利用人工合成mv3序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种培育甘蔗抗病品种的方法，具体涉及一种利用人工合成MV3序列 培育抗花叶病甘蔗品种的方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 甘蔗花叶病是一种世界性病害，对南、北美洲甘蔗产量的影响达30 %~40 %，严 重时可达60 %~80%，对南非甘蔗产量的影响达10 %~50%，对印度甘蔗产量的影响 达10%~15%，在我国蔗区也普遍发生，华南各地区尤其是广西旱地甘蔗花叶病的发病 株率达到30%以上，产量损失3%~50%。该病病原主要为甘蔗花叶病毒（Sugarcane Mosaic Virus, ScMV)和高梁花叶病毒（Sorghum Mosaic Virus, SrMV)，属马铃暮 Y 病毒属 (Potyvirus)成员，为单链正义RNA病毒，基因组结构简单，编码10个成熟蛋白，分别为Pl、 HC-pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、Nib和CP。研宄者先后将单一的CP及HC全序列基因 导入到甘蔗中，并获得了对甘蔗花叶病的抗性明显提高的转基因甘蔗。但研宄表明，蔗区中 花叶病毒的优势株系在自然条件下也会发生变化，并产生新的株系。目前，世界蔗区至少存 在有7个ScMV和SrMV病毒株系，包括属于ScMV的株系ScMV-A，B，D，E和属于SrMV的株系 SrMV-H，I，M。因此，仅以单一株系的花叶病毒的单一基因为靶标的转基因改良显然无法应 对蔗区病原株系多样化、复杂化以及优势株系的变化。
[0003] RNA干扰（RNA interference，RNAi)是指内源性或外源性双链 RNA (double-stranded RNA，dsRNA)介导的同源mRNA发生特异性降解，导致革E1基因的表达 沉默从而产生相应的功能表型的缺失现象，属于转录后的基因沉默现象，而且，引发RNAi 的片段并不需要完整的基因序列，还可以是多个病毒的不同基因片段的嵌合体，为此，我 们将收集到的ScMV各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分别进行多序 列比对，从中各选取1条100%同源的序列区段，采用人工合成的方式串联在一起，作为 RNAi (RNA interference)干扰片段，构建反向重复序列，得到一个RNAi载体。通过基因枪 轰击法遗传转化甘蔗，获得具有沉默病毒基因表达效果的转基因甘蔗。
[0004] 专利号为ZL20071009226. 8的发明专利"利用SrMV-Pl基因培育抗花叶病甘蔗品 种的方法"，介绍了一种利用SrMV-Pi基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括SrMV-P i基因 的克隆、抗花叶病甘蔗转Pi基因植物表达载体的构建、抗甘蔗花叶病转P :基因材料的培育 以及抗病高产高糖转基因甘蔗新材料的筛选鉴定。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种利用人工合成序列MV3培育抗花叶病甘蔗 品种的方法。针对现有蔗区甘蔗花叶病严重的问题，人工合成可同时沉默甘蔗花叶病毒和 高粱花叶病毒的新型核酸序列，构建RNAi载体，通过基因枪轰击法进行遗传转化，获得对 花叶病高抗的转基因甘蔗。
[0006] 本发明的目的是通过以下方法实现的。
[0007] 本发明的利用人工合成MV3序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MV3序列的 人工合成、RNAi载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定；其特征在于：
[0008] (1)MV3序列的人工合成：
[0009] 从ScMV和SrMV核酸序列中各选取一段串联在一起，获得MV3序列，同时在正义链 5'端加入Xba I和Xho I酶切位点，反义链5'端加入Cla I和Kpn I酶切位点，采用人工 合成的方式，获得目的片段A，其序列如下：
[0010]
【主权项】
1. 一种利用人工合成MV3序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MV3序列的人工合 成、RNAi干扰载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定；其特征在于： (1) MV3序列的人工合成： 从ScMV和SrMV核酸序列中各选取一段串联在一起，获得MV3序列，同时在正义链Y 端加入Xba I和Xho I酶切位点，反义链5'端加入Cla I和Kpn I酶切位点，采用人工合 成的方式，获得目的片段A，其序列如下： GATCTAGACT CGAGATGGAA AAAAGTTACG TCGATCTCTT AAACCAAGCA TGGGCAGATT TGCCATTACA TTCAAAATTA TATTCAATTT GGCGTGTGTA CGAAGTCAAG AAATATTACA AGCCGTGCTT AGTCCTGAAA AGAGGCGTAG ATTTAGGCGC AATGTACAAT ATCTCAGCTA CGCATCAAAT ATCAAGTTTA GTGCAGAAAA GTCGAGATCA AGTCAGCTCT ATTTCAACCA AACTCCACCA CAGTTTATGT AATAATGGAA AAAAATTATG TAGATCAATT AAACCAGTCA TGGGCAGAAT TATCATACTG TGGAAAATTT TCAGCAATAT GGCGTGTGTT CAGAGTCAAG AAATACTACA AGCCATCTTT AACCGTGAGA AAAAGCGTAG ATTTAGGCGC TGTTTACAAT ATATCAGCTA CGCATCTAAT ATCAGATTTA GTGCAGAGAA GTCGAGATCG AGTCAGCTCT ACTTTAACCA AACTCCGCAA CGGTTTCTAG GTACCATCGA TAG ； (2) RNAi载体构建： (a) 目的片段I的获得：利用限制性内切酶Xho I和Kpn I将目的片段A进行酶切，将 酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段I ;目的片段I的序列为序列表中 SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列； (b) 目的片段II的获得：将pHANNIBAL载体质粒DNA用限制性内切酶Xho I和Kpn I进 行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段II，目的片段II的序列为 序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列； (c) 中间载体B的获得：将回收的目的片段I和目的片段II用T4-DNA连接酶进行连 接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5 a中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体B ;所述中间 载体B是指将目的片段I插入到pHANNIBAL载体后获得的载体； ⑷目的片段III的获得：提取中间载体B的质粒DNA，并用限制性内切酶Cla I和Xba I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段III ;目的片段III的序 列为序列表中SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列； (e) 目的片段IV的获得：将目的片段A用限制性内切酶Cla I和Xba I进行酶切，将酶 切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段IV ;目的片段IV的序列为序列表中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列； (f) 中间载体C的获得：将回收的目的片段III和目的片段IV用T4-DNA连接酶进行连 接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5 a中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体C ;所述中间 载体C是指将目的片段IV插入到中间载体B后获得的载体； (g) 目的片段V的获得：提取中间载体C的质粒DNA，并用限制性内切酶Not I进行酶 切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段V ;目的片段V的序列为序列 表中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列； (h) 目的片段VI的获得：将植物表达载体pGreenII0229质粒DNA用限制性内切酶Not I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段VI ;目的片段VI的序 列为序列表中SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列； ⑴抗甘蔗花叶RNAi载体pG0229i-MV3的获得：将回收的目的片段V和目的片段VI用 T4-DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5 a中，挑取阳性克隆验证，获得 可用于遗传转化甘蔗受体材料的RNAi载体pG0229i-MV3 ; (3)抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定：提取构建完成的RNAi载体 pG0229i-MV3质粒DNA，用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，并将其定量至I y g/ y 1，基 因枪轰击法遗传转化甘蔗，分子检测获得再生阳性转基因植株，并进行抗病转基因甘蔗的 抗病性鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种利用人工合成MV3序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法， 其特征在于所述从ScMV和SrMV核酸序列中各选取一段串联在一起，即将收集到的ScMV各 病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分别进行多序列比对，从中各选取1条 100%同源的序列区段串联在一起，共495bp。
【专利摘要】一种利用人工合成MV3序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MV3序列的人工合成、RNAi干扰载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育和抗病转基因甘蔗的抗病性鉴定。本发明获得的植物表达载体采用了RNAi技术，使得甘蔗抗病毒育种摆脱了对抗源基因的依赖，可以有效地缩短甘蔗抗花叶病育种周期。本发明已获得的转基因植株，具有抗性广谱、抗病性好、抗性持久及生物安全性高等特点。
【IPC分类】C12N15-82, A01H5-00, C12N15-113
【公开号】CN104846005
【申请号】CN201510093048
【发明人】郭晋隆, 高世武, 许莉萍, 阙友雄, 苏亚春, 吴期滨, 林庆良
【申请人】福建农林大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年3月2日