鼠spata16基因多克隆抗体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本申请涉及一种鼠SPATA16基因多克隆抗体及其制备方法。
【背景技术】
[0002] SPATA16基因是一个新基因，研究表明，其在小鼠精子发生过程中具有一定的功能 作用，因此，有必要对其进行更进一步的研究。
【发明内容】
[0003] 本发明提供一种新的鼠SPATA16基因多克隆抗体及其制备方法。
[0004] 本发明提供一种鼠SPATA16基因多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
[0005] a)用PCR方法扩增序列如SEQIDNO: 1所示的SPATA16基因和序列如SEQIDNO: 2 所示的pET32a表达质粒；
[0006] b)将SPATA16基因连接到pET32a表达载体中构建重组质粒；
[0007] c)将所述重组质粒转入BL21感受态细菌，经过培养、诱导、裂解和纯化，得到特异 性目的蛋白；
[0008] d)免疫兔子后，采血，纯化抗体血清，得到多克隆抗体。
[0009] 所述步骤a)中，PCR扩增时，SPATA16基因上游引物如SEQIDNO: 3所示，SPATA16 基因下游引物如SEQIDNO:4所示；pET32a质粒上游引物如SEQIDNO: 5所示，pET32a质粒 下游引物如SEQIDNO:6所示。
[0010] 所述步骤C)中，培养时，将含有所述重组质粒的菌液加入到高压灭菌的无抗生素 LB培养基中，并加入氨苄抗生素。
[0011] 所述步骤c)中，通过IPTG诱导。
[0012] 所述步骤c)中，利用裂解液进行裂解，所述裂解液包括TrisHCl、NaCl和EDTA。
[0013] 所述步骤c)中，所述纯化包括包涵体蛋白处理和梯度透析。
[0014] 一种鼠SPATA16基因多克隆抗体，所述抗体识别的蛋白序列如SEQIDN0:7所示。
[0015] 本发明的有益效果是：通过制备基因SPATA16的多克隆抗体，该抗体能够特异性 识别目的蛋白，从而便于研究目的蛋白的表达和定位等。
【附图说明】
[0016] 图1是SPATA16克隆鉴定图，其中，SPATA16截取片段大小为450bp;片段大小与 spatal6大小一致；
[0017] 图2是NovagenIDA-Ni树脂纯化His-Spatal6_150aa蛋白纯化后的电泳图；
[0018] 图3是SPATA16在不同小鼠辜丸细胞系中的表达特征图，其中，1表TK小鼠辜丸总 蛋白；2表示TM4细胞系（小鼠睾丸支持细胞）；3表示CRL-2053细胞系（小鼠精原细胞）； 4表示CRL-2196细胞系（小鼠精母细胞）；
[0019] 图4是SPATA16在293T的亚细胞定位图；在293T细胞中，SPATA16主要定位在细 胞核中；
[0020] 图5是SPATA16在小鼠睾丸组织中的亚细胞定位分析图；在小鼠组织中，胞核中表 达信号强度远大于胞楽，表明SPATA16定位于小鼠睾丸组织细胞核；
[0021] 图6是SPATA16-150aa抗体检测mSPATA16亚细胞定位图，其中，mSPATA16主要表 达于HEK293细胞的细胞核。
【具体实施方式】
[0022] 下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0023] 在一种实施方式中，鼠SPATA16基因多克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
[0024]a)用PCR方法扩增序列如SEQID NO: 1所示的SPATA16基因和序列如SEQID NO: 2 所示的pET32a表达质粒；其中，SPATA16基因序列是现有序列，其登录信息是：NM_027583， 该基因的蛋白序列如SEQID N0:8所示，其登录号是：NP_081859。
[0025]b)将SPATA16基因连接到pET32a表达载体中构建重组质粒；连接时，可以采用T4 连接酶。
[0026]c)将所述重组质粒转入BL21感受态细菌，经过培养、诱导、裂解和纯化，得到特异 性目的蛋白。
[0027] d)免疫兔子后，采血，纯化抗体血清，得到多克隆抗体。
[0028] 如图1至图6所示，在另一种实施方式中，鼠SPATA16基因多克隆抗体的制备方法 包括如下步骤：
[0029] 1、通过不依赖连接酶的克隆方法（LIC)重组质粒
[0030]a)设计质粒pET32a以及基因SPATA16mRNA的引物，引物如表1所示：
[0031] 表1质粒pET32a和基因SPATA16的合成引物
[0032]
[0033]b)通过PCR的方法扩增目的片段SPATA16和表达质粒pET32a(采用TAKARA公司 的PrimeSTARGXLDNAPolymerase)，GXL高保真PCR反应体系如表2所示：
[0034]表2 :PCR反应体系
[0035]
[0036]PCR反应条件是：1. 98°C5min;2、98°CIOsec;3、6(TC15sec;4、68°C17min;5、2 ~ 4 循环 30 次；6、6(TCIOmin;7、12°C0/N(overnight，过夜）
[0037]PCR反应体系中，dNTPMixture为dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液，每种的浓 度均为2. 5mM
[0038]c)通过胶纯化试剂盒纯化所得SPATA16片段和pET32a表达载体。
[0039]d)T4DNA连接酶（TAKARAT4DNAPolymerase2040A)处理pET32a表达载体和 SPATA16 片段。
[0040] dl)每20ul反应液加入0? 037pmol的pET32a表达载体；
[0041] d2)每20ul反应液加入0. 12-0. 48pmol的胶回收纯化产物；
[0042]d3)用T4连接酶处理pET32a表达载体与SPATA16片段，其反应体系如表3所示；
[0043] 表3T4连接酶处理时的反应体系
[0044]
[0045] d4)在 22°C条件下孵育 30min;
[0046]d5) 75°C孵育20min以灭活T4连接酶。
[0047]e)表达载体与目的片段连接
[0048]el)将样品（表达载体和目的片段的混合液）离心处理；
[0049]e2)根据表达载体与目的片段的所得的浓度将两者以1:1的拷贝数混合于一管；
[0050] e3)22°C孵育 5min;
[0051] e4)加 2. 5EDTA(25mM)并混匀；
[0052]e5)22°C孵育 5min;
[0053]e6)将所构建的重组质粒转入BL21感受态细菌。
[0054] 2、表达融合蛋白pET32a_SPATA16
[0055]a)挑选转化后的单克隆于5MLLB培养基中，37°C，280rpm培养箱摇菌16h。
[0056]b)用500ML锥形瓶装入100mL的无抗生素LB培养基，高压灭菌。
[0057] c)将含有重组质粒的Iml菌液加入到高压灭菌的无抗生素LB培养基中，加入 IOOul浓度lOOug/ml的氨苄抗生素。
[0058]d) 37°C，280rpm摇菌两小时45分钟后，检测其OD595~0? 6。
[0059]e)冰上冷却15分钟。
[0060] f)加入IPTG(原浓度24mg/ml，终浓度1/100)。
[0061]g)37°C，280rpm摇菌三小时。
[0062]h) 12000rpm，4°C，离心 30min。收集沉菌，称净重。
[0063]i)每Ig加入 2 ~5ml buffer W(K)OMm Tris HCl ph8.0,IOOmM NaCl，ImM EDTA)，吹 打混匀，于功率17%~20%超声破碎，至悬液澄清为宜。
[0064] j)12000rpm，4°C，离心lOmin。收集上清液以及沉淀。
[0065] 3、包涵体蛋白处理：
[0066]a)配置8M的尿素（融于1XPBS)冰上预冷。
[0067]b)将超声破碎后的沉菌融于8M尿素中，吹打混匀，4°C垂直旋转8h~0/N。
[0068] c) 4°C，12000rcf离心15min，收集上清，上清即为可溶蛋白。
[0069]d)用两倍体积的8M尿素加IOmM咪唑溶解可溶蛋白，加入预先准备的带特定标签 的beadz〇
[0070] 6)4。0摇晃1~211。
[0071] f) 1000 Orcf离心IOmin。
[0072]g)用预装柱收集beadz。
[0073]h)用8M尿素配制300mM咪唑，将吸附在beadz的目的蛋白洗脱下来。
[0074] 4、梯度透析：
[0075]a)用IXPBS分别配制 7]?、611、511、4]\^1、011尿素，预冷。
[0076]b)组装半透膜透析袋，将目的蛋白密封在透析袋中，分别从高浓度的尿素到底浓 度的尿素进行透析，每一个浓度透析4~6h。
[0077]c)回收蛋白溶液，用超滤管进行超滤浓缩。
[0078]d)最后将浓缩蛋白-80 C保持，以备后续实验使用。
[0079] 上述梯度透析和包涵体蛋白处理都用于纯化蛋白。
[0080] 5、获取特异性目的蛋白，皮下注射入兔子体内。
[0081]a)配制I. 5mmSDS-PAGE蛋白胶若干块。
[0082]b)将蛋白溶液进行SDS-PAGE跑胶分析。
[0083]c)配制2M KC1500ml，冰上孵育。
[0084]d)将蛋白胶完全浸泡入预先准备好的冰镇KCL溶液，摇床摇晃5min后，既能看到 在目的条带大小附近有特异的白色条带出现。确定为目的条带后将其切害IJ，收集于4ml的 离心管中。
[0085]e)用400~500ulIXPBS溶解，搅拌器或匀浆器将切割下来的蛋白胶研磨成浆。
[0086]f)收集浆液。
[0087] g)用三通管注射器将浆液与佐剂以1:1的比例混匀。以见乳白色混匀液为宜。[0088] h)充分混匀后，收集混合液，注射入兔子体内。每次2ml，每周一次，持续1.5个月。 兔子是新西兰大白兔。
[0089] i)两个月后，抽取兔子耳静脉血。室温过夜。提取血清即为该目的蛋白的多克隆 抗体。
[0090] j)用westernblot进行抗体鉴定。
[0091] 以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
【主权项】
1. 一种鼠SPATA16基因多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： a) 用PCR方法扩增序列如SEQ ID NO: 1所示的SPATA16基因和序列如SEQ ID NO: 2所 示的pET32a表达质粒； b) 将SPATA16基因连接到pET32a表达载体中构建重组质粒； c) 将所述重组质粒转化到BL21感受态细菌中，经过培养、诱导、裂解和纯化，得到特异 性目的蛋白； d) 免疫兔子后，采血，纯化抗体血清，得到多克隆抗体。2. 如权利要求1所述的鼠SPATA16基因多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步 骤a)中，PCR扩增时，SPATA16基因上游引物如SEQ ID N0:3所示，SPATA16基因下游引物如 SEQ ID NO:4所示；pET32a质粒上游引物如SEQ ID NO: 5所示，pET32a质粒下游引物如SEQ ID NO:6 所示。3. 如权利要求1所述的鼠SPATA16基因多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步 骤c)中，培养时，将含有所述重组质粒的菌液加入到高压灭菌的无抗生素LB培养基中，并 加入氨苄抗生素。4. 如权利要求1所述的鼠SPATA16基因多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤 c)中，通过IPTG诱导。5. 如权利要求1所述的鼠SPATA16基因多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤 c)中，利用裂解液进行裂解，所述裂解液包括Tris HCl、NaCl和EDTA。6. 如权利要求1所述的鼠SPATA16基因多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤 c)中，所述纯化包括包涵体蛋白处理和梯度透析。7. -种鼠SPATA16基因多克隆抗体，其特征在于，所述抗体识别的蛋白序列如SEQ ID NO:7所示。
【专利摘要】本发明公开了一种鼠SPATA16基因多克隆抗体及其制备方法，包括步骤：a)用PCR方法扩增序列如SEQ？ID？NO:1所示的SPATA16基因和序列如SEQ？ID？NO:2所示的pET32a表达质粒；b)将SPATA16基因连接到pET32a表达载体中构建重组质粒；c)将所述重组质粒转入BL21感受态细菌，经过培养、诱导、裂解和纯化，得到特异性目的蛋白；d)免疫兔子后，采血，纯化抗体血清，得到多克隆抗体。通过制备基因SPATA16的多克隆抗体，该抗体能够特异性识别目的蛋白，从而便于研究目的蛋白的表达和定位等。
【IPC分类】C07K16/18, C07K16/06
【公开号】CN105085675
【申请号】CN201410203598
【发明人】黄卫人, 余州, 吴汉伟, 桂耀庭, 蔡志明
【申请人】深圳市第二人民医院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月14日