利用人工合成mv1序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种培育甘蔗抗病品种的方法，具体涉及一种利用人工合成MV1序列 培育抗花叶病甘蔗品种的方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 甘鹿（Saccharum officinarum)是禾本科甘鹿属植物，是我国最主要的糖料作物 和绿色能源作物，其生产不仅关系我国食糖安全，还能为绿色能源燃料乙醇的生产提供原 料。但在实际生产过程中，甘蔗病虫害等许多因素都制约甘蔗的生产，致使甘蔗生产遭受 巨大的经济损失。甘蔗花叶病是蔗区发生最普遍、危害最严重的甘蔗病害之一，它主要破 坏甘蔗叶片的叶绿体，严重制约其光合作用，从而使甘蔗的生长受到限制，造成产量降低 5 % -19 %、节间变短、品质变劣和品种退化。
[0003] 甘蔗花叶病是由马铃薯Y病毒属（Potyvirus)甘蔗花叶病毒亚组的成员甘蔗花 叶病毒（Sugarcane Mosaic Virus, ScMV)和高粱花叶病毒（Sorghum Mosaic Virus, SrMV) 引起的。Potyvirus病毒基因组长约10kb，编码一个多聚蛋白，经自身编码的蛋白酶降解形 成10个多肽，分别为PI、HC-pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、Nib和CP。近年来，研宄者先 后将单一的CP及HC全序列基因导入到甘蔗中，并获得了转基因甘蔗，对甘蔗花叶病的抗性 明显提高。但研宄表明，蔗区中花叶病毒的优势株系在自然条件下也会发生变化，并产生 新的株系。目前，世界蔗区至少存在有7个ScMV和SrMV病毒株系，包括属于ScMV的株系 ScMV-A，B，D，E和属于SrMV的株系SrMV-H，I，M。因此，仅以单一株系的花叶病毒的单一基 因为靶标的转基因改良显然无法应对蔗区病原株系多样化、复杂化以及优势株系的变化。
[0004] 近年来，基于RNAi (RNA interference)原理的抗病毒育种受到了广泛的关注，因 为由dsRNA(double-stranded RNA)诱导的降解同源RNA而造成的基因沉默现象广泛地存 在于生物体中，将任何目的基因序列插入RNA干扰载体，可获得沉默靶标基因的效应。而 且，引发RNAi的片段并不需要完整的基因序列，还可以是多个病毒的不同基因片段的嵌合 体，因此，RNAi针对的靶标基因也可以是多个不同病毒的基因片段。为此，我们将收集到的 ScMV各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分别进行多序列比对，从中分 别选取5条和10条长度大于21bp且100%同源的序列区段，采用人工合成的方式串联在一 起，作为RNAi (RNA interference)干扰片段，构建反向重复序列，得到一个RNAi载体。通 过基因枪轰击法遗传转化甘蔗，获得具有沉默病毒基因表达效果的转基因甘蔗。
[0005] 专利号为ZL20071009226. 8的发明专利"利用SrMV-Pl基因培育抗花叶病甘蔗品 种的方法"，介绍了一种利用SrMV-Pi基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括SrMV-P i基因 的克隆、抗花叶病甘蔗转Pi基因植物表达载体的构建、抗甘蔗花叶病转P :基因材料的培育 以及抗病高产高糖转基因甘蔗新材料的筛选鉴定。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种利用人工合成序列MV1培育抗花叶病甘蔗品种的方法。 针对现有蔗区甘蔗花叶病严重的问题，人工合成可同时沉默甘蔗花叶病毒和高粱花叶病毒 的新型核酸序列，构建RNAi载体，通过基因枪轰击法进行遗传转化，获得对花叶病高抗的 转基因甘蔗。
[0007] 本发明的目的是通过以下方法实现的。
[0008] 本发明的利用人工合成MV1序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MV1序列的 人工合成、RNAi干扰载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定；其特征在 于：
[0009] ⑴MV1序列的人工合成：
[0010] 从ScMV和SrMV核酸序列中选取若干区段串联在一起，获得MV1序列，同时在正义 链5'端加入Xba I和Xho I酶切位点，反义链5'端加入Cla I和Kpn I酶切位点，采用 人工合成的方式，获得目的片段A，其序列如下：
[0011]
【主权项】
1. 一种利用人工合成MVl序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MVl序列的人工合 成、RNAi干扰载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定；其特征在于： (1) MVl序列的人工合成： 从ScMV和SrMV核酸序列中选取若干区段串联在一起，获得MVl序列，同时在正义链 5'端加入Xba I和Xho I酶切位点，反义链5'端加入Cla I和Kpn I酶切位点，采用人工 合成的方式，获得目的片段A，其序列如下： GATCTAGACT CGAGGACCCA AAAATTGTGG ATTTGCCACA GCATGTTATG CATTATCAGT ATGGAAAAAA GTTACGTCGA TCTCTTAAAC CAAGCATGGG GCGTAGATTT AGGCGCAATG TACAATATCT CAGCTACGCA TCAAATATCA AATTTAGTGC AGAAAAGTCG AGATATTTCA ACCAAACTCC ACCACAGTTT ATGTAAGAGA TAACAATAAG ATCAACAAGA GGATTACTCC TATAGCAACA CCAGATGGAT CCGTCACTTT AGTGATGCAG CTGAAGCGTA ATGCCAAGAT ACGGACTTCA GCGAAACTTG AGGCCCACAT GCAGATGAAA GCTGGAAAAT TTTCAGCAAT ATGGCGTGTG TTCATCTTTA ACCGTGAGAA AAAGCGTAGA TTTAGGCGCT GTTTACAATA TATCAGCTAC GCATCTAATA TCAGATTTAG TGCAGAAGTC AGCTCTACTT TAACCAAACT CCGCAACGGT TTCTACAGGA GAATACAGAG AGACACACAG CTGGCGACGT AGTCGCAACA TGCACTCTCT GTTGGGAGTG CAGCAGCACC ACTAGGGTAC CATCGATAG ； (2) RNAi干扰载体构建： (a) 目的片段I的获得：利用限制性内切酶Kpn I和Xho I将目的片段A进行酶切，将 酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段I ;所述目的片段I的序列为序列 表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列； (b) 目的片段II的获得：将pHANNIBAL载体质粒DNA用限制性内切酶Kpn I和Xho I进 行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段II，所述目的片段II的序 列为序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列； (c) 中间载体B的获得：将回收的目的片段I和目的片段II用T4-DNA连接酶进行连 接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5 a中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体B ;所述中间 载体B是指将目的片段I插入到pHANNIBAL载体后获得的载体； ⑷目的片段III的获得：提取中间载体B的质粒DNA，并用限制性内切酶Cla I和Xba I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段III ;所述目的片段III 的序列为序列表中SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列； (e) 目的片段IV的获得：将目的片段A用限制性内切酶Cla I和Xba I进行酶切，将酶 切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段IV ;所述目的片段IV的序列为序列表 中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列； (f) 中间载体C的获得：将回收的目的片段III和目的片段IV用T4-DNA连接酶进行连 接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5 a中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体C ;所述中间 载体C是指将目的片段IV插入到中间载体B后获得的载体； (g) 目的片段V的获得：提取中间载体C的质粒DNA，并用限制性内切酶Not I进行酶 切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段V ;所述目的片段V的序列为 序列表中SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列； (h) 目的片段VI的获得：将植物表达载体pGreenII0229质粒DNA用限制性内切酶Not I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段VI ;所述目的片段VI 的序列为序列表中SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列； ⑴抗甘蔗花叶RNAi干扰载体pG0229i-MVl的获得：将回收的目的片段V和目的片段 VI用T4-DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5 a中，挑取阳性克隆验证， 获得可用于遗传转化甘蔗受体材料的RNAi干扰载体pG0229i-MVl ; (3)抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定：提取构建完成的RNAi干扰载体 pG0229i-MVl质粒DNA，用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，并将其定量至I y g/ y 1，基 因枪轰击法遗传转化甘蔗，分子检测获得阳性转基因植株，并进行抗病转基因甘蔗的抗病 性鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种利用人工合成MVl序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法， 其特征在于所述从ScMV和SrMV核酸序列中选取若干区段串联在一起，即将收集到的ScMV 各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分别进行多序列比对，从中分别选 取5条和10条长度大于21bp，且100%同源的序列区段串联在一起，共561bp。
【专利摘要】一种利用人工合成MV1序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MV1序列的人工合成、RNAi干扰载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育和抗病转基因甘蔗的抗病性鉴定。本发明获得的植物表达载体采用了RNAi技术，使得甘蔗抗病毒育种摆脱了对抗源基因的依赖，可以有效地缩短甘蔗抗花叶病育种周期。本发明已获得的转基因植株，具有抗性广谱、抗病性好、抗性持久及生物安全性高等特点。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-113, C12N15-82
【公开号】CN104846006
【申请号】CN201510093082
【发明人】许莉萍, 郭晋隆, 高世武, 阙友雄, 苏亚春, 吴期滨, 林庆良
【申请人】福建农林大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年3月2日