兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫检测技术领域。本发明涉及一种多克隆抗体，尤其涉及兔抗牛乳 铁蛋白多克隆抗体，本发明进一步涉及该兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体在定性和定量检测 乳、乳制品或乳腺中乳铁蛋白中的应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，人们对乳品质的要求越来越高，乳蛋白作为衡量乳品质的重要指标， 其合成的营养调控已经成为奶牛营养学研究的热点。乳铁蛋白也称为乳运铁蛋白 (lactoferrin，Lf)，是牛奶中重要生物活性物质之一，具有调节铁吸收，广谱抗细菌感染， 调节机体免疫反应，抗氧化、抗癌、抗病毒等多种功效。乳铁蛋白在人初乳中含量较高，浓 度为6-8mg/mL;奶牛初乳中浓度为l-2mg/mL，而在常乳中的含量较低，人常乳中浓度仅为 l-2mg/mL，奶牛常乳中浓度仅为0. 02-0. 35mg/mL。由于人乳来源有限，因此牛乳即成为人们 获取乳铁蛋白的最直接途径。为检测乳与乳制品中乳铁蛋白的含量，有效降低牛奶加工过 程中造成的损失，需要建立一种快速、准确的测定生鲜乳及乳制品中乳铁蛋白含量的方法。
[0003]截至目前，乳铁蛋白的定性和定量检测方法主要包括随机免疫扩散法（RID)、放射 免疫分析法（RIA)、酶联免疫吸附测定（ELISA)方法、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电 泳法（SDS-PAGE)以及高效液相色谱法（HPLC)等。其中，RID和RIA方法检测范围有限，准 确性差，且存在一定放射危害。SDS-PAGE法相对耗时较长，且不易于准确定量，不宜检测大 批量样品。HPLC法虽可准确定量，但其检测对象有限，仅适合检测液态奶和奶粉样品，且对 样品纯度有一定要求，仅适用于高纯度样品测定，样品前处理过程相对复杂，同时仪器设备 昂贵，且对于仪器的操作技能要求较高。
[0004] 相比之下，酶联免疫吸附测定（ELISA)方法是检测特定蛋白的有效方法，具有快 速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。结合SDS-PAGE及Western-blot，可用于针对特定 抗原的定性和定量检测。但是，利用酶联免疫吸附测定方法检测生鲜乳及乳制品中的乳铁 蛋白含量，需要用到相应的乳铁蛋白抗体。
[0005] 现有的乳铁蛋白多克隆抗体多不同程度的存在效价较低、纯度不高、特异性不强 等缺陷，限制了其在检测生鲜乳及乳制品中的乳铁蛋白含量中的应用，有待改进。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种效价高、纯度高、特 异性强的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体，为定量检测乳及乳制品中以及奶牛乳腺中合成的乳 铁蛋白提供有效研究材料。
[0007] 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
[0008] 一种兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体，其通过以下方法制备得到：
[0009] (1)将乳铁蛋白与免疫佐剂混合，得到含有复合佐剂的乳铁蛋白溶液；
[0010] (2)用含有复合佐剂的乳铁蛋白溶液免疫兔，获取抗血清；离心，取上清，得到抗 血清，备用；
[0011] (3)将抗血清依次用免疫磁珠法和蛋白A亲和层析法进行纯化，得到纯化的兔抗 牛乳铁蛋白多克隆抗体。
[0012] 其中，步骤（1)中将乳铁蛋白与CpG佐剂溶于PBS中得到混合溶液，再与Al(OH)3 混合，得到含有复合佐剂的乳铁蛋白溶液；优选的，将0. 5mg乳铁蛋白与50ygCpG佐剂溶 于ImLPBS中得到混合溶液；将混合溶液与Al(OH)^M1:5的体积比混合，得到含有复合 佐剂的乳铁蛋白溶液。
[0013] 所述的免疫方式包括：采用皮下多点注射法的方式将含有复合佐剂的乳铁蛋白溶 液免疫新西兰白兔，免疫的次数为4次；其中，第1次免疫4周后，进行第2次免疫；以后每 2周重复免疫1次，进行第3次和第4次免疫；第4次免疫后的第7天收集抗血清。为了达 到更好的技术效果，在第1次免疫时，每只兔免疫500yg乳铁蛋白；第2次、第3次和第4 次免疫时，每只兔每次免疫250yg乳铁蛋白。
[0014] 将抗血清通过不同的方式进行纯化，所获得的乳铁蛋白多克隆抗体的纯度存在较 大的差异；本发明通过筛选试验发现，采用饱和硫酸铵法纯化抗血清所获得的乳铁蛋白多 克隆抗体的纯度仅为62%，采用免疫磁珠法联合蛋白A亲和层析法纯化抗血清所获得的乳 铁蛋白多克隆抗体的纯度达到87%以上，远远高于了饱和硫酸铵法这种纯化方式；因此， 本发明优选采用免疫磁珠法联合蛋白A亲和层析法纯化抗血清。
[0015] 所述免疫磁珠法纯化抗血清包括：将磁珠加入到离心管中，在磁力分离器上放置 吸去上清液，加入稀释的抗血清，静置，吸去上清液；重悬磁珠，重复清洗，吸去上清液；加 入枸橼酸钠缓冲液，涡旋震荡，静置，吸取上清液，重复清洗，将所得上清液混合，得到纯化 后抗体；
[0016] 优选的，取100yL磁珠加入2mL离心管中，在磁力分离器上放置3min后吸去上清 液，加入300yL按照1:100的比例稀释的抗血清，4°C条件下保持倾斜缓慢旋转lOmin，而 后静置3min后吸去上清液，用pH= 7. 4的PBS重悬磁珠，重复清洗3遍后，离心管再次在 磁力分离器上放置3min吸去上清液，加入pH3.O的0.lmol/L枸橼酸钠缓冲液，涡旋震荡 3min，然后再在磁力分离器上放置2min后吸取上清液，重复清洗3遍，将所得上清液混合， 得到纯化后抗体。
[0017] 所述将抗血清用蛋白A亲和层析法进行纯化的方式包括：上样前首先用结合/洗 涤缓冲液平衡蛋白A-琼脂糖-4B并装柱，洗去所含蛋白质等杂质，待流出洗脱液0D2SQ〈0. 02 时；将结合/洗涤缓冲液稀释后的抗血清加入柱中，待全部血清样品进入柱床后，用结合/ 洗涤缓冲液冲洗柱子，待洗脱液0D2S(]〈0. 02时，用pH= 2. 8的3. 5 %冰乙酸洗脱，将含有抗 体的洗脱液收集到含平衡缓冲液的容器中，浓缩，即得；
[0018] 优选的，所述的结合/洗涤缓冲液为含有IMNaCl的0.lmol/LTriS-HCl缓冲液， 其pH= 8. 6 ;
[0019] 为了达到更好的效果，上样前首先用结合/洗涤缓冲液平衡蛋白A-琼脂糖-4B并 装柱，以lmL/min流速洗去杂质；待流出洗脱液0D2SQ〈0. 02时，将结合/洗涤缓冲液稀释后 的血清样本（1:4,v/v)加入柱中，待全部血清样品进入柱床后，用结合/洗涤缓冲液冲洗柱 子并使缓冲液流出速度约1111171^11，待洗脱液00 28。〈0.02时，用？11 = 2.8的3.5%冰乙酸洗 脱，将含有抗体的洗脱液收集到含平衡缓冲液的容器中以中和洗脱液PH至7. 3 ;
[0020] 所述的浓缩优选用IOkDa超滤管进行浓缩。
[0021] 本发明将所制备的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体和现有的商品化抗牛乳铁蛋白多 克隆抗体（美国Sigma公司）进行了效价比较，本发明的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体效价 为1 :128000,而商品化抗牛乳铁蛋白多克隆抗体（美国Sigma公司）效价仅为1 :32000。
[0022] Western-blot结果显示本发明纯化后的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体能够特异性 识别乳铁蛋白。ELISA试验结果可见，本发明制备的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体仅对乳铁蛋 白专一性结合，而与酪蛋白无结合反应，表明其具有良好的特异性。
[0023] 本发明通过给新西兰大白兔免疫乳铁蛋白获得其抗血清，通过免疫磁珠法和蛋白 A亲和层析法对抗血清进行纯化，得到纯度和效价高的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体，其抗体 浓度为11. 〇2mg/mL，其抗体效价为1:128000。本发明兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体能够特异 性识别乳铁蛋白，仅对乳铁蛋白专一性结合，而与酪蛋白无结合反应，表明其具有良好的特 异性。
[0024] 本发明所制备的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体与奶牛乳腺组织中提取的乳铁蛋白 具有反应性，同时对奶粉中的乳铁蛋白也有特异反应性，可用于检测奶牛乳腺组织和奶制 品中的乳铁蛋白。
[0025] 因此，本发明提供了将所制备的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体应用于定性或定量检 测乳制品或乳腺中乳铁蛋白；譬如，将本发明所制备的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体作为检 测抗体采用酶联免疫吸附测定（ELISA)方法结合SDS-PAGE及Western-blot，对乳制品或乳 腺中的乳铁蛋白进行定性或定量检测，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。
[0026] 本发明进一步提供了一种定性或定量检测乳铁蛋白的ELISA试剂盒，包括：检测 抗体、抗体稀释液、包被缓冲液、封闭液、PBS缓冲液、洗涤缓冲液和终止液；其中，所述的检 测抗体是本发明制备的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体。
[0027] 所述包被缓冲液优选是：溶剂为超纯水，溶质为Na2COjPNaHCO3，所述溶质Na2CO3 和NaHCO3在包被缓冲液中的浓度为0. 05M，pH为9. 6;
[0028] 所述封闭液优选是：溶剂为超纯水，溶质为卵清白蛋白，所述溶质卵清白蛋白在封 闭缓冲液中的浓度为1% ;
[0029]所述PBS缓冲液优选是：溶剂为超纯水，溶质为NaCl、KCl、KH2POjPNa2HP04，所述 溶质NaCl、KCl、KH2POjPNa2HP04在所述PBS缓冲液中的浓度分别为8g/L、0. 2g/L、0. 2g/L 和 0? 46g/L，pH值为 7. 4;
[0030] 所述洗涤缓冲液优选是：溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为吐温-20,所述溶质吐 温-20在所述洗涤缓冲液中的浓度为50mL/L;
[0031] 所述抗体稀释液优选是：溶剂为所述PBS缓冲液，溶质为吐温-20和明胶，所述溶 质吐温-20和明胶在所述抗体稀释液中的浓度分别为10mL/L和0.OlM;
[0032] 所述终止液优选是2M的硫酸水溶液；
[0033] 所述底物溶液A优选为：溶剂为超纯水，溶质为过氧化氢脲、Na2HPO4、柠檬酸和 吐温-20,过氧化氢脲、Na2HPO4、柠檬酸和吐温-20在所述底物溶液A中浓度分别为lg/L、 14. 2g/L、9. 42g/L和 0?lmL/L;
[0034] 所述底物溶液B优选为：溶剂为超纯水，溶质为四甲基联苯胺、柠檬酸和硫代硫酸 钠，四甲基联苯胺、柠檬酸和硫代硫酸钠在所述底物溶液B中的浓度分别为0. 4g/L、l. 83g/ L和 0.lg/L。
[0035] 本发明抗体可以特异性结合乳制品中以及乳腺组织中的乳铁蛋白。本发明以所 制备的兔抗牛乳铁蛋