甘蔗叶多酚氧化酶的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种甘蔗叶多酚氧化酶的制备方法，新鲜甘蔗叶洗净剪碎，按每克甘蔗叶添加4mL冷丙酮，并通过匀浆、抽滤、冷冻干燥得到甘蔗叶丙酮粉，按每克甘蔗叶丙酮粉加入3℃、pH6.5、浓度为0.1mol/L磷酸缓冲液6mL，通过冷冻浸提、过滤、冷冻离心，得到甘蔗叶多酚氧化酶粗酶液，并经凝胶排阻柱层析、纯化、真空下冷冻干燥后得到多酚氧化酶粉末。通过本发明能够获得廉价、量大、具有高酶活力的多酚氧化酶，为甘蔗的综合利用和甘蔗叶多酚氧化酶的工业应用以及环境保护提供参考。
【专利说明】甘蔗叶多酚氧化酶的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种甘蔗叶多酚氧化酶的制备方法。
【背景技术】
[0002]甘鹿(Saccharum sinense)作为我国最常见的农作物,在两广地区及海南岛等地区广泛种植。甘蔗可作为食用甘蔗，也是制造蔗糖的重要原料，并且可以用来制造燃料乙醇作为一种能源替代品。但是甘蔗叶往往被作为废弃物，然而甘蔗叶中的多酚氧化酶在植株抗虫害、防褐变等方面具有十分重要的作用。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种甘蔗叶多酚氧化酶的制备方法，通过该方法能够获得廉价、量大、具有高酶活力的多酚氧化酶，为甘蔗的综合利用和甘蔗叶多酚氧化酶的工业应用以及环境保护提供参考。
[0004]本发明以如下技术方案解决上述技术问题:
[0005]甘蔗叶多酚氧化酶的制备方法，其特征在于，采集新鲜甘蔗叶洗净并剪成碎块，按每克甘蔗叶碎块添加4mL冷丙酮，高速匀浆捣碎I分钟，停止30秒然后再次高速匀浆捣碎I分钟，形成悬浊液，将悬浊液用双层定性滤纸抽滤，所得滤渣用所述冷丙酮洗至呈白色为止，冷冻干燥所述滤渣，得到甘蔗叶丙酮粉，按每克甘蔗叶丙酮粉加入3°C、pH6.5、浓度为
0.lmol/L磷酸缓冲液6mL，冷冻浸提后用纱布进行过滤，收集滤液，将所述滤液以1000Or/min冷冻离心20分钟，收集上清液得到甘蔗叶多酚氧化酶粗酶液，所得甘蔗叶多酚氧化酶粗酶液采用Sephacryl S200进行凝胶排阻柱层析,收集活性组分,运用DEAE Sephadex A50纯化，得到甘蔗叶多酚氧化酶纯液，在真空下冷冻干燥得到甘蔗叶多酚氧化酶粉末。
[0006]所述冷丙酮温度为-10°C。
[0007]所述滤渣冷冻干燥、冷冻浸提、冷冻离心的温度均为3°C ;所述冷冻浸提时间为4小时。
[0008]甘蔗叶多酚氧化酶的制备方法，其特征在于，采集新鲜甘蔗叶洗净并剪成碎块，按每克甘蔗叶碎块加入含表面活性剂的3°C、pH6.5、浓度为0.lmol/L的磷酸缓冲液6mL，然后高速匀浆捣碎I分钟，停止30秒后再次高速匀浆捣碎I分钟，形成匀浆，所得匀浆冷冻浸提后用纱布过滤，收集滤液，将所述滤液以lOOOOr/min冷冻离心20分钟，收集上清液得到甘蔗叶多酚氧化酶粗酶液，所得甘蔗叶多酚氧化酶粗酶液采用Sephacryl S200进行凝胶排阻柱层析，收集活性组分，运用DEAE Sephadex A50纯化,得到甘鹿叶多酹氧化酶纯液,在真空下冷冻干燥得到甘蔗叶多酚氧化酶粉末。
[0009]所述表面活性剂为吐温或Triton X-100。
[0010]所述含表面活性剂吐温的磷酸缓冲液中，吐温与磷酸缓冲液的容积比为2.5% ；或:含Triton X-100的磷酸缓冲液中，Triton X-100与磷酸缓冲液的容积比为0.2%。
[0011]所述匀浆冷冻浸提、冷冻离心温度均为3°C，冷冻浸提时间为8小时。[0012]本发明采用的原料是来源丰富、廉价的甘蔗叶，为提高甘蔗的综合附加值提供了参考，同时通过本发明可获得量大、活性高、廉价的甘蔗叶多酚氧化酶，具有工业实用价值。
【具体实施方式】
[0013]以0.2mol/L邻苯二酚为底物，测得甘蔗叶多酚氧化酶最合适的反应温度为33°C，最适 pH 为 7.1，其米氏常数为 0.831mol/L, Vmax=0.2310 (U/min)。
[0014]本发明所述甘蔗叶剪成碎块，对碎块大小没有严格的要求，因为之后还要匀浆捣碎，所以剪成I 一 3cm2大小的碎块均可。
[0015]实施例1:
[0016]采集新鲜甘蔗叶洗净，取100克甘蔗叶剪成Icm2左右大小的块状，加入400mL-10°C冷丙酮，用组织捣碎仪高速匀浆捣碎I分钟，停机30秒然后再次捣碎I分钟使甘蔗叶充分捣碎，形成悬浊液；将悬浊液用双层定性滤纸抽滤，所得滤渣用-10°C冷丙酮洗至滤渣呈白色为止，在:TC温度下冷冻干燥滤渣，得到甘蔗叶丙酮粉；取100克甘蔗叶丙酮粉加入600mL3°C预冷、pH为6.5、浓度为0.lmol/L的磷酸缓冲液，置于冰箱内在3°C温度下冷冻浸提4小时，之后用2层纱布进行抽滤，收集滤液，将滤液以10000r/min在3°C温度下冷冻离心20分钟，收集上清液得甘蔗叶多酚氧化酶粗酶液；所得甘蔗叶多酚氧化酶粗酶液采用Sephacryl S200进行凝胶排阻柱层析，用分部收集器收集活性组分，用DEAESephadex A50纯化,得到甘鹿叶多酹氧化酶纯液，用真空冷冻干燥机冷冻干燥8小时,得到甘蔗叶多酚氧化酶粉末 。
[0017]经测定酶活力为223U/mL。
[0018]实施例2:
[0019]采集新鲜甘蔗叶洗净，取100克甘蔗叶剪成Icm2左右大小的块状，加入600mL含吐温的、3°C预冷、pH6.5、浓度为0.lmol/L的磷酸缓冲液，所述吐温与所述磷酸缓冲液容积比为2.5%，用组织捣碎仪高速匀浆捣碎I分钟，停机30秒然后再次捣碎I分钟，所得匀浆置于冰箱内在3°C温度下冷冻浸提8小时，之后用4层纱布过滤，收集滤液，将滤液以1000Or/min在:TC温度下冷冻离心20分钟，收集上清液得甘蔗叶多酚氧化酶粗酶液；所得甘蔗叶多酚氧化酶粗酶液采用Sephacryl S200进行凝胶排阻柱层析，用分部收集器收集活性组分，用DEAESephadex A50纯化，得到甘蔗叶多酚氧化酶纯液，用真空冷冻干燥机冷冻干燥8小时，得到甘蔗叶多酚氧化酶粉末。
[0020]经测定酶活力为241U/mL。
[0021]实施例3:
[0022]采集新鲜甘蔗叶洗净，取100克甘蔗叶剪成Icm2左右大小的块状，加入600mL含TritonX-1OO的、3°C预冷、ρΗ6.5、浓度为0.lmol/L的磷酸缓冲液，所述Triton X-100与所述磷酸缓冲液容积比为0.2%，用组织捣碎仪高速匀浆捣碎I分钟，停机30秒然后再次捣碎I分钟，所得匀浆置于冰箱内在3°C温度下冷冻浸提8小时，之后用4层纱布过滤，收集滤液，将滤液以10000r/min在3°C温度下冷冻离心20分钟，收集上清液得甘蔗叶多酚氧化酶粗酶液；所得甘蔗叶多酚氧化酶粗酶液采用Sephacryl S200进行凝胶排阻柱层析，用分部收集器收集活性组分，用DEAE Sephadex A50纯化，得到甘蔗叶多酚氧化酶纯液，用真空冷冻干燥机冷冻干燥8小时，得到甘蔗叶多酚氧化酶粉末。[0023] 经测定酶活 力为250U/mL。
【权利要求】
1.甘蔗叶多酚氧化酶的制备方法，其特征在于，采集新鲜甘蔗叶洗净并剪成碎块，按每克甘蔗叶碎块添加4mL冷丙酮，高速匀浆捣碎I分钟，停止30秒然后再次高速匀浆捣碎I分钟，形成悬浊液，将悬浊液用双层定性滤纸抽滤，所得滤渣用所述冷丙酮洗至呈白色为止，冷冻干燥所述滤渣，得到甘蔗叶丙酮粉，按每克甘蔗叶丙酮粉加入3°C、pH6.5、浓度为0.lmol/L磷酸缓冲液6mL，冷冻浸提后用纱布进行过滤，收集滤液，将所述滤液以1000Or/min冷冻离心20分钟，收集上清液得到甘蔗叶多酚氧化酶粗酶液，所得甘蔗叶多酚氧化酶粗酶液采用Sephacryl S200进行凝胶排阻柱层析,收集活性组分,运用DEAE Sephadex A50纯化，得到甘蔗叶多酚氧化酶纯液，在真空下冷冻干燥得到甘蔗叶多酚氧化酶粉末。
2.根据权利要求1所述的甘蔗叶多酚氧化酶的制备方法，其特征在于，所述冷丙酮温度为-1o°c。
3.根据权利要求1所述的甘蔗叶多酚氧化酶的制备方法，其特征在于，所述滤渣冷冻干燥、冷冻浸提、冷冻离心的温度均为3°C ;所述冷冻浸提时间为4小时。
4.根据权利要求1所述的甘蔗叶多酚氧化酶的制备方法，其特征在于，采集新鲜甘蔗叶洗净并剪成碎块，按每克甘蔗叶碎块加入含表面活性剂的3°C、pH6.5、浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液6mL，然后高速匀浆捣碎I分钟，停止30秒后再次高速匀浆捣碎I分钟，形成匀浆，所得匀浆冷冻浸提后用纱布过滤，收集滤液，将所述滤液以10000r/min冷冻离心20分钟，收集上清液得到甘蔗叶多酚氧化酶粗酶液，所得甘蔗叶多酚氧化酶粗酶液采用Sephacryl S200进行凝胶排阻柱层析,收集活性组分,运用DEAE Sephadex A50纯化,得到甘蔗叶多酚氧化酶纯液，在真空下冷冻干燥得到甘蔗叶多酚氧化酶粉末。
5.根据权利要求4所述的甘蔗叶多酚氧化酶的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂为吐温或Triton X-100。
6.根据权利要求5所述的甘蔗叶多酚氧化酶的制备方法，其特征在于，所述含表面活性剂吐温的磷酸缓冲液中，吐温与磷酸缓冲液的容积比为2.5% ;或:含Triton X-100的磷酸缓冲液中，Triton X-100与磷酸缓冲液的容积比为0.2%。
7.根据权利要求4所述的甘蔗叶多酚氧化酶的制备方法，其特征在于，所述匀浆冷冻浸提、冷冻离心温度均为3°C，冷冻浸提时间为8小时。
【文档编号】C12N9/02GK103627681SQ201310648809
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】杨洋, 候杰, 马万良, 胡振兴, 叶琴 申请人:广西大学