利用人工合成mv2序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法
【技术领域】 [0001] 本发明涉及一种培育甘蔗抗病品种的方法，具体涉及一种利用人工合 成MV2序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，属于生物。
【背景技术】 [0002] 甘鹿（Saccharumofficinarum)是最重要的糖料作物，鹿糖占我国食 糖总产的90%以上。甘蔗花叶病是蔗区普遍发生的病害，主要通过破坏甘蔗叶片的叶绿 体，使光合作用下降，光合产物减少导致产量和蔗糖分下降。该病病原主要为甘蔗花叶病 毒（SugarcaneMosaicVirus，SCMV)和高梁花叶病毒（SorghumMosaicVirus,SrMV)，属 马铃薯Y病毒属（Potyvirus)成员，为单链正义RNA病毒，基因组结构简单，编码10个 成熟蛋白，从N端到C端依次为：第一蛋白（P1)、辅助成分-蛋白酶（helpercomponent proteinase，HC-pro)、第三蛋白（P3)、第一个6K蛋白（6K1)、柱状内含体蛋白（cylindrical inclusionprotein,CI)、第二个 6K蛋白（6K2)、病毒的末端结合蛋白（ViralProtein Genome-linked，VPg)、核内含体a蛋白（NuclearInclusionaprotein，NIa)、核内含体b蛋 白（NuclearInclusionbprotein,Nib)和外壳蛋白（CoatProtein,CP) 〇
[0003] 由于导致甘蔗花叶病的两个Potyvirus成员病毒均有多个不同的病毒株系，在 1997年已报道至少存在7个株系，其中SrMV有4个，ScMV有3个株系，这些不同株系的病 毒均可引起甘蔗花叶病的发生。多年来，研宄者先后将单一的CP及HC全序列基因导入到 甘蔗中，并获得了转基因甘蔗，对甘蔗花叶病的抗性明显提高。但这种单一病毒株系CP及 HC全序列基因获得的抗性对其它病毒株系抗性不足，同时，研宄表明，蔗区中花叶病毒的优 势株系在自然条件下也会发生变化，并产生新的株系。因此，培育抗多株系花叶病毒的甘蔗 品种势在必行。
[0004] RNAi技术是在真核生物体内发生的、基于核酸序列同源性的一种基因表达调控机 制。即双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)被Dicer降解为 21_26nt的小干扰RNA，而 后者指导同源RNA进行识别和切割，导致靶标mRNA的降解，从而造成基因沉默。并且，引发 RNAi的片段并不需要完整的基因序列，可以是多个病毒的不同基因片段的嵌合体，因此， RNAi针对的靶标基因也可以是多个不同病毒的基因片段。为此，我们采用RNAi技术，将收 集到的ScMV各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分别进行多序列比对， 并从多序列比对结果中分别选出两条100%同源的序列区段，采用人工合成的方式串联在 一起，作为RNAi(RNAinterference)干扰片段，构建反向重复序列，得到一个RNAi载体。通 过基因枪轰击法遗传转化甘蔗，以获得具有沉默病毒基因表达效果的转基因甘蔗。
[0005] 专利号为ZL20071009226. 8的发明专利"利用SrMV-Pl基因培育抗花叶病甘蔗品 种的方法"，介绍了一种利用SrMV-Pi基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括SrMV-P i基因 的克隆、抗花叶病甘蔗转Pi基因植物表达载体的构建、抗甘蔗花叶病转P:基因材料的培育 以及抗病高产高糖转基因甘蔗新材料的筛选鉴定。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种利用人工合成序列MV2培育抗花叶病甘蔗品 种的方法。针对现有蔗区甘蔗花叶病严重的问题，人工合成可同时沉默甘蔗花叶病毒和高 粱花叶病毒的新型核酸序列，构建RNAi载体，通过基因枪轰击法进行遗传转化，获得对花 叶病高抗的转基因甘蔗。
[0007] 本发明的目的是通过以下方法实现的。
[0008] 本发明的利用人工合成MV2序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MV2序列的 人工合成、RNAi干扰载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定；其特征在 于：
[0009] (1)MV2序列的人工合成：
[0010] 从ScMV和SrMV核酸序列中选取若干区段串联在一起，获得MV2序列，同时在正义 链5'端加入XbaI和XhoI酶切位点，反义链5'端加入ClaI和KpnI酶切位点，采用 人工合成的方式，获得目的片段A，其序列如下：
[0011] gatctagactcgaggacccaaaaattgtggatttgccgcgtagatttaggcgcaatgtac aatatctcagctacgcatcaaatatcaaatttagtgcagaaaagtcgagatctttaaccgtgagaaaaag cgtagatttaggcgctgtttacaatatatcagctacgcatctaatatcagatttagtgcagaagtcgcaa catgcactctctgttgggagtgcagcagcaccactagggtaccatcgata
[0012] 所述从ScMV和SrMV核酸序列中选取若干区段串联在一起，指分别将收集到的 ScMV各个病毒株系的核酸序列和SrMV各个病毒株系的核酸序列分别进行多序列比对，从 中分别各选取2条长度大于21bp，且100%同源的序列区段串联在一起，共223bp，为目标 RNAi干扰序列。
[0013](2) RNAi干扰载体构建：
[0014] (a)目的片段I的获得：利用限制性内切酶KpnI和XhoI将目的片段A进行酶 切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段I;目的片段I的序列为序列 表中SEQID N0:2所示的核苷酸序列；
[0015] (b)目的片段II的获得：将pHANNIBAL载体质粒DNA用限制性内切酶Kpn I和Xhol 进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段II，目的片段II的序列 为序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列；
[0016] (c)中间载体B的获得：将回收的目的片段I和目的片段II用T4-DNA连接酶进行 连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5 a中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体B ;所述中 间载体B是指将目的片段I插入到pHANNIBAL载体后获得的载体；
[0017] ⑷目的片段III的获得：提取中间载体B的质粒DNA，并用限制性内切酶ClaI和 Xbal进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段III;目的片段III 的序列为序列表中SEQIDN0:4所示的核苷酸序列；
[0018] (e)目的片段IV的获得：将目的片段A用限制性内切酶ClaI和XbaI进行酶切， 将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段IV;目的片段IV的序列为序列表 中SEQID N0:5所示的核苷酸序列；
[0019] (f)中间载体C的获得：将回收的目的片段III和目的片段IV用T4-DNA连接酶进行 连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5a中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体C;所述中 间载体C是指将目的片段IV插入到中间载体B后获得的载体；
[0020] (g)目的片段V的获得：提取中间载体C的质粒DNA，并用限制性内切酶NotI进 行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段V;目的片段V的序列为 序列表中SEQIDN0:6所示的核苷酸序列；
[0021] (h)目的片段VI的获得：将植物表达载体pGreenII0229质粒DNA用限制性内切酶 NotI进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段VI;目的片段VI的序列为序列表中SEQIDN0:7所示的核苷酸序列；
[0022] ⑴抗甘蔗花叶RNAi干扰载体pG0229i-MV2的获得：将回收的目的片段V和目的 片段VI用T4-DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5 a中，挑取阳性克隆 验证，获得可用于遗传转化甘蔗受体材料的RNAi干扰载体pG0229i-MV2 ;
[0023] (3)抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定：提取构建完成的RNAi干扰载 体pG0229i-MV2质粒DNA，用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，并将其定量至1yg/y1， 基因枪轰击法遗传转化甘蔗，分子检测获得阳性转基因植株，并进行抗病转基因甘蔗的抗 病性鉴定。
[0024]所述pHANNIBAL载体、pGreenII0229载体、大肠杆菌DH5a，均由商业购买获得。
[0025] 利用本发明的人工合成MV2序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，在人工接种条件 下，分别接种了属于ScMV株系的ScMV-A，B和属于SrMV株系的SrMV-H共3个株系，对照发 病率分别达到了 88.6%、82. 3%和90. 1%，而转基因甘蔗均无发病，说明转入人工合成的 MV2基因后提高了甘蔗抗多种花叶病毒的能力。采用本发明的方法筛选获得的转基因植株， 都具有抗性广谱、抗病性好、抗性持久及生物安全性高的特点。
[0026] 本发明的优点和有益效果：
[0027] 1.本发明获得的植物表达载体采用了RNAi技术，使得甘蔗抗病毒育种摆脱了对 抗源基因的依赖。
[0028] 2.本发明人工合成的核酸序列包含2段与ScMV各病毒株系核酸序列100%同源 和2段与SrMV各病毒株系核酸序列100%同源的序列区段，作为RNAi序列，获得的转基因 植株，具有抗性广谱、抗病性好、抗性持久及生物安全性高等特点。
[0029] 3.本发明获得的RNAi干扰载体用于转基因甘蔗，可以有效地缩短甘蔗抗花叶病 育种周期。
【附图说明】 [0030] 图1为构建完成的pG0229i-MV2质粒图谱。
【具体实施方式】 [0031] 为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以 说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂和生物材料如 无特殊说明均可从商业途径获得。
[0032] 实施例一：构建抗甘蔗花叶病的RNAi干扰载体
[0033] 构建抗甘蔗花叶病的RNAi干扰载体的方法，包括以下步骤：
[0034] 1、MV2序列的人工合成：
[0035] 将收集到的ScMV各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分别进行 多序列比对，从中分别选取2条长度大于21bp且100%同源的序列区段，然后将选取出来的 4条序列区段采用人工合成的方式串联在一起，共223bp，即为目标RNAi干扰序列；同时在 拟人工合成序列的正义链5'端加入XbaI和XhoI酶切位点，反义链5'端加入ClaI和 KpnI酶切位点，人工合成获得目的片段A;所述目的片段A是指在目标RNAi干扰序列的正 义链5'端和反义链5'端加入酶切位点后的核苷酸序列；人工合成后，目的片段A的序列 为序列表