至2分钟，重 复以上过程二次；
[0083] c)用步骤b)所获得的荧光微球标记第一 GFAP单克隆抗体，优选地，按照1μ 1至 3 μ 1抗体（8mg/ml) /100 μ 1所述活化的荧光微球的比例，将步骤b)所获得的荧光微球与 第一 GFAP单克隆抗体混合，室温（25°C )下搅拌1. 5?3小时(优选2小时)，加入lml封闭 缓冲液（1 (w/v)%BSA-〇. 05M乙醇胺)，继续搅拌1小时，在lOOOOrpm至15000rpm下离心5至 10分钟，重复离心3次，将沉淀物分散到500 μ 1终洗缓冲液（0. 5 (w/v) %BSA-〇. 11 (v/v) %吐 温水溶液）中，超声波（240W)处理1至2分钟，用所述终洗缓冲液定容至500 μ 1。
[0084] 优选地，在本发明的方法中，所述步骤2)包括：将标记有荧光微球的第一 GFAP单 克隆抗体用抗体稀释液（l%(w/v)BSA-〇. 01MPBS(pH7. 2)缓冲液)进行稀释，以稀释至0. 5? 2mg/ml，优选为lmg/ml，然后用微量移液器均匀喷涂在结合垫上，之后烘干或真空冷冻干 燥。在本发明的方法的步骤2)中，所述的标记有荧光微球的第一 GFAP单克隆抗体的包被 浓度为〇. 5?2mg/ml，优选为lmg/ml。
[0085] 优选地，所述步骤3)包括：用喷金机将所述第二GFAP单克隆抗体和抗抗体划到硝 酸纤维素膜（固相载体)上以作为检测区和质控区，使检测区和质控区的间隔为3_至8_， 所述第二GFAP单克隆抗体和所述抗抗体的浓度分别为0. 5?2mg/ml，优选为lmg/ml。
[0086] 优选地，结果检测利用专用的荧光检测仪(可购自深圳市安群生物工程有限公司， 型号AQ-3000)对质控区和检测区进行检测，检测区与质控区荧光强度的比值和待测样品中 的GFAP的含量成正比。采用检测区与质控区荧光强度的比值而不是直接采用检测区的绝 对荧光值可尽可能地减少反应条件、基质等的影响，并尽量避免背景干扰。
[0087] 以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为 对本发明的保护范围的限制。
[0088] 实施例
[0089] 除非另有说明，以下所述溶液均为水溶液，溶液中的百分数均为体积百分数。
[0090] 实施例1 :GFAP抗原表位肽⑴和⑵的制备。
[0091] 制备方法用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法分别 合成GFAP抗原表位肽（1)和（2)。抗原表位肽的纯度用高效液相色谱进行评定，并测定肽 段的浓度。本发明的抗原表位肽（1)和（2)的分子量分别为2690. 27U979. 35,利用质谱进 行确定，通过多肽序列测定鉴定所合成的多肽序列。
[0092] -、GFAP抗原表位肽（1)和（2)的合成
[0093] 上述肽段采用固相法合成。固相肽合成的主要思想是：先将所要合成肽链的羧基 末端氨基酸的羧基以共价键形式同一个不溶性的高分子化合物（树脂）相连接，然后以此 结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份，经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组份 反应，接长肽链。这样的步骤可以反复地多次进行下去，最后达到所需要合成的肽链的长 度。这个合成过程如下所示。
[0094]
【权利要求】
1. 一种人GFAP抗原表位肽，其中所述GFAP抗原表位肽的氨基酸序列为如下两者之 (1) Thr-Val-Arg-Gln-Lys-Leu-Gln-Asp-Glu-Thr-Asn-Leu-Arg-Leu-Glu-Ala-Glu-As n-Asn-Leu-Ala-Ala-Tyr ； (2) Tyr-Gln-Glu-Ala-Leu-Ala-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Gly-Gln-Ser-Leu-Lys-Asp 〇
2. -种GFAP抗原，其是通过使权利要求1所述的人GFAP抗原表位肽（1)与载体蛋白 偶联制备而成的。
3. -种GFAP抗原，其是通过使权利要求1所述的人GFAP抗原表位肽（2)与载体蛋白 偶联制备而成的。
4. 一种人GFAP抗体，其是由权利要求2所述的GFAP抗原制备而成的单克隆抗体或多 克隆抗体。
5. -种人GFAP抗体，其是由权利要求3所述的GFAP抗原制备而成的单克隆抗体或多 克隆抗体。
6. 根据权利要求4或5所述的人GFAP抗体在制备人GFAP体外诊断试剂盒上的用途。
7. -种人GFAP体外诊断试剂盒，其包含权利要求4或5所述的人GFAP抗体作为包被 抗体，其中所述包被抗体优选为单克隆抗体。
8. 根据权利要求7所述的人GFAP体外诊断试剂盒，其中所述试剂盒还包含结合抗体， 所述结合抗体为权利要求4或5所述的人GFAP抗体，并且该结合抗体优选为多克隆抗体， 并且当所述结合抗体来源于所述的人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的一者时，所述包被抗 体来源于所述的人GFAP抗原表位肽（1)和（2)中的另一者。
9. 根据权利要求8所述的人GFAP体外诊断试剂盒，其中所述试剂盒还包含酶标记的第 二抗体。
【文档编号】G01N33/68GK104140464SQ201310173533
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2013年5月10日 优先权日:2013年5月10日
【发明者】朱建安 申请人:深圳市安群生物工程有限公司