专利名称：兔抗人ATP7Bn33－629多克隆抗体的优选与提取法的制作方法
技术领域：
本发明涉及早期基因诊断疾病的方法，具体的说是对肝豆状核变性病的兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗体的优选与提取法。
背景技术：
肝豆状核变性，又称Wilson病(WD)，是一种较常见的常染色体隐性遗传病。致病基因为ATP7B基因，编码ATP7B蛋白。其发病与ATP7B基因突变导致ATP7B蛋白功能下降有关，但具体发病机制迄今不清。由于基因突变造成蛋白功能改变，使金属铜和铜蓝蛋白前体的结合能力下降，导致铜从肝脏经胆管分泌到胆汁的量减少，而大量蓄积于肝脏、肾脏、脑和角膜，临床上出现相应的症状，表现为肝肾损害、锥体外系病变、智能障碍及角膜色素环等。尽管驱铜治疗对本病有一定疗效，但有赖于早期诊断和治疗。由于本病早期症状通常不典型且表现多样化，极易被误诊而延误治疗，故病残率和病死率均很高，给患者家庭和社会带来沉重的负担。因此，只有进行ATP7B蛋白功能的研究，从而揭示WD发病机制，才能从根本上解决WD的早期诊断和治疗问题。
研究ATP7B蛋白的功能及其致病机制，高质量的ATP7B抗体是必备条件。研究发现，ATP7B基因定位于13q14.3，编码1466个氨基酸的ATP7B蛋白，它是一种膜蛋白，参与铜跨膜转运的代谢过程，其N-末端有6个铜结合位点，含有8个跨膜区，可转运铜透过细胞膜，因此，N-末端是该蛋白的主要功能区。由于ATP7B基因编码区cDNA长达4398bp，要制备涵盖全长编码区的ATP7B抗体十分困难，所以目前国外学者制备的ATP7B抗体均为N端涵盖数个或数十个氨基酸的抗体或C端抗体，未包括主要功能区。此类抗体的敏感性虽然较高，但抗体的特异性不够，限制了抗体使用的深度和广度，如仅能用于免疫印迹或仅能用于免疫组化，并且容易导致假阳性结果，因此不是最佳ATP7B抗体。
发明内容
本发明的目的是在ATP7B基因中优选出一段编码序列，并制备出多克隆抗体的提取方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是制备抗体，首先必须合成制备抗体的蛋白。选用哪一段蛋白来制备抗体及如何合成正确序列的蛋白是本发明的关键。由于ATP7B基因长达4398bp，要制备全长编码区的ATP7B蛋白十分困难，也无必要；但如果仅合成N端数十个氨基酸的蛋白来制备抗体，可能导致抗体特异性不够高。一种兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗体的优选，其特征是针对ATP7B蛋白的功能区，选定涵盖N端33至629位氨基酸的蛋白来制备抗体，包括了N端6个铜结合位点和4个重要跨膜区。
直接通过合成多肽来合成这么大片段且编码正确的蛋白十分昂贵，也是不现实的，因此本发明选择GST基因融合蛋白的方法来制备该目的蛋白片段。所述的GST基因融合蛋白，必须构建含ATP7B基因N端33至629位氨基酸(1791bp)目的片段的GST基因融合载体；根据引物设计原则自行设计引物。
本发明的兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗体的具体提取方法1、制备正常人全长编码区cDNA片段新鲜肝脏组织来源于急性肝外伤手术患者，组织一经离体，迅速放置液氮中；称取50mg肝脏组织，加入1mlTRIZOL液体，匀浆器捣烂组织，混匀后转移至1.5ml的Eppendorf(Ep)管中。加入150～250μl氯仿，用力上下甩动，使TRIZOL与氯仿充分混匀，冰浴5～10分钟，4～10℃10000～13000离心10～30分钟；小心吸取上清移至一个新的1.5ml Ep管中，加入450～550μl异丙醇，轻轻翻转Ep管5～15次，置冰浴5～15分钟，4～10℃10000～13000离心5～15分钟，见管底有白色沉淀；去上清，往沉淀中加入0.2～1ml 70～75％乙醇，振荡，4～10℃7000～10000g离心3～8分钟；去上清，翻转Ep管，室温干燥沉淀15～30分钟。溶解沉淀后-80℃保存备用。将此RNA用逆转录试剂盒(Invitrogen公司)逆转录成cDNA，即为正常人全长编码区cDNA片段。
2、引物设计及GST基因融合载体的选择要保证长达1791bp的PCR扩增产物片段(目的基因片段)正确无误，引物的设计至关重要。为了保证目的基因片段(ATP7B基因N端33-629氨基酸片段)与GST基因融合载体连接后，氨基酸编码不发生移码改变，在众多的GST基因融合载体中，我们选择了pGEX4T-1载体，并选用限制性内切酶SalI和NotI做为连接点。之所以选择这2种内切酶，是因为ATP7B基因N端33-629氨基酸片段上没有这2个切点，而且它们也是比较常见的限制性内切酶。引物设计通常采用引物设计软件，但在此处，我们不用引物设计软件，根据引物设计原则自行设计引物，做到同一条引物没有回文发夹结构，5’端与3’端的4个碱基不互补，正反向引物序列不互补，Tm值相近(2A+2T+4G+4C)，且在Genebank上找不到同源系列。共设计了6条引物，序列如下1R 5’-gTCgACCAATGAAGAAGAGT-3’(含SalI切点)1F 5’-gCggCCg_cATgAAAgCCAAT-3’(含NotI切点)2R 5’-gAAAggCATCATCAgCATgAAgg-3’3F 5’-gCAggTCATgCCCTCCACCCg-3’4R 5’-gggACCAATTgATATTgAgCg-3’5F 5’-gCCTTTCCTgCCATCAAgg-3’1R和1F用于PCR扩增目的基因片段，即ATP7B基因N端33-629氨基酸片段，2R、3F、4R和5F用来测序证实所扩增的目的基因片段序列。
3、制备目的基因片段并连接到GST基因融合载体上以正常人全长编码区cDNA片段为模板，采用引物1R、1F和高保真PCR扩增试剂盒扩增ATP7B基因N端97～1887cDNA序列。应用TA克隆试剂盒将PCR产物连接到PCR2.1载体上，转化并挑取阳性TA克隆，摇菌并采用质粒抽提纯化试剂盒抽提纯化质粒。SalI和NotI双酶切证实阳性TA克隆并采用引物2R、3F、4R和5F及ABIPRISMR3700 DNA序列分析仪测序鉴定连接在PCR2.1载体上的目的基因片段序列的正确性。共挑取了56个阳性TA克隆才挑到了一个序列完全正确的克隆。应用SalI和NotI双酶切正确的TA克隆，回收目的基因片段并连接到经过SalI和NotI双酶切回收的GST基因融合载体(pGEX4T-1)上并转化。
4、含目的基因片段的GST基因融合载体的表达鉴定挑取1粒转化好的GST基因融合载体克隆，用5ml 2YT培养基摇菌，离心收集细菌并制备小量的GST基因融合蛋白，采用PAGE-SDS胶电泳分离蛋白片段，考马斯兰染色，结果显示GST基因融合蛋白片段大小正确，表达良好。
5、制备并纯化GST基因融合蛋白及收集目的蛋白大量制备GST基因融合蛋白，过柱纯化回收并定量，应用Thrombin 4～15℃酶切过夜，第二天过柱收集ATP7Bn33-629目的蛋白，采用PAGE-SDS胶进一步确认目的蛋白的片段和纯度并检测蛋白浓度。
6、制备并纯化兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗体(Rabbit anti-humanATP7Bn33-629 polyclonal antibody)ATP7Bn33-629目的蛋白与佐剂匀浆后皮下多点注射免疫家兔，1个月后从家兔的耳缘静脉取血1ml，凝固后离心取血清，ELISA方法检测ATP7Bn33-629多克隆抗体的滴度，此时为1∶2000。此后每7～14天加强免疫1次，每次均从耳缘静脉取血1ml，ELISA方法检测抗体滴度。加强免疫3次后，ELISA方法检测抗体的滴度达到了1∶16000。采用免疫印迹方法验证抗体的特异性，结果证实该抗体具有高度特异性，无非特异性条带。上述结果提示该抗体的敏感性和特异性均很高。此时，从家兔心脏穿刺取血，离心收集抗体血清分装，采用Immobilized ProteinAColumn(Pierce公司)纯化抗体，检测浓度并分装，保存于-20℃。我们将该抗体命名为兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗体(Rabbitanti-human ATP7Bn33-629 polyclonal antibody)。
7、兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗体的应用
(1)免疫印迹2.5～10％脱脂奶做为封闭液，室温封闭蛋白电转膜30～60分种；兔抗人ATP7Bn33-629抗体(浓度为5μg/μl)做为一抗，1∶500～1∶1000稀释，室温摇育2～6小时或4～8℃摇育过夜，1XTBST缓冲液摇洗3次，每次5～15分种；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG做为二抗，1∶5000～1∶10000稀释，室温摇育45～90分钟，1XTBST缓冲液摇洗3次，每次5～15分种，辣根过氧化物底物显色，压片并冲片。结果见图1。
(2)免疫荧光染色ATP7B表达质粒转染CHO细胞，4～8％多聚甲醛固定细胞，5～10％山羊血清室温封闭细胞30～60分钟；兔抗人ATP7Bn33-629抗体(浓度为5μg/μl)1∶50～1∶150稀释，室温反应1～3小时，1XPBS摇洗3次，每次5～10分种；带红色荧光的羊抗兔IgG作为二抗，1∶100～1∶300稀释，室温反应30～60分钟，1XPBS摇洗3次，每次5～10分钟；封片镜下观察，结果见图2。
本发明的有益效果是由于本发明设计并制备了兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗体，含ATP7B蛋白N端的近600个氨基酸，涵盖了其主要的功能区，即N端的6个铜结合位点和4个重要跨膜区，从而保证了抗体的高度特异性，有助于进行ATP7B蛋白功能的研究及WD的早期快速基因诊断。同时本发明在优选的基础上提出了其制备的提取方法，故对于肝豆状核变性病的早期基因诊断有着极积的作用。
图1是本发明抗体用于免疫印迹的结果照片。标记1为不表达ATP7B蛋白的样品；3和4为ATP7B蛋白阳性表达的样品。片段大小为163Kd，介于97Kd和220Kd之间。
图2是本发明转染细胞(带红色荧光)与未转染上ATP7B表达质粒的细胞相间生长镜下图。
具体实施例方式
实施例1针对ATP7B蛋白的功能区，选定涵盖N端33至629位氨基酸的蛋白来制备抗体，包括了N端的6个铜结合位点和4个重要跨膜区。
实施例2选择GST基因融合蛋白的方法来制备该目的蛋白片段，GST基因融合蛋白，必须构建含ATP7B基因N端33至629位氨基酸(1791bp)目的片段的GST基因融合载体；根据引物设计原则自行设计引物。
具体提取方法1、制备正常人全长编码区cDNA片段新鲜肝脏组织来源于急性肝外伤手术患者，组织一经离体，迅速放置液氮中；称取50mg肝脏组织，加入1ml TRIZOL液体，匀浆器捣烂组织，混匀后转移至1.5ml的Eppendorf(Ep)管中。加入200μl氯仿，用力上下甩动，使TRIZOL与氯仿充分混匀，冰浴5分钟，4℃12000g离心15分钟；小心吸取上清移至一个新的1.5ml Ep管中，加入500μl异丙醇，轻轻翻转Ep管5次，置冰浴10分钟，4℃ 12000g离心10分钟，见管底有白色沉淀；去上清，往沉淀中加入1ml 75％乙醇，振荡，4℃ 7500g离心5分钟；去上清，翻转Ep管，室温干燥沉淀20分钟，溶解沉淀后-80℃保存备用。将此RNA用逆转录试剂盒(Invitrogen公司)逆转录成cDNA，即为正常人全长编码区cDNA片段。
2、引物设计及GST基因融合载体的选择为了保证目的基因片段(ATP7B基因N端33-629氨基酸片段)与GST基因融合载体连接后，氨基酸编码不发生移码改变，在众多的GST基因融合载体中，选择了pGEX4T-1载体，并选用限制性内切酶SalI和NotI做为连接点，因为ATP7B基因N端33-629氨基酸片段上没有这2个切点，而且它们也是比较常见的限制性内切酶。引物设计通常采用引物设计软件，但在此处，不用引物设计软件，根据引物设计原则自行设计引物，做到同一条引物没有回文发夹结构，5’端与3’端的4个碱基不互补，正反向引物序列不互补，Tm值相近(2A+2T+4G+4C)，且在Genebank上找不到同源系列。共设计了6条引物，序列如下1R 5’-gTCgACCAATGAAGAAGAGT-3’(含SalI切点)1F 5’-gCggCCg_ccATgAAAgCCAAT-3’(含NotI切点)2R 5’-gAAAggCATCATCAgCATgAAgg-3’3F 5’-gCAggTCATgCCCTCCACCCg-3’4R 5’-gggACCAATTgATATTgAgCg-3’5F 5’-gCCTTTCCTgCCATCAAgg-3’1R和1F用于PCR扩增目的基因片段，即ATP7B基因N端33-629氨基酸片段，2R、3F、4R和5F用来测序证实所扩增的目的基因片段序列。对于1F和1R引物设计是有一定技巧的，在1F的5’端添加了SalI切点序列gTCgAC，其后的碱基序列与ATP7B基因N端33-36氨基酸片段一致，1R为反向序列，在其5’端添加了NotI切点序列gCggCCgC，其后的碱基序列与ATP7B基因N端625-629氨基酸片段一致，使目的基因片段可通过SalI和NotI双酶切连到pGEX4T-1载体上。值得一提的是，在1F和1R引物的3’端均以A收尾，而不是常规的以G或C收尾，目的是为了做TA克隆时更容易挑到阳性克隆。2R、3F、4R和5F引物设计遵从常规引物设计原则即可。
3、制备目的基因片段并连接到GST基因融合载体上以正常人全长编码区cDNA片段为模板，采用引物1R、1F和高保真PCR扩增试剂盒扩增ATP7B基因N端97-1887cDNA序列。应用TA克隆试剂盒将PCR产物连接到PCR2.1载体上，转化并挑取阳性TA克隆，摇菌并采用质粒抽提纯化试剂盒抽提纯化质粒。SalI和NotI双酶切证实阳性TA克隆并采用引物2R、3F、4R和5F及ABIPRISMR3700 DNA序列分析仪测序鉴定连接在PCR2.1载体上的目的基因片段序列的正确性。共挑取了56个阳性TA克隆挑到了一个序列完全正确的克隆。应用SalI和NotI双酶切正确的TA克隆，回收目的基因片段并连接到经过SalI和NotI双酶切回收的GST基因融合载体(pGEX4T-1)上并转化。
4、含目的基因片段的GST基因融合载体的表达鉴定挑取1粒转化好的GST基因融合载体克隆，用5ml 2YT培养基摇菌，离心收集细菌并制备小量的GST基因融合蛋白，采用PAGE-SDS胶电泳分离蛋白片段，考马斯兰染色，结果显示GST基因融合蛋白片段大小正确，表达良好。
5、制备并纯化GST基因融合蛋白及收集目的蛋白大量制备GST基因融合蛋白，过柱纯化回收并定量，应用Thrombin 4～15℃酶切过夜，第二天过柱收集ATP7Bn33-629目的蛋白，采用PAGE-SDS胶进一步确认目的蛋白的片段和纯度并检测蛋白浓度。
6、制备并纯化兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗体(Rabbit anti-humanATP7Bn33-629 polyclonal antibody)ATP7Bn33-629目的蛋白与佐剂匀浆后皮下多点注射免疫家兔，1个月后从家兔的耳缘静脉取血1ml，凝固后离心取血清，ELISA方法检测ATP7Bn33-629多克隆抗体的滴度，此时为1∶2000。此后每7～14天加强免疫1次，每次均从耳缘静脉取血1ml，ELISA方法检测抗体滴度。加强免疫3次后，ELISA方法检测抗体的滴度达到了1∶16000。采用免疫印迹方法验证抗体的特异性，结果证实该抗体具有高度特异性，无非特异性条带。此时，从家兔心脏穿刺取血，离心收集抗体血清分装，采用ImmobilizedProteinAColumn(Pierce公司)纯化抗体，检测浓度并分装，保存于-20℃。
7、兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗体的应用(1)免疫印迹(请参阅图1)2.5～10％脱脂奶做为封闭液，室温封闭蛋白电转膜30～60分种；兔抗人ATP7Bn33-629抗体(浓度为5μg/μl)做为一抗，1∶500～1∶1000稀释，室温摇育2～6小时或4～8℃摇育过夜，1XTBST缓冲液摇洗3次，每次5～15分种；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG做为二抗，1∶5000～1∶10000稀释，室温摇育45～90分钟，1XTBST缓冲液摇洗3次，每次5～15分种，辣根过氧化物底物显色，压片并冲片。
(2)免疫荧光染色(请参阅图2)ATP7B表达质粒转染CHO细胞，4～8％多聚甲醛固定细胞，5～10％山羊血清室温封闭细胞30～60分钟；兔抗人ATP7Bn33-629抗体(浓度为5μg/μl)1∶50～1∶150稀释，室温反应1～3小时，1XPBS摇洗3次，每次5～10分种；带红色荧光的羊抗兔IgG作为二抗，1∶100～1∶300稀释，室温反应30～60分钟，1XPBS摇洗3次，每次5～10分钟；封片镜下观察。
权利要求
1.一种兔抗人ATP7Bn33-629多克隆体的优选，其特征是针对ATP7B蛋白的功能区，选定涵盖N端33至629位氨基酸的蛋白来制备抗体，包括了N端的6个铜结合位点和4个重要跨膜区。
2.一种兔抗人ATP7Bn33-629多克隆体的优选，其特征是选择GST基因融合蛋白的方法来制备该目的蛋白片段，所述的GST基因融合蛋白，必须构建含ATP7B基因N端33至629位氨基酸(1791bp)目的片段的GST基因融合载体；根据引物设计原则自行设计引物。
3.本发明的兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗体的具体提取方法(1)制备正常人全长编码区cDNA片段新鲜肝脏组织来源于急性肝外伤手术患者，组织一经离体，迅速放置液氮中；称取50mg肝脏组织，加入1mlTRIZOL液体，匀浆器捣烂组织，混匀后转移至1.5ml的Eppendorf(Ep)管中。加入150～250μl氯仿，上下甩动，使TRIZOL与氯仿充分混匀，冰浴5～10分钟，4～10℃10000～13000离心10～30分钟；吸取上清移至一个新的1.5ml Ep管中，加入450～550μl异丙醇，轻轻翻转Ep管5～15次，置冰浴5～15分钟，4～10℃10000～13000离心5～15分钟，见管底有白色沉淀；去上清，往沉淀中加入0.2～1ml70～75％乙醇，振荡，4～10℃7000～10000g离心3～8分钟；去上清，翻转Ep管，室温干燥沉淀15～30分钟；溶解沉淀后-80℃保存备用。将此RNA用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，即为正常人全长编码区cDNA片段；(2)引物设计及GST基因融合载体的选择选择了pGEX4T-1载体，并选用限制性内切酶SalI和NotI做为连接点；根据引物设计原则自行设计引物，做到同一条引物没有回文发夹结构，5’端与3’端的4个碱基不互补，正反向引物序列不互补，Tm值相近(2A+2T+4G+4C)，且在Genebank上找不到同源系列；共设计了6条引物，序列如下1R 5’-gTCgACCAATGAAGAAGAGT-3’(含SalI切点)1F 5’-gCggCCgcATgAAAgCCAAT-3’(含NotI切点)2R 5’-gAAAggCATCATCAgCATgAAgg-3’3F 5’-gCAggTCATgCCCTCCACCCg-3’4R 5’-gggACCAATTgATATTgAgCg-3’5F 5’-gCCTTTCCTgCCATCAAgg-3’1R和1F用于PCR扩增目的基因片段，即ATP7B基因N端33-629氨基酸片段，2R、3F、4R和5F用来测序证实所扩增的目的基因片段序列；(3)制备目的基因片段并连接到GST基因融合载体上以正常人全长编码区cDNA片段为模板，采用引物1R、1F和高保真PCR扩增试剂盒扩增ATP7B基因N端97-1887cDNA序列；应用TA克隆试剂盒将PCR产物连接到PCR2.1载体上，转化并挑取阳性TA克隆，摇菌并采用质粒抽提纯化试剂盒抽提纯化质粒；SalI和NotI双酶切证实阳性TA克隆并采用引物2R、3F、4R和5F及ABIPRISMR3700 DNA序列分析仪测序鉴定连接在PCR2.1载体上的目的基因片段序列的正确性；应用SalI和NotI双酶切正确的TA克隆，回收目的基因片段并连接到经过SalI和NotI双酶切回收的GST基因融合载体(pGEX4T-1)上并转化；(4)含目的基因片段的GST基因融合载体的表达鉴定挑取1粒转化好的GST基因融合载体克隆，用5ml 2YT培养基摇菌，离心收集细菌并制备小量的GST基因融合蛋白，采用PAGE-SDS胶电泳分离蛋白片段，考马斯兰染色，显示GST基因融合蛋白片段大小；(5)制备并纯化GST基因融合蛋白及收集目的蛋白大量制备GST基因融合蛋白，过柱纯化回收并定量，应用Thrombin 4～15℃酶切过夜，第二天过柱收集ATP7Bn33-629目的蛋白，采用PAGE-SDS胶进一步确认目的蛋白的片段和纯度并检测蛋白浓度；(6)制备并纯化兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗体ATP7Bn33-629目的蛋白与佐剂匀浆后皮下多点注射免疫家兔，1个月后从家兔的耳缘静脉取血1ml，凝固后离心取血清，ELISA方法检测ATP7Bn33-629多克隆抗体的滴度，此时为1∶2000；此后每7～14天加强免疫1次，每次均从耳缘静脉取血1ml，ELISA方法检测抗体滴度；加强免疫3次后，ELISA方法检测抗体的滴度达到了1∶16000；采用免疫印迹方法验证抗体的特异性，结果证实该抗体具有高度特异性，无非特异性条带；从家兔心脏穿刺取血，离心收集抗体血清分装，采用ImmobilizedProteinAColumn(Pierce公司)纯化抗体，检测浓度并分装，保存于-20℃。
4.兔抗人ATP7Bn33-629多克隆抗体的应用，其特征是(1)免疫印迹2.5～10％脱脂奶做为封闭液，室温封闭蛋白电转膜30～60分种；兔抗人ATP7Bn33-629抗体(浓度为5μg/μl)做为一抗，1∶500～1∶1000稀释，室温摇育2～6小时或4～8℃摇育过夜，1XTBST缓冲液摇洗3次，每次5～15分种；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG做为二抗，1∶5000～1∶10000稀释，室温摇育45～90分钟，1XTBST缓冲液摇洗3次，每次5～15分种，辣根过氧化物底物显色，压片并冲片；(2)免疫荧光染色ATP7B表达质粒转染CHO细胞，4～8％多聚甲醛固定细胞，5～10％山羊血清室温封闭细胞30～60分钟；兔抗人ATP7Bn33-629抗体其浓度为5μg/μl，1∶50～1∶150稀释，室温反应1～3小时，1XPBS摇洗3次，每次5～10分种；带红色荧光的羊抗兔IgG作为二抗，1∶100～1∶300稀释，室温反应30～60分钟，1XPBS摇洗3次，每次5～10分钟；封片镜下观察。
全文摘要
本发明公开了一种兔抗人ATP7Bn33－629多克隆抗体的优选与提取法，该发明涉及到利用基因早期诊断疾病的方法。本发明的优选是针对ATP7B蛋白的功能区，选定涵盖N端33至629位氨基酸的蛋白来制备抗体，包括了N端的6个铜结合位点和4个重要跨膜区等重要功能区。本发明在优选的基础上还提出了其制备方法，并根据引物设计原则自行设计引物，构建含ATP7B基因N端33至629位氨基酸目的片段的GST基因融合蛋白来制备抗体。本发明所制备的抗体具有高度特异性和敏感性，有助于进行ATP7B蛋白功能的研究及WD的早期快速基因诊断。
文档编号C07K16/18GK1634992SQ20041009718
公开日2005年7月6日 申请日期2004年12月14日 优先权日2004年12月14日
发明者吴志英, 王柠 申请人:福建医科大学附属第一医院