一种用植物花瓣细胞原生质体表达蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种用植物花瓣细胞原生质体表达蛋白的方法及其应用。
【背景技术】
[0002]生物体内的基因大都是通过编码蛋白来行使其功能的。对植物功能基因的研宄，终宄要归结于蛋白功能的研宄。目前基因的研宄和功能验证多是通过转基因到模式植物(比如拟南芥、烟草等)来完成的。由于木本植物与草本植物之间的差异，以及物种之间的差异，转基因模式植物所表现出来的表型不一定能反映目的基因在其他植物中的真实功能。以梅花为例，梅花目前没有成熟的遗传转化体系，无法通过获得转基因梅花株系的方法验证基因功能，而且即使将来有了梅花的遗传转化体系，从梅花转基因再生植株到开花也至少需要3年的时间，这些限制了对梅花功能基因的研宄。而用植物自身组织制备原生质体表达目的蛋白的方法，研宄植物基因功能的优势在于:其一，可以大大缩短实验周期，从原生质体制备到蛋白表达只需2天的时间；其二，可以简化实验操作步骤，使得目的基因的表达可以在2mL离心管里完成；其三，在除去细胞壁的原生质体单个细胞中，可以更直接清楚地观察到目的蛋白的亚细胞定位和动态变化，从而更有利于功能机制的研宄。
[0003]原生质体的制备选材多样，多以嫩叶、胚芽、愈伤组织等为材料，观赏植物现有的原生质体的制备方法多以愈伤组织为材料，愈伤组织细胞疏松、细胞壁薄，酶解细胞壁较为容易。但是，愈伤组织的细胞没有组织器官特异性，用它来研宄花香和花色等相关基因的功能，不如花瓣细胞接近花朵的真实状态。
[0004]因此，有必要提供一种外源蛋白转化表达效果好、操作简单，缩短研宄周期的在植物原生质体中表达蛋白的方法。
【发明内容】
[0005]为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种用植物花瓣细胞原生质体表达蛋白的方法，该方法包括以下步骤:
[0006](I)以植物花瓣作为材料，酶解获得花瓣细胞原生质体；
[0007](2)将所述花瓣细胞原生质体在2-8°C静置20-40min进行冷处理；
[0008](3)用PEG和Ca2+介导法将质粒转化入原生质体，表达目的蛋白。
[0009]优选的情况下，为了获得更高的质粒转化效率，将所述花瓣细胞原生质体在2-4°C静置25-35min进行冷处理。
[0010]可选的，酶解中所使用的酶解液的组成成分包括:
[0011]1.5-2.5% (m/v)纤维素酶R_10、l.5-2.5% (m/v)离析酶R_10、0.4M甘露醇、20mMKClUOmM CaCl2、pH 为 5.7 的 20mM MES,0.1% BSA 和 5πιΜβ-巯基乙醇。
[0012]可选的，酶解过程包括以下步骤:将所述植物花瓣切割成长度为1-1.5cm,宽度为0.3-0.8mm的细丝，将切割后的花瓣细丝与酶解液在真空条件下接触25_35min，然后于22°C摇床中以45-65rpm的转速酶解2_3小时，获得原生质体。
[0013]具体的可以将盛有酶解液和花瓣细丝的容器置于真空泵中，开盖抽真空，使得酶解液与花瓣的组织细胞充分接触，从而提高酶解的效率，而后再将容器从真空泵中取出后盖上盖，置于摇床中继续进行酶解。
[0014]本发明所提供的方法还包括在获得原生质体后对含有原生质体的酶解液进行过滤收集能够穿过滤网的组分，滤网的尺寸优选为200目，例如，可以为200目的尼龙布。
[0015]本发明所提供的方法还包括在过滤后将所述能够穿过滤网的组分在60_100g的离心力下，离心3-5-min收集原生质体，再利用细胞清洗液对原生质体进行清洗，清洗的方法为用细胞清洗液轻柔地悬起原生质体，随后在60-100g的离心力下，离心3-5min收集原生质体，弃去上清。
[0016]其中，所述细胞清洗液的配方为:154mMNaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、2mM MES，pH值为5.7。
[0017]可选的，在步骤(2)中，在所述冷却处理过程中将花瓣细胞原生质体悬浮于细胞清洗液中。
[0018]可选的，在步骤(3)中，首先用转化悬浮液将冷处理后的原生质体悬浮，所述转化悬浮液的PH值为5.7，组成成分包括:0.4M甘露醇、15mM MgCl2、4mM MES。
[0019]可选的，转化过程包括以下步骤:
[0020]离心收集冷处理后的原生质体，用转化悬浮液进行悬浮，使原生质体的浓度达到3-8 X 16个/mL后利用PEG和Ca 2+介导质粒转化。
[0021]其中，质粒转化过程中所使用的PEG转化液的组成包括:40% (m/v)PEG 4000、
0.2M 甘露醇、10mM CaCl2
[0022]可选的，所述花瓣为梅花花瓣或碧桃花花瓣，优选的情况下，所述花瓣为梅花花_。
[0023]可选的，本发明所述的酶解液的制备过程包括:按照酶解液中各组分的终浓度为
1.5-1.25% (m/v)纤维素酶 R-10、L 5-2.5% (m/v)离析酶 R_10、0.4M 甘露醇、20mM KC1、1mM CaCljP 20mM MES (pH5.7) (MES起稳定溶液pH的作用，母液配置过程中调节pH至5.7)，在55°C水浴锅加热10分钟，冷却到20-25°C后加入BSA至终浓度为0.1% (m/v)。
[0024]本发明所提供的方法通过低温、PEG、Ca2+处理原生质体，提高了质粒转化细胞的效率。
[0025]本发明所述的方法还包括将完成质粒转化的原生质体静置于22°C恒温培养箱，培养12-30个小时，表达目的蛋白。
[0026]在本发明所提供的方法中，经检测成功表达外源基因的原生质体可以接着做后续实验。如果表达的外源蛋白融合荧光蛋白GFP标签，可以直接在激光共聚焦显微镜下观察目的蛋白在原生质体中表达的情况，并可以动态观察蛋白在不同处理条件下的反应；融合其它标签的目的蛋白可以用蛋白免疫印迹实验检测原生质体中目的蛋白表达的情况。
[0027]在本发明的一种实施方式中，用梅花花瓣原生质体表达目的蛋白，从而验证与花朵的花香、花色以及其它在细胞水平上能够检测的表型相关的基因的功能。
[0028]本发明还提供了所述方法在利用植物细胞表达外源蛋白中的应用。
[0029]本发明还提供了所述方法在目的基因功能研宄中的应用。
[0030]与现有技术相比，本发明的有益效果是可以在短时间内(外源质粒在原生质体内表达蛋白需要12-30个小时)表达目的蛋白，此原生质体蛋白表达系统可用于目的蛋白的亚细胞定位、蛋白分子的相互作用的研宄。原生质体活性正常，经目的蛋白表达检测，可用于研宄活体细胞内基因转录水平、蛋白表达水平、物质代谢水平的变化，是一种方便而快捷的研宄目的基因功能的方法。
【附图说明】
[0031]图1为梅花花瓣原生质体的制备和目的蛋白表达的情况。
[0032]a为梅花材料的选择、b为花瓣的分离、c为花瓣的叠放、d为花瓣切成细丝的状态。
[0033]e为在20 X激光共聚焦显微镜下观察到的原生质体的形态，标尺为200 μ m，从左到右分别为:484nm激发光下、明场下、合成后观察到的原生质体中绿色荧光蛋白GFP表达的情况。
[0034]图2为碧桃花瓣原生质体的制备和目的蛋白表达的情况。
[0035]a为碧桃花朵材料的选择、b为花瓣的分离、c为花瓣的叠放、d为切成的花瓣细丝在酶解液中酶解的状态。
[0036]e为在20X激光共聚焦显微镜下观察到的原生质体的形态，标尺为200 μ m。从左到右分别为:484nm激发光下、明场