[0026]下述实施例涉及丙型肝炎病毒El蛋白人源单克隆抗体的制备，由如下步骤组成:
[0027]步骤一，丙型肝炎病毒El蛋白是病毒的主要保护性抗原，针对El蛋白的中和性单克隆抗体可用于丙型肝炎和肝癌患者的治疗，筛选克隆丙肝病毒El中和性单克隆抗体具有重大的临床应用价值；首先挑选了 23个丙型肝炎康复患者用于筛选中和单克隆抗体，经过对这23个丙型肝炎患者血清中和抗体的筛选，其中的一例患者的血清试验证明可以中和97%以上的中国丙型肝炎Ib和2a的假病毒株，最终确定从这例患者中筛选丙型肝炎病毒高度保守的中和抗体，于是从这例患者的外周血采用密度梯度离心分离纯化单核细胞；
[0028]步骤二，重组El抗原蛋白在真核或原核细胞中采用常规方法生产纯化，纯化后的El抗原蛋白直接耦合到荧光素异硫氰酸酯(FITC)，之后在低温下与B细胞特异性的结合，最后以流式细胞仪分离单个标记的B细胞于96孔板中；
[0029]步骤三，RT-PCR扩增重链和轻链的可变区基因:cDNA合成在96孔板15ul反应体系中进行，采用150纳克的随机六聚体引物，0.5微升的1mM的dNTP混合物，及50U逆转录酶，反转录反应在42°C下进行10分钟，25°C下为10分钟，50°C 60分钟，最后94°C 5分钟；IgH，Ig λ和Ig K轻链可变区基因采用巢式PCR分别扩增，PCR反应在96孔板50微升体系中，每孔含20ηΜ的每个引物或引物组合(所用系列引物参见专利文献CN103045607A中的表I所示)，300nM dNTP和1.2U HotStar Taq DNA聚合酶，巢式PCR扩增45个循环，940C 30 秒，590C 30 秒，72°C下为 55 秒；
[0030]步骤四，进行人源抗体瞬时表达载体的构建:在克隆之前，PCR产物首先采用PCR纯化试剂盒进行纯化，之后采用相应的限制性内切酶消化，之后克隆入含有多克隆位点的Igy，IgK或IgA轻链的恒定区的载体中，连接反应的总体积为10微升，含IU T4DNA连接酶、7.5微升纯化的PCR产物和25ng的线性化载体；成功连接后转化活化的大肠杆菌株，正确克隆的鉴定采用PCR扩增法，根据预期片段大小确定克隆的成功与否，含有正确克隆的细菌在培养液中培养16小时，离心收集细菌采用质粒DNA纯化试剂盒纯化DNA ；
[0031]步骤五，重组抗体的高效表达与纯化:采用磷酸钙共沉淀法瞬时转染对数生长期的293T细胞，20微克的表达载体DNA与CaCl2混合至终浓度250mM，孵育室温下搅拌10分钟，之后沉淀混合物均匀地分布于培养皿中，12小时后，用1ml无血清DMEM洗涤细胞，然后收集上清液，并用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析重组抗体的抗原特异性，离心除去细胞碎片，重组抗体采用蛋白G珠纯化，每25毫升细胞培养上清液中加入25 μ I蛋白G珠，在4°C的条件下旋转14小时，离心后去除上清液，将蛋白G珠装柱后用两轮PBS洗涤，用0.37mol/L的柠檬酸钠洗脱重组抗体，之后采用ELISA方法测定重组抗体的浓度，其浓度为376ng/mL(CN103045607A中的制备方法获得的重组抗体经过相同方法检测为198ng/mL)。另外，经病毒中和活性实验测定，本发明方法获得的单克隆抗体中和谱与同一丙肝病人血清的一致，证明本发明获得的单克隆抗体能够特异性中和丙型肝炎El抗原，因此，本发明获得的单克隆抗体可以用于制备预防和治疗丙型肝炎的药物。
[0032]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
【主权项】
1.一种单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一，B细胞的获取、富集与纯化:从传染病患者外周血分离单核的B细胞，采用密度梯度离心纯化； 步骤二，标记抗原与特异性B细胞的结合:将以荧光或生物素标记的传染病病原体抗原蛋白与步骤一中的B细胞进行特异性结合； 步骤三，抗原特异性B细胞的获取:根据标记，以流式细胞仪筛选分离出上一步骤中抗原特异性的单个B细胞，即单个标记的B细胞； 步骤四，扩增抗体可变区基因:应用单细胞巢式RT-PCR从所述单个标记的B细胞中克隆轻链和重链的可变区基因； 步骤五，构建表达载体:将上一步骤所克隆的轻链和重链可变区基因插入包含人轻链和重链恒定区基因的载体，构建人源抗体真核高效表达载体，再转化活化的大肠杆菌株，培养含有正确克隆的细菌，离心收集细菌并采用质粒DNA纯化试剂盒纯化表达载体DNA ； 步骤六，重组抗体表达与纯化:以纯化后的表达载体DNA转染对数生长期的293T细胞，离心除去细胞碎片，离心液采用蛋白G柱纯化，装柱后用两轮PBS洗涤，用0.3-0.45mol/L的柠檬酸钠溶液洗脱，获得重组抗体溶液，即可。
2.如权利要求1所述的一种单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述柠檬酸钠的浓度为 0.33-0.40mol/Lo
3.如权利要求2所述的一种单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述柠檬酸钠的浓度为 0.37mol/Lo
4.权利要求1-3任一项所述制备方法获得的单克隆抗体在制备预防和治疗丙型肝炎药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种单克隆抗体的制备方法及其应用，所述制备方法包括以下步骤：步骤一，B细胞的获取、富集与纯化；步骤二，标记抗原与特异性B细胞的结合；步骤三，抗原特异性B细胞的获取；步骤四，扩增抗体可变区基因；步骤五，构建表达载体；步骤六，重组抗体表达与纯化：以纯化后的表达载体DNA转染对数生长期的293T细胞，离心除去细胞碎片，离心液采用蛋白G柱纯化，获得重组单克隆抗体溶液。本发明获得的重组单克隆抗体浓度升高显著，降低了成本，适合工业上的大规模生产应用。本发明获得的单克隆抗体能够特异性中和丙型肝炎E1抗原，可以用于制备预防和治疗丙型肝炎的药物。
【IPC分类】C07K16-10, C12N15-85, A61K39-395, A61P31-14
【公开号】CN104830902
【申请号】CN201510218959
【发明人】谢应波, 张庆, 张华 , 徐肖冰, 罗桂云
【申请人】上海泰坦科技股份有限公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年4月30日