专利名称：沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域的抗体及其制备方法，具体的说是一种沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法。
背景技术：
沙门氏菌效应蛋白SopB是由沙门氏菌SP1-1 III型分泌系统分泌的一种由561个氨基酸构成的蛋白质分子，是一种肌醇磷脂酶，是目前沙门氏菌分泌的效应蛋白中研究最多，功能最多样化的一个蛋白。沙门氏菌效应蛋白SopB首先作用于质膜，激活SH3-鸟核苷酸交换因子(SGEF)，间接活化交换因子RhoG，从而进一步激活肌动蛋白，诱导细胞骨架重排，促使沙门氏菌侵入宿主细胞。沙门氏菌效应蛋白SopB能够激活原癌基因Akt473的磷酸化，对细菌入侵介导的细胞凋亡具有抑制作用，促进宿主细胞的存活，为沙门氏菌在宿主细胞中的存活提供条件。同时，SopB通过招募RAB5和VPS34到SCV(Salmonella ContainingVacuole, SCV),促进SCV在宿主细胞内的形成和成熟，这对沙门氏菌在宿主细胞内的存活与复制具有重要的意义。此外，SopB能够激活宿主细胞蛋白激酶Erkl/2，p38和JNK的磷酸化激活，调控细胞核内基因的转录和翻译等功能。虽然不同类型的沙门氏菌基因组间存在DNA水平的差异，但通过序列分析发现，在能够引起人类疾病的五大类沙门氏菌(如表I所示)中除了鸭沙门氏菌基因组未测序以夕卜，SopB广泛存在于其他不同类型的沙门氏菌中，而且蛋白序列高度保守，足见其功能的重要性。因此，SopB的功能研究将为揭示沙门氏菌的致病机理，以及寻找沙门氏菌性肠道疾病的治疗靶点具有重要的意义。
表1.沙门氏菌效应蛋白SopB在不同类型沙门氏菌中的分布
权利要求
1.一种沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一，以沙门氏菌效应蛋白SopB全长氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的从N末端第29位至第168位共计140个氨基酸如SEQ ID NO:2所示的蛋白质序列为免疫原，采用常规多克隆抗体的制备方法制备抗血清； 步骤二，纯化抗血清，即得沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤1，克隆编码沙门氏菌效应蛋白SopB N末端第29位至168位共计140个氨基酸的蛋白的如SEQ ID NO:9所示的SopB29-168核酸片段； 步骤2，将步骤I得到的SopB29-168核酸片段和pSUMO表达载体分别酶切后构建第一连接体系，转化大肠杆菌，筛选pSUM0-SopB29-168重组质粒；利用所得的pSUM0-SopB29-168重组质粒转化大肠杆菌，培养，融合蛋白的诱导，裂解，挂镍柱，Ulpl酶切，纯化后，得沙门氏菌效应蛋白SopB29-168蛋白； 步骤3，以步骤2所得沙门氏菌效应蛋白SopB29-168蛋白为免疫原，采用常规多克隆抗体的制备方法制备抗血清，利用HiTrap NHS-activated HP亲和层析柱纯化抗血清，即得沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤I中，所述克隆所用引物对具体为SEQ ID NO: 10所示的上游引物和SEQ ID NOill所示的下游引物。
4.根据权利要求3所述的沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述构建的第一连接体系由I μ I BamHl和XhoI酶切后的pSUMO表达载体、7.5 μ I BamHl和XhoI酶切后的所述SopB29_168核酸片段、I μ IlOX连接酶缓冲液和0.5μ I T4DNA连接酶组成，连接条件是16°C连接过夜；所述筛选pSUM0-SopB29_168重组质粒的过程为:将所述第一连接体系转化至大肠杆菌DH5ci中，使用含有34μ g/ml卡那霉素的LB平板，37°C下培养12-16h，随机挑取4个单克隆接种于5ml含有34 μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C下培养过夜，提取质粒并用BamHl和XhoI双酶切鉴定，选取重组质粒测序，测序正确的即为所需的pSUM0-SopB29-168重组质粒。
5.根据权利要求4所述的沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述培养的过程为:将所述pSUM0-SopB29-168重组质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)后，过夜培养后挑取单克隆至5ml含有34 μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C下培养过夜；将所得过夜培养物接种至IL含有34 μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C培养2.5-3h，至大肠杆菌BL21 (DE3)的OD6tltl值为0.6-0.8之间。
6.根据权利要求5所述的沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述融合蛋白的诱导具体为:在上述OD6c 值为0.6-0.8之间的大肠杆菌BL21 (DE3)培养液中加入诱导剂异丙基-B -D-硫代吡喃半乳糖苷，使诱导剂的终浓度为0.lmmol/L，在22°C下振荡诱导培养12h。
7.根据权利要求6所述的沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述裂解具体为:将上述IL诱导后的大肠杆菌BL21(DE3)培养液离心收集菌体，用50ml第一裂解缓冲液重悬，所述第一裂解缓冲液的组成为50mmol/L Tris-HCl,内含500mmol/L氯化钠、20mmol/L咪唑、lmmol/L苯甲基横酸氟和0.2 μ mol/L细菌蛋白酶抑制剂混合物cocktail3，pH值为8.0;将重悬后的菌液在(TC冰水浴中用功率为400w的超声波进行超声破碎，间歇破碎90次，每超声3秒，间隔7s ;将超声波破碎后的菌液于13200转/分钟的转速下离心30min，收集上清液，所得上清液于0.45 μ m膜过滤后得到破碎的大肠杆菌上清液备用。
8.根据权利要求7所述的沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述挂镍柱的过程为:取2ml专门用于组氨酸标签蛋白纯化的镍柱，轻微离心后，吸去上清液，镍柱用等体积的所述第一裂解缓冲液洗涤两次；将洗涤后的镍柱加入所述用0.45 μ m膜过滤后破碎的大肠杆菌上清液中，于4°C轻微旋转混匀30min ;用5倍体积的所述第一裂解缓冲液润洗三次后，将挂有SUM0-SopB29-168融合蛋白的镍柱保存在I倍体积的50mmol/L Tris-HCl, pH值为8.0的缓冲液中，待用。
9.根据权利要求8所述的沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述Ulp I酶切具体为:将pET28a-Ulpl重组质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，过夜培养后挑取单克隆至5ml含有34 μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C下培养过夜；将所得过夜培养物接种至IL含有34 μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C培养2.5-3h，至大肠杆菌BL21 (DE3)的OD600值为0.6-0.8之间；在OD600值为0.6-0.8的大肠杆菌BL21 (DE3)培养液中加入异丙基-B -D- 硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.lmmol/L,22°C下振荡诱导培养12-16h ;将IL诱导后的大肠杆菌BL21(DE3)培养液离心收集菌体，用50ml第二裂解缓冲液重悬，所述第二裂解缓冲液为pH值为8.0的50mmol/LTriS-HCl，内含500mmol/L氯化钠和20mmol/L咪唑；将重悬后的菌液在0°C冰水浴中用超声波破碎，400W功率间歇破碎100次，每超声3秒，间隔7s ;将超声波破碎后的菌液于13200转/分钟的转速下离心30min，收集上清液，所得上清液用0.45 μ m膜过滤后得到Ulpl表达的破碎的大肠杆菌上清液备用；取2ml镍柱轻微离心后吸去上清液，镍柱用等体积的所述第二裂解缓冲液洗涤两次；将洗涤后的镍柱加入所述用0.45 μ m膜过滤后的Ulpl表达的破碎的大肠杆菌上清液中，于4°C轻微旋转混匀30min ;用5倍体积的所述第二裂解缓冲液润洗三次后，用pH值为8.0、内含200mmol/L咪唑的50mmol/L Tris-HCl作为缓冲液洗脱Ulpl蛋白酶；将所得Ulpl蛋白酶溶液按照体积比1:10的比例加入到所述挂有SUM0-SopB29-168融合蛋白的镍柱溶液中，置于4°C冰箱中酶切过夜；所述纯化过程为:将所得Ulpl蛋白酶酶切后的体系于4°C轻摇30min后于2000转/分离心2min，收集上清液即获得初步纯化的SopB29_168蛋白；对初步纯化的SopB29-168蛋白进行阴离子交换层析,具体步骤为:首先用50mmol/L Tris-HCl、pH值为8.0的溶液平衡HiTrap Q HP阴离子交换柱，然后将上述初步纯化的SopB29-168蛋白进行挂柱，挂柱结束后用5倍体积、pH值为8.0的50mmol/L Tris-HCl缓冲液润洗两次，润洗结束后用PH值为8.0、内含150mmol/L氯化钠的50mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱蛋白，最后将洗脱下来的蛋白进行分子筛层析；所述分子筛层析的过程为:用20mmol/L pH值为7.6的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液平衡Superdex20010/300层析柱，上样后用20mmol/L pH值为7.6的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液进行洗脱，收集蛋白样品；将洗脱下来的蛋白样品采用SDS-PAGE电泳分离后，进行考马斯亮兰染色鉴定，最后得到高纯度的目标蛋白为免疫原。
10.根据权利要求9所述的沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述利用HiTrap NHS-activated HP亲和层析柱纯化抗血清具体为=HiTrap NHS-activated HP亲和层析柱在使用前要进行预处理，即首先用10_15倍体积的预冷的lmmol/L的盐酸溶液冲洗HiTrapNHS-activated HP亲和层析柱,然后在得到的SopB29-168蛋白溶液中按照体积比为10:1的比例加入？!1值为8.3的内含211101/1的碳酸氢钠和5mol/L氯化钠的溶液,从而得到内含终浓度为0.2mol/L的碳酸氢钠和0.5mol/L氯化钠的SopB29-168蛋白溶液；将所得含有碳酸氢钠和氯化钠的SopB29_168蛋白溶液按照体积比0.5:1的比例加入到HiTrap NHS-activated HP亲和层析柱中，于4 偶联过夜后,用两倍体积的PH值为8.3的内含0.5mol/L的乙醇胺和0.5mol/L氯化钠的溶液置换掉pH值为8.3的碳酸氢钠缓冲液；接下来依次用高pH值的溶液和低pH值的溶液轮流润洗5次，所述高PH值的溶液为pH值为8.0的0.lmol/L Tris-HCl溶液，所述低pH值的溶液为pH值为4.0的内含0.lmol/L醋酸钠和0.5mol/L氯化钠的溶液;至此，SopB29_168蛋白与HiTrapNHS-activated HP亲和层析柱的偶联完毕；将获得的抗血清中加入终浓度为10mmol/L、pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液，得到抗血清溶液；用获得的抗血清溶液挂偶联了 SopB29_168免疫原蛋白的HiTrap NHS-activated HP亲和层析柱；并用5倍体积的lOmmol/L、pH值为7.5内含0.5mol/L氯化钠的Tris-HCl溶液润洗，润洗完毕后用pH值为2.5的0.lmol/L甘氨酸盐酸溶液进行洗脱，洗脱下来后迅速按照体积比为10:1的比例往甘氨酸盐酸的洗脱液中加入浓度为500mmol/L的pH值为7.6的Tris-HCl缓冲液，进而获得pH值接近中性的SopB多克隆 抗体溶液。
全文摘要
本发明公开了一种沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，旨在提供一种特异性好、灵敏度高、可与沙门氏菌感染宿主细胞的过程中分泌的内源性沙门氏菌效应蛋白SopB发生特异性结合的兔源多克隆抗体的制备方法。以沙门氏菌效应蛋白SopB全长氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的从N末端第29位至第168位共计139个氨基酸如SEQ ID NO:2所示的蛋白质序列为免疫原，采用常规多克隆抗体的制备方法制备抗血清；纯化抗血清，即得沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体。本发明的方法得到了沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体，有利于对沙门氏菌效应蛋白SopB的免疫印迹分析、免疫荧光染色激光共聚焦显微观察，以及人们对肠道致病菌感染机制的深入研究。
文档编号C12N15/55GK103204936SQ20131002950
公开日2013年7月17日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者阮海华, 张振奇, 陶永清, 赵辉, 张坤生 申请人:天津商业大学