专利名称：：兔抗人IRGMa全长蛋白多克隆抗体的制备和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及IRGMa蛋白的制备和应用。具体的说是一种兔抗人IRGMa全长蛋白多克隆抗体的制备和应用。
背景技术：
：MS是T细胞介导的自身免疫病，研究发现临床表型严重者，IFN-y表达细胞显著增多，提示IFN-y可使MS病变加重。小鼠Irgml(LRG-47)是由IFN-y诱导的蛋白，经研究发现Irgml与MS的动物模型EAE的发病机制有关。Irgml是IFN-y的一个下游效应子，对淋巴细胞的存活具有下游调节作用，在免疫防御中起着重要作用。人类IRGM基因于2006年被克隆，定位于5q33.1，编码一个氨基端和羧基端截短的G区。它与小鼠Ir柳同源，在人类吞噬细胞的自体吞噬过程中是必要的，可以诱导BCG吞噬体的成熟。IRGM基因因3'端剪切方式不同，共有5个转录本，分别为IRGMa、IRGMb、:[RGMc、IRGMd和IRGMe。5个转录本的氨基酸数目分别为182、211、192、199、192。IRGMa的182个氨基酸是5个转录本共有的，因此，IRGMa是该蛋白的主要功能区。目前国外学者制备的IRGM抗体为C端涵盖10多个氨基酸外加一个半胱氨酸(CQIRENVLENLQKER)的抗体，用免疫荧光或Westernblot的方法，该抗体不能检测到细胞内源信号，由于其未包括主要功能区，限制了抗体使用的范围。而目前没有商品化的IRGM抗体。因此，应用IRGMa全长蛋白制备兔抗人多克隆抗体，并应用于研究IRGM基因的表达谱分析及在MS发病过程中具有实际作用。
发明内容本发明的目的是在IRGM基因中优选出一段编码序列，并制备出IRGMa全长蛋白多克隆抗体及其应用。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种兔抗人IRGMa全长蛋白多克隆抗体的制备选用，其特征是针对IRGM蛋白的功能区，选用IRGMa来制备抗体。选用哪一段蛋白来制备抗体及如何获得正确序列的蛋白是本发明的关键。IRGM有5个转录本,5个转录本氨基酸数目分别为IRGMa(182)、IRGMb(211)、IRGMc(192)、IRGMd(199)、IRGMe(192),IRGMa的182个氨基酸是5个转录本共有的，因此，1-182氨基酸应该是该蛋白的主要功能区。而且，IRGMa为一个外显子转录产物，IRGMb、IRGMc、IRGMd、IRGMe为多个外显子转录产物，故用IRGMa来制备抗体是既方便，又包括了主要功能区，因此是可行的。仅合成数十个氨基酸的多肽来制备兔抗人IRGMa多克隆抗体，可能导致抗体特异性不够高；但如果针对IRGMa蛋白的功能区，直接通过合成多肽来合成这么大片段且编码正确的蛋白十分昂贵，是不现实的。故本发明选择GST和His基因融合蛋白的方法来制备该目的蛋白片段。表达GST和His基因融合蛋白，必须构建含IRGMa全长基因(546bp)的GST和His基因融合载体；根据引物设计原则设计引物。本发明的兔抗人IRGMa全长蛋白多克隆抗体的提取方法1、从人的外周静脉血抽提基因组DNA。2、引物设计及GST基因融合载体的选择选择了pCMV-迈yc，pGEX4T-2和Pet-28a(O-His载体，并选用限制性内切酶EcoRI和Xhol做为连接点；根据引物设计原则设计引物，做到同一条引物没有回文发夹结构，5'端与3'端的4个碱基不互补，正反向引物序列不互补，Tm值相近(2A+2T+4G+4C),且在Genebank上找不到同源系列；共设计了2对引物，序列如下第--对用于转载pCMViyc-IRGM和pGEX4T-2-IRGM载体IF:5，-AgCgAATTCCTATggAAgCCATgMTgTTg-3，(含EcoRI切点)1R:5，-gCgCTCgAgTTAgTATTCACATACCCgCTC-3，(含XhoI切点)第二对用于转载pET-28a(+)-IRGM载体2F:5，-AgCgAATTCATggAAgCCATgAATgTTg-3，(含EcoRl切点)2R:5，-gCgCTCgAgTTAgTATTCACATACCCgCTC-3，(含XhoI切点)3、制备目的基因片段并连接到myc，GST和His基因融合载体上以正常人基因组DNA为模板，分别釆用上述3对引物和普通Taq酶扩增IRGMa全长编码序列；应用TA克隆试剂盒将PCR产物分别连接到PCR2.1载体上，转化并挑取阳性TA克隆，摇菌(大肠杆菌DH5ci菌株，上海卓康生物科技有限公司)，并采用质粒抽提纯化试剂盒抽提纯化质粒；EcoRI和Xhol双酶切证实阳性TA克隆并采用T载体引物及ABIPRISMR3700DM序列分析仪测序鉴定连接在PCR2.1载体上的目的基因片段序列的正确性；正确的TA克隆采用应用EcoRI和Xhol双酶切，回收目的基因片段并连接到经过EcoRI和Xhol双酶切回收的myc,GST和His基因融合载体pCMV-myc，pGEX4T-2，pET-28a(+)-His上并转化；抽提质粒，测序验证。4、含目的基因片段的GST和His基因融合载体的表达鉴定分别挑取1粒转化好的GST和His基因融合载体克隆，用5ml2YT培养基摇菌(大肠杆菌origamiDE3，Novagen公司产品)，离心收集细菌并制备小量的GST和His基因融合蛋白，采用PAGE-SDS胶电泳分离蛋白片段，考马斯亮兰染色，显示GST和His基因融合蛋白片段大小。5、制备并纯化GST基因融合蛋白及收集目的蛋白大量制备GST基因融合蛋白，过柱纯化回收并定量，应用Thrombin23X:酶切过夜，或GST基因融合蛋白先挂GST珠子，用Thrombin23'C酶切过夜，第二天过柱收集IRGMa全长目的蛋白。6、大量制备His基因融合蛋白因IRGMa-His基因融合蛋白为不可溶的蛋白，故将离心收集的细菌用1X蛋白上样Buffer裂解后采用PAGE-SDS胶电泳分离蛋白片段，考马斯亮兰染色，显示His基因融合蛋白目的片段，割胶冻存于-80'(:冰箱备用。7、制备并纯化含GST-tag和His-tag的兔抗人IROIa全长蛋白多克蛰抗体:分别将由Thrombin酶切后回收的IRGMa蛋白和含His-IRGMa融合蛋白的PAGE胶与不完全弗氏佐剂匀浆后皮下多点注射免疫家兔，1个月后从家兔的耳缘静脉取血lml，凝固后离心取血清，ELISA方法检测IRGMa多克隆抗体的滴度，此时为l:2000;此后每7-14天用不完全弗氏佐剂与蛋白匀浆后加强免疫1次，每次注射前均从耳缘静脉取血lml,ELISA方法检测抗体滴度；加强免疫2次后，ELISA方法检测抗体的滴度达到了1:10000以上；采用免疫印迹方法验证抗体的特异性;从家兔颈动脉取血，离心收集抗体血清分装，采用ImmobilizedProteinAColumn(Pierce公司)纯化抗体，检测浓度并分装，保存于-80'C。8、兔抗人IRGMa多克隆抗体的应用(1)免疫印迹用pCMViyc-IRGMa转染的293T细胞，将收集的细胞裂解液按不同浓度上样电泳，转膜，5%脱脂奶粉做为封闭液，室温封闭蛋白电转膜60分种；兔抗人IRGMa多克隆抗体(浓度为5ug/ul)做为一抗，1:500-1:10000稀释，室温摇育2小时，或4度摇育过夜，1XTBST缓冲液摇洗3次，每次5分种；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG做为二抗，1:5000稀释，室温摇育45分钟，1XTBST缓冲液摇洗3次，每次5-15分种，辣根过氧化物底物显色，压片并冲片。(2)ELISA:将纯化的GST基因融合蛋白(抗原)按lng、2.5ng、5ng、10ng、100ng的量作一梯度，并将免疫前和免疫后血清按免疫前血清1:500、免疫后血清以1:500、1:1000、1:2000、1:5000、1:10000作一抗体梯度，免疫前血清作为对照，做ELISA。(3)细胞免疫荧光染色:将未转染的Jurkat细胞滴片于多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，4%多聚甲醛固定细胞，10%山羊血清室温封闭细胞60分钟；兔抗人丄RGMa抗体浓度为5ug/ul，1:100-1:200稀释，室温反应2小时，1XPBS摇洗3次，每次5-10分钟；带绿色荧光的羊抗兔IgG作为二抗，1:1000-1:2000稀释，室温反应30-60分钟，二抗封闭结束前5分钟，DAPI染核，1XPBS摇洗3次，每次5-10分钟；封片镜下观察。(4)免疫组化将多种人或小鼠的组织石蜡切片脱蜡并复水，3細202室温孵胄'10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馆水冲洗，PBS浸泡5分钟，再将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92°C-98-C之间并持续2分钟进行抗原热修复。10X正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37'C孵育1-2小时或4'C过夜。PBS冲洗，5分钟X3次。滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(19&BSA-PBS稀释)，37'C孵育30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37'C或室温孵育30分钟。PBS冲洗，5分钟X3次。滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，37C孵育30分钟。PBS冲洗，5分钟X3次。显色剂显色(DAB)。自来水充分冲洗，复染，封片。(5)组织免疫荧光将多种人或小鼠的组织石蜡切片脱蜡并复水，3細202室温孵育5-IO分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，再将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92'C-98'C之间并持续2分钟进行抗原热修复。10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加兔抗人IRGMa抗体浓度为5ug/ul，1:100-1:200稀释，室温反应2小时，1XPBS，冲洗3次，毎次10分钟；带绿色荧光的羊抗兔IgG作为二抗，1:100-1:200稀释，室温反应45分钟，二抗封闭结束前5分钟，DAPI染核，1XPBS冲洗3次，每次5分钟；封片镜下观察。本发明的有益效果是由于本发明设计并制备了兔抗人IRGMa全长蛋白多克隆抗体，涵盖了其主要的功能区，从而保证了抗体的高度特异性，有助于进行IRGM蛋白功能的研究及其在MS发病过程中的具体作用，从而对揭示MS的发病机制并寻找有效的基因免疫治疗措施有着积极的作用。图l是本发明抗体用于ELISA的结果照片。随着上样蛋白浓度的增高，抗原抗体反应明显增强，即使在lng的蛋白上样量时，免疫后血清在l:10000的稀释倍数下也与免疫前血清有着10倍的数量级差别，该结果表明，融合表达的IRGMa-GST蛋白和抗体具有特异的结合，且抗体的效价达到1:10000以上。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>图2本发^^抗体月目于免疫印迹的结:果照片。上样;l羊品为4T-2-IRGMa原核质粒表达的蛋白，艮PIRGMa-GST融合蛋白，大小约为46KDa，介于43和66KDa之间。4个泳道蛋白上样量一致，但杂交用的一抗不同。1:为免疫前血清l:500;2，3，4均为免疫后血清，稀释效价分别为l:2000,1:5000和l:10000。免疫印迹结果表明，在预期大小相应的位置出现特异条带，提示IRGMa-GST融合蛋白得以正确表达，也表明本发明抗体特异性好。图2本发明抗体用于免疫印迹的结果照片。l:为pCMV-myc-IRGMa转染的293T细胞，2:为未转的293T细胞。IRGMa-myc融合蛋白约24KDa，介于20.1和31KDa之间。免疫印迹结果表明，在预期大小相应的位置出现特异条带，提示IRGMa-myc融合蛋白得以正确表达，也表明本发明抗体特异性好。图4本发明抗体用于Jurkat细胞免疫荧光的照片。在所有Jurkat细胞的胞浆中都见到绿色荧光，说明Jurkat细胞具有IRGM蛋白的内源性表达，也表明本发明抗体特异性好。图5本发明抗体用于小鼠脊髄组织免疫荧光结果。在小鼠脊髓的神经元胞浆中见到颗粒状的红色荧光，说明在小鼠脊髄的神经元胞桨中存在IRGM蛋白的内源表达，也表明本发明抗体特异性好。图6本发明抗体用于人的胰腺组织的免疫组化结果。在胰岛细胞的胞浆中可见到颗粒状的棕色信号，在腺泡细胞中未见到，说明在人的胰岛细胞存在IRGM蛋白的内源表达，也表明本发明抗体特异性好。图7本发明抗体用于人的小脑组织的免疫组化结果。在小脑浦肯野氏细胞的胞浆和轴突中均见到颗粒状的棕色信号，而在分子层和颗粒细胞层未见到，说明IRGM蛋白在人的小脑的浦肯野氏细胞中有内源性表达，也表明本发明抗体特异性好。图8本发明抗体用于小鼠脊髄组织的免疫组化结果。在脊髓神经元胞浆和突起中均见到颗粒状的棕色信号，说明在小鼠脊髄的神经元胞浆中存在IRGM蛋白的内源表达，也表明本发明抗体特异性好。图9小鼠的胰腺组织免疫组化结果。在小鼠胰腺的胰岛周边细胞可见到颗粒状的棕色信号，在腺泡细胞中未见到，说明在小鼠的胰岛细胞存在IRGM蛋白的内源表达，也表明本发明抗体特异性好。具体实施例方式实施例h一种兔抗人IRGMa全长蛋白多克隆抗体的制备选用1、针对IRGM蛋白的共同功能区，选用涵盖IRGMa的1-182氨基酸的蛋白来制备抗体。2、根据引物设计原则自行设计两对引物，构建含IRGMa全长基因(546bp)的GST和His基因融合载体，制备涵盖IRGMa的1-182氨基酸的目的蛋白片段，表达GST和His基因融合蛋白，免疫家兔，2个月后从家兔颈动脉取血，离心收集抗体血清并纯化抗体。本实施例的兔抗人IRGMa全长蛋白多克隆抗体的具体提取方法1、从人的外周静脉血抽提基因组DNA:因IRGMa仅有一个外显子，从基因组DNA即能扩增到所要的蛋白编码序列。因此，首先从人的外周静脉血抽提基因组DNA。2、引物设计及GST基因融合载体的选择选择了pCMViyc,pGEX4T-2和Pet-28a(+)-His载体，并选用限制性内切酶EcoRI和Xhol做为连接点；根据引物设计原则设计引物，做到同一条引物没有回文发夹结构，5'端与3'端的4个碱基不互补，正反向引物序列不互补，Tm值相近(2A+2T+4G+4C)，且在Genebank上找不到同源系列；共设计了2对引物，序列如下第一对用于转载pCMV-myc-IRGM和pGEX4T-2-IRGM载体1F:5，-AgCgAATTCCTATggAAgCCATgAATgTTg-3，(含EcoRl切点)1R:5，-gCgCTCgAgTTAgTATTCACATACCCgCTC-3,(含XhoI切点)第二对用于转载pET-28a(+)-IRGM载体2卜、5，-AgCgAATTCATggAAgCCATgAATgTTg-3,(含EcoRI切点)2R:5，-gCgCTCgAgTTAgTATTCACATACCCgCTC-3，(含XhoI切点)上述2对引物用于PCR扩增构建质粒的目的基因片段。3、制备目的基因片段并连接到myc，GST和His基因融合載体上以正常人基因组DNA为模板，分别采用上述3对引物和普通T叫酶扩增IRGMa全长编码序列；应用TA克隆试剂盒将PCR产物分别连接到PCR2.1载体上，转化并挑取阳性TA克隆，摇菌(大肠杆菌DH5a菌株，本室保存)，并采用质粒抽提纯化试剂盒抽提纯化质粒；EcoRI和Xhol双酶切证实阳性TA克隆并采用T载体引物及AB1PR1SMR3700DNA序列分析仪测序鉴定连接在PCR2.1载体上的目的基因片段序列的正确性；正确的TA克隆采用应用EcoRI和XhoI双酶切，回收目的基因片段并连接到经过EcoRI和Xhol双酶切回收的myc，GST和His基因融合载体pCMV-myc，pGEX4T-2，pET-28a(+)-His上并转化；抽提质粒，测序验证。4、含目的基因片段的GST和His基因融合载体的表达鉴定分别挑取1粒转化好的GST和His基因融合载体克隆，用5ml2YT培养基摇菌(大肠杆菌origamiDE3，Novagen公司产品)，离心收集细菌并制备小量的GST和His基因融合蛋白，采用PAGE-SDS胶电泳分离蛋白片段，考马斯亮兰染色，显示GST和His基因融合蛋白片段大小。5、制备并纯化GST基因融合蛋白及收集目的蛋白大量制备GST基因融合蛋白，过柱纯化回收并定量，应用Thrombin23'C酶切过夜，或GST基因融合蛋白先挂GST珠子，用Thrombin23'C酶切过夜，第二天过柱收集IRGMa全长目的蛋白。6、大量制备His基因融合蛋白因IRGMa-His基因融合蛋白为不可溶的蛋白，故将离心收集的细菌用1X蛋白上样Buffer裂解后采用PAGE-SDS胶电泳分离蛋白片段，考马斯亮兰染色，显示His基因融合蛋白目的片段，割胶冻存于-8(TC冰箱备用。7、制备并纯化含GST-tag和His-tag的兔抗人IRGMa全长蛋白多充隆抗体:分别将由Thrombin酶切后回收的IRGMa蛋白和含His-IRGMa融合蛋白的PAGE胶与不完全弗氏佐剂匀浆后皮下多点注射免疫家兔，1个月后从家兔的耳缘静脉取血lml，凝固后离心取血清，ELISA方法检测IRGMa多克隆抗体的滴度，此时为l:2000;此后每14天用不完全弗氏佐剂与蛋白匀浆后加强免疫1次，每次注射前均从耳缘静脉取血lml,ELISA方法检测抗体滴度;加强免疫2次后，ELISA方法检测抗体的滴度达到了1:10000以上；采用免疫印迹方法验证抗体的特异性，结果证实该抗体具有高度特异性；从家兔颈动脉取血，离心收集抗体血清分装，采用ImmobilizedProteinAColumn(Pierce公司)纯化抗体，检测浓度并分装，保存于-80'C。8、兔抗人IRGMa多克隆抗体的应用(l)免疫印迹用pCMV-myc-IRGMa转染的293T细胞，将收集的细胞裂解液按不同浓度上样电泳，转膜，5%脱脂奶粉做为封闭液，室温封闭蛮白电转膜60分种；兔抗人IRGMa多克隆抗体(浓度为5yg/ul)做为一抗，1:500-1:10000稀释，室温摇育2小时，或4度摇育过夜，1XTBST缓冲液摇洗3次，每次5分种；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG做为二抗，1:5000稀释，室温摇育45分钟，1XTBST缓冲液摇洗3次，每次5-15分种，辣根过氧化物底物显色，压片并冲片。(2〉ELISA:将纯化的GST基因融合蛋白(抗原)按lng、2.5ng、5ng、10ng、100ng的量作一梯度，并将免疫前和免疫后血清按免疫前血清1:500、免疫后血清以1:500、1:1000、1:2000、1:5000、1:10000作一抗体梯度，免疫前血清作为对照，做ELISA，结果如图2所提供。(3)细胞免疫荧光染色:将未转染的Jurkat细胞滴片于多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，4%多聚甲醛固定细胞，10%山羊血清室温封闭细胞60分钟；兔抗人IRGMa抗体浓度为5ug/ul，1:100-1:200稀释，室温反应2小时，1XPBS摇洗3次，每次5-10分钟；带绿色荧光的羊抗兔IgG作为二抗，1:1000-1:2000稀释，室温反应30-60分钟，二抗封闭结束前5分钟，DAPI染核，1XPBS摇洗3次，每次5-IO分钟；封片镜下观察。(4)免疫组化将多种人或小鼠的组织石蜡切片脱蜡并复水，3細202室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，再将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92"C-98'C之间并持续2分钟进行抗原热修复。10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37'C孵育1-2小时或4'C过夜。PBS冲洗，5分钟X3次。滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释)，37T孵育30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37'C或室温孵育30分钟。PBS冲洗，5分钟X3次。滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，37'C孵育30分钟。PBS冲洗，5分钟X3次。显色剂显色(DAB)。自来水充分冲洗，复染，封片。(5)组织免疫荧光将多种人或小鼠的组织石蜡切片脱蜡并复水，3%H202室温孵育5-IO分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，再将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92'C-98'C之间并持续2分钟进行抗原热修复。10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加兔抗人IRGMa抗体浓度为5ug/ul,1:100-1:200稀释，室温反应2小时，1XPBS，冲洗3次，每次10分钟；带绿色荧光的羊抗兔IgG作为二抗，1:100-1:200稀释，室温反应45分钟，二抗封闭结束前5分钟，DAPI染核，1XPBS冲洗3次，每次5分钟；封片镜下观察。<no><120><160>SEQUENCELISTING复旦大学附属华山医院兔抗人I股la全长蛋白多克隆抗体的稱备和应用"70>Patentlnversion3，J<210>1<211>203<212>DNA<213>Helicobacterpylori<柳>1ATCGAAGCCMetGluAla1ATGMetAAT5GTTGAGAAAValGluLysAlaSer10AlaGATAspGGGGlyAACAsnTTGCCALeuPro15GAGGluCTGVallieTCT60Ser加AACATCAAGAsnlieLysAspTCTG(iCSerGlyGAGGluAATA幼ACTThr幼GGGGly45CTGAAGATALeul,ysHeATGTCCMetSerThrCTGTCCValSer30TTCATCPhelie50AGGArgACTSerACAThrGCCAlaCCAProCTTILeuGTTValOGAArgAACATCAsnlie35AACAsn诉ThrACTThrGGAGyATCMetCAT附sGCAAlaGAGGluGCGGly40OGTGly60l加l幼AAGLysGOCTCAAlaSerCCTProCCTPro65ACTGAGThrGluCTCLeuGTAAAAGtaLys70GCTAlaACCThrCAAGinAGAArgTGTCys75GCCAlaTOCSerTATTyrTTCPheTCTSer幼240TCCSerereLeuCACTTTHisPheGAGAACGluAsnSerTACTyrAATAsn85CTGLeul肪GTCGTCValValATGGAAMetGluTTGLeuATGMetTT>GGACTrpAsp90CAGTTCGinPhe110CTGLeuAACAsnCCTProGGGArg卿GlyTATTyrACAThrGACAspGGGGly诉TTCPhe115TCTSerATClieGCCAlaATGMetACCThrCTTValThrGCAAlaACCThr100TCTSer120300360GCACAATTCAGCATCAATCATGTCATCCTTGCCMAACCGtTGAGGACATGCCAAAGAM!AlaGinPheSerMetAsnHisValMetLeuAlaLysThrAlaGluAspMetGlyLysLys1251301351404加TTCTACATTGTCTCGACCAAGCTAGACATGGACCTCAGCACACGTGCCOCOCAGAAGTCPheTyrUeValTipThrLysUuAspMetAspLeuSerThrGlyAlaLeuProGluVal145150155l柳柳CAGCTACTGCAlGATCAGAGAAAATGTCCTGGAAAATCTCCAGAAGGAGCGGGTATGTGAA540GinLeuLeuGinlieArgGluA幼ValLeuGluA幼Leuf'lnLysG]uArgVa3QysGlu165TACTAATyr*18217017518054618权利要求1、一种兔抗人IRGMa全长蛋白多克隆抗体的制备选用，其特征是针对IRGM蛋白的功能区，选用IRGMa来制备抗体；选择GST和His基因融合蛋白的方法来制备目的蛋白片段。2、根据权利要求l所述的制备选用，其特征是表达GST和His基因融合蛋白，必须构建含IRGMa全长基因546bp的GST和His基因融合载体；根据引物设计原则设计引物。3、本发明的兔抗人IRGMa全长蛋白多克隆抗体的提取方法1)从人的外周静脉血抽提基因组DNA;2)引物设计及GST基因融合载体的选择选择了pCMV-myc，pGEX4T-2和Pet-28a(+)-His载体，并选用限制性内切酶EcoRI和Xhol做为连接点；根据引物设计原则设计引物，做到同一条引物没有回文发夹结构，5'端与3'端的4个碱基不互补，正反,引物序列不互补，Tm值相近(2A+2T+4G+4C),且在Genebankh找不到同源系列；共设计了2对引物，序列如下第-对用亍转载pCMV-myc-IRGM和pGEX4T-2-IRGM载体''5，-AgCgAATTCCTATggAAgCCATgAATgTTg-3，，含EcoRI切点；IK:5，-gCgCTCgAgTTAgTATTCACATACCCgCTC-3，，含XhoI切点；第二对用于转载pET-28a(+)-IRGM载体2F:5，-AgCgAATTCATggMgCCATgAATgTTg^3,,含EcoRI切点；2R:5，-gCgCTCgAgTTAgTATTCACATACCCgCTC-3，，含XhoI切点；3)制备目的基因片段并连接到inyc,GST和His基因融合载体上以正常人基l夭l组DNA为模板，分别采用上述2对引物和普通Taq酶扩增IRGMa全长编码序列；应用TA克隆试剂盒将PCR产物分别连接到PCR2.1载体上，转化并挑取阳忭TA克隆，摇菌，并采用质粒抽提纯化试剂盒抽提纯化质粒；EcoRI和XhoI双酶切证实阳性TA克隆并采用T载体引物及ABIPRISMR3700DNA序列分析仪测序鉴定连接在PCR2.1载体上的目的基因片段序列的正确性；正确的TA克隆采用应用EcoRI和Xhol双酶切，回收目的基因片段并连接到经过EcoRI和Xhol双酶切回收的myc，GST和His基因融合载体pCMV-myc，pGEX4T-2，pET-28a(+)-His上并转化；抽提质粒，测序验证；4)含目的基因片段的GST和His基因融合载体的表达鉴定分别挑取1粒转化好的GST和His基因融合载体克隆，用5ml2YT培养基摇菌，离心收集细菌并制备小量的GST和His基因融合蛋白，采用PAGE-SDS胶电泳分离蛋白片段，考马斯亮兰染色，显示GST和His基因融合蛋白片段大小；5)制备并纯化GST基因融合蛋白及收集目的蛋白大量制备GST基因融合蛋白，过柱纯化回收并定量，应用Thrombin23'C酶切过夜，或GST基因融合蛋白先挂GST珠子，用Thrombin23'C酶切过夜，第二天过柱收集IRGMa全长目的蛋白*,6)大量制备His基因融合蛋白因IRGMa-His基因融合蛋白为不可溶的蛋白，将离心收集的细菌用1X蛋白上样Buffer裂解后采用PAGE-SDS胶电泳分离蛋白片段，考马斯亮兰染色，显示His基因融合蛋白目的片段，割胶冻存于-80'C冰箱备用；7)制备并纯化含GST-tag和His-tag的兔抗人IRGMa全长蛋白多吏隆抗体:分别将由Thrombin酶切后回收的IRGMa蛋白和含His-IRGMa融合蛋白的PAGE胶与不完全弗氏佐剂匀浆后皮下多点注射免疫家兔，1个月后从家兔的耳缘静脉取血lml，凝固后离心取血清，ELISA方法检测IRGMa多克隆抗体的滴度，为1:2000:后每7-14天用不完全弗氏佐剂与蛋白匀浆后加强免疫1次，每次注射前均从耳缘静脉取血lml，ELISA方法检测抗体滴度；加强免疫2次后，ELISA方法检测抗体的滴度达到了1:10000以上；采用免疫印迹方法验证抗体的特异性；从家兔颈动脉取血，离心收集抗体血清分装，采用ImmobilizedProteinAColumn纯化抗体，检测浓度并分装，保存于-80'C。4、兔抗人IRGMa多克隆抗体的应用l)免疫印迹用pCMV-myc-IRGMa转染的293T细胞，将收集的细胞裂解液按不同浓度i:样电泳，转膜，5%脱脂奶粉做为封闭液，室温封闭蛋白电转膜60分种兔抗人IRGMa多克隆抗体浓度为5ug/ul做为一抗，1:500-1:10000稀释，室温摇育2小时，或4度摇育过夜，1XTBST缓冲液摇洗3次，每次5分种'.辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG做为二抗，1:5000稀释，室温摇育45分钟，1XTBST缓冲液摇洗3次，每次5-15分种，辣根过氧化物底物显色，压片并冲片；2)ELISA:将纯化的GST基因融合蛋白抗原按lng、2.5ng、5ng、10ng、100ng的量作一梯度，并将免疫前和免疫后血清按免疫前血清1:500、免疫后血清以1:500、1:1000、1:2000、1:5000、1:10000作一抗体梯度，免疫前血清作为对照，做ELISA;3)细胞免疫荧光染色将未转染的Jurkat细胞滴片于多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，4%多聚甲醛固定细胞，10%山羊血清室温封闭细胞60分钟；兔抗人IRGMa抗体浓度为5ug/ul，1:100-1:200稀释，室温反应2小时，1XPBS摇洗3次，每次5-10分钟；带绿色荧光的羊抗兔IgG作为二抗，1:1000-1:2000稀释，室温反应30-60分钟，二抗封闭结束前5分钟，DAPI染核，1XPBS摇洗3次，每次5-IO分钟；封片镜下观察4)免疫组化将多种人或小鼠的组织石蜡切片脱蜡并复水，39&H202室温孵育10分钟；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，再将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92^C-98'C之间并持续2分钟进行抗原热修复；10X正常山羊血清PBS稀释封闭，室温孵育10分钟；倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37'C孵育1-2小时或4'C过夜；PBS冲洗，5分钟X3次；滴加适当比例稀释的生物素标记二抗1紐SA-PBS稀释，37。C孵育30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37'C或室温孵育30分钾；PBS冲洗，5分钟X3次；滴加适当比例稀释的辣根酶标记链奪卵白素PBS稀释，37。C孵育30分钟；PBS冲洗，5分钟X3次；显色剂显色DAB;自来水充分冲洗，复染，封片；5)组织免疫荧光将多种人或小鼠的组织石蜡切片脱蜡并复水，3細202室温孵育5-IO分钟；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，再将切片放入盛有枸槺酸盐续2分钟进行抗原热修复；10%正常山羊血清PBS稀释封闭，室温孵育10分钟;倾去血清，勿洗，滴加；兔抗人IRGMa抗体浓度为5ug/ul，1:100-1:200稀释，室温反应2小时，1XPBS，冲洗3次，每次10分钟；带绿色荧光的羊抗兔IgG作为二抗，1:100-1:200稀释，室温反应45分钟，二抗封闭结束前5分钟，DAPI染核，1XPBS冲洗3次，每次5分钟；封片镜下观察。5、IRGM基因中优选出一段编码序列，SEQUENCELISTING:AT(;Met1AACAsnGACAspAAGTCCCTGGCAAlaTTCPhe(;lnTAC'Tyr(;AA(;luArcUeTCTSer(;CCAlaCACHisGAGGluCMGinTACTyr('TA谨氺182(;ccAlaAA(;LysGGCGlyATGMetGAGGluAATAsnTCASerTTTl'h('MCAsnTTCPheATTTie(T(;CCTProTCASerTACTyrAGCSerGTCValCA(;GinAATAsn5ACTThr25GGGGly45CCTPro65AATAsn85CTGLeu105ATGMet125TGGTrp145ATClie165GTTValCTGLeuATGMetACTThrGTGValATGMetAATAsnACCThrAGAArgGAGGluAAGLysTCCSerGAGGluGTGValGAAGluCATHisAAGLysGAAGluAAALysATAlieACCThrCTGLeuTTGLeuATGMetGTCValCTALeuAATAsnGCCAlaGTGValTTCPheGTAGtaTGGTrpCAGGinATGMetGACAspGTCValTCASer10TCCSer30ATClie50AAALys70GACAsp90TTCPhe110CTTLeu130ATGMet150CTGLeu170GCAAlaAGGArgAGTSerGCTAlaCTGLeuMCAsnGCCAlaGACAspGAAGluGATGGGAACAspGlyAsnACACCAGTTThrProValGCCCTTCGAAlaLeuArgACCCMAGAThrGinArgCCTGGCACAProGlyThrCGGTATGACArgTyrAspAAAACCGCTLysThrAlaCTCAGCACALeuSerThrAATCTCCAGAsnLeuGinTTGLeu15AACAsn35AACAsn55TGTCys75GGGGly95TTCPhe115GAGGlu135GGTGly155AAGLys175CCAProATClieACAThrGCCAlaTCTSerATClieGACAspGCCAlaGAGGluGAGGluACTThrGGAGlyTCCSerGCCAlaATGMetATGMetCTCLeuCGGArgGTGValATGMetCATHisTATTyrACCThrGTTValGGAGlyCCAProGTAValATClieGCAAlaGAGGluTTCPheACAThrGCAAlaAAGLysGAAGluTGTCysTCTSer20GGGGly40GGTGly60TCTSer80ACCThr100TCTSer120MGLys140GTGVal160GAAGlu1806012018024030036042048054054全文摘要本发明公开了兔抗人IRGMa全长蛋白多克隆抗体的制备和应用，属中药单体干预疾病的领域。本发明选定全长IRGMa蛋白来制备抗体，包括了所有的功能区。在优选的基础上还提出了其制备方法，并根据引物设计原则设计引物，构建含IRGMa全长基因的His和GST融合蛋白来制备抗体。本发明所制备的抗体具有高度特异性和敏感性，有助于研究IRGM基因的表达谱分析及功能，并研究IRGM在MS发病过程中的具体作用，从而揭示MS的发病机制并寻找有效的基因免疫治疗措施。因此，人参皂甙Rg1有一定的干预多发性硬化的作用。本发明的人参皂甙Rg1可以明显降低多发性硬化的动物模型—EAE小鼠的发病率。文档编号C12N15/12GK101337991SQ20081007069公开日2009年1月7日申请日期2008年3月3日优先权日2008年3月3日发明者吴志英,柠王申请人:复旦大学附属华山医院;福建医科大学附属第一医院