单克隆抗体的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于单克隆抗体技术领域，具体涉及一种单克隆抗体的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]抗体的主要功能是与抗原(包括外来的和自身的)相结合，从而有效地清除侵入机体内的微生物、寄生虫等异物，尤其是单克隆抗体，由于其高度均一、针对某一特定抗原表位，因此，广泛用于免疫学分析、放射免疫显像和免疫导向治疗等领域。
[0003]单克隆抗体的发展经历了四个阶段，分别为:鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。
[0004]鼠源性单克隆抗体:鼠杂交瘤单克隆抗体主要是将来源于免疫接种过的小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞融合，继而筛选出既能无限增殖又能分泌抗体的鼠杂交融合细胞，进而进行筛选、抗体制备和抗体纯化。
[0005]嵌合性单克隆抗体:指用人的恒定区取代小鼠的恒定区，保留鼠单抗的可变区序列，形成一个人-鼠杂合的抗体。其研制程序快，可大幅度降低异源抗体的免疫原性，却几乎保持亲本鼠单抗全部的特异性和亲和力。另外，它还具有人抗体的效应功能，如补体固定、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)等。
[0006]人源化单克隆抗体:利用现有的无数已详细分析过的小鼠抗体，取其与抗原直接接触的那段抗体片段(互补决定区，CDR)与人的抗体框架嫁接，经亲和力重塑，可维持其特异性和大部分的亲和力，同时几乎去除免疫原性和毒副作用。
[0007]全人源单克隆抗体:其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。全人源抗体制备的相关技术主要有:人杂交瘤技术、EBV转化B淋巴细胞技术、噬菌体显示技术、转基因小鼠抗体制备技术和单个B细胞抗体制备技术等。
[0008]由人源化和全人源抗体制备的人源化和全人源抗体药物因其具有高亲和力、高特异性、毒副作用小的特点，克服了动物源抗体及嵌合抗体的各种缺点，已经成为了治疗性抗体药物发展的必然趋势。
[0009]CN103045607A (公开日为2013年04月17日)公开了一种传染病病原体全人源化抗体的制备方法，包括以下步骤:(I)传染病病原体抗原的制备:以常规方法在真核或原核细胞中生产并纯化重组传染病病原体抗原蛋白；(2)抗体的标记:将上步纯化的重组传染病病原体抗原蛋白以荧光或生物素标记；(3)B细胞的获取、富集与纯化:从传染病患者或疫苗免疫者外周血分离单核的B细胞，采用密度梯度离心纯化；(4)标记抗原与特异性B细胞的结合:将步骤(2)中标记的重组传染病病原体抗原蛋白与步骤(3)中的B细胞进行特异性结合；(5)抗原特异性B细胞的获取:根据标记，以流式细胞仪筛选、分离出上步中抗原特异性的单个B细胞，即单个标记的B细胞；(6)扩增抗体可变区基因:采用特异性的混合引物，应用单细胞巢式RT-PCR从所述单个标记的B细胞中克隆轻链和重链的可变区基因；
(7)构建表达载体:将上步所克隆的轻链和重链可变区基因插入包含人轻链和重链恒定区基因的载体，构建人源抗体真核高效表达载体，成功连接后转化活化的大肠杆菌株，培养含有正确克隆的细菌，离心收集细菌并采用质粒DNA纯化试剂盒纯化表达载体DNA ； (8)重组抗体表达与纯化:以上步纯化后的表达载体DNA转染真核细胞，培养使其获得表达后经分离纯化得重组抗体。
[0010]虽然上述现有技术公开了一些传染病病原体全人源化抗体的制备方法，能够满足一定的需要，但这些仍存在一定的缺陷:获得的重组抗体浓度偏低，成本高，不适合工业上的大规模生产应用。
[0011]因此，对于传染病病原体全人源化单克隆抗体存在进一步的优化需求，这也是该技术领域内的研宄热点和重点之一，更是本发明得以完成的动力和出发点所在。
【发明内容】
[0012]为了克服现有技术存在的传染病病原体全人源化单克隆抗体浓度偏低的技术问题，本发明人在进行了大量的深入研宄之后，从而完成了本发明。
[0013]本发明涉及两个方面，具体而言，涉及一种单克隆抗体的制备方法及应用。
[0014]第一方面，本发明涉及一种单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤:
[0015]步骤一，B细胞的获取、富集与纯化:从传染病患者外周血分离单核的B细胞，采用密度梯度离心纯化；
[0016]步骤二，标记抗原与特异性B细胞的结合:将以荧光或生物素标记标记的传染病病原体抗原蛋白与步骤一中的B细胞进行特异性结合；
[0017]步骤三，抗原特异性B细胞的获取:根据标记，以流式细胞仪筛选分离出上一步骤中抗原特异性的单个B细胞，即单个标记的B细胞；
[0018]步骤四，扩增抗体可变区基因:采用特异性的混合引物，应用单细胞巢式RT-PCR从所述单个标记的B细胞中克隆轻链和重链的可变区基因；
[0019]步骤五，构建表达载体:将上一步骤所克隆的轻链和重链可变区基因插入包含人轻链和重链恒定区基因的载体，构建人源抗体真核高效表达载体，成功连接后转化活化的大肠杆菌株，培养含有正确克隆的细菌，离心收集细菌并采用质粒DNA纯化试剂盒纯化表达载体DNA ；
[0020]步骤六，重组抗体表达与纯化:以纯化后的表达载体DNA转染对数生长期的293T细胞，离心除去细胞碎片，离心液采用蛋白G柱纯化，装柱后用两轮PBS洗涤，用0.3-0.45mol/L的柠檬酸钠溶液洗脱，获得重组抗体溶液。
[0021]优选的，所述柠檬酸钠的浓度为0.33-0.40mol/Lo
[0022]进一步优选的，所述柠檬酸钠的浓度为0.37mol/Lo
[0023]第二方面，本发明涉及上述单克隆抗体在特异性中和丙型肝炎El抗原方面的应用，比如制备预防和治疗丙型肝炎的药物。
[0024]与现有技术相比，本发明的有益效果如下:本发明提供的重组抗体溶液的重组抗体浓度为376ng/mL，而CN103045607A中经过实际检测为198ng/mL，本发明的重组抗体浓度升高显著，降低了成本，适合工业上的大规模生产应用。
【具体实施方式】
[0025]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。