eGFP标记GPR120阳性细胞的小鼠模型构建方法
【专利摘要】eGFP标记GPR120阳性细胞的小鼠模型构建方法，设计针对目的位点基因组的guideRNA靶序列，并进行体外转录获得针对该基因的guideRNA；构建donor DNA重组质粒；将guideRNA及donor DNA重组质粒进行受精卵注射获得F0代小鼠，对F0代小鼠的基因型进行鉴定获得正确同源重组的阳性F0代小鼠；将F0代小鼠与野生型小鼠交配获得F1代小鼠，对F1代小鼠的基因型进行鉴定获得正确同源重组的阳性F1代小鼠；F1中阳性转基因小鼠同胞交配产生F2代小鼠，经过筛选鉴定得到纯合子的转基因小鼠。本发明方法使GPR120表达细胞同时表达eGFP，从而在激光激发下辨别出GPR120阳性细胞。
【技术领域】
[00011本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种eGFP标记GPRl 20阳性细胞的小鼠模型 构建方法。 eGFP标记GPR120阳性细胞的小鼠模型构建方法
【背景技术】
[0002] GPR120(G_protein coupled receptor 120;又名free fatty acid receptor 4， FFAR4)是脂肪酸受体家族一员，属于G蛋白偶联受体(GPCR)，可被长链脂肪酸激活，尤以n-3 不饱和脂肪酸激活能力最强。GPR120在脑、垂体、肺、舌、胃肠、脂肪组织等许多组织表达，主 要分布于胃肠多种内分泌细胞、脂肪细胞、巨噬细胞、成骨和破骨细胞以及味蕾细胞。 GPR120激活可刺激61^-1、00(、61?等胃肠激素分泌。美国一研究组于2010年发现6?1?120可 促进巨噬细胞由炎性Ml表型向抗炎M2表型转化，减轻脂肪组织的炎症反应，改善脂肪细胞 胰岛素敏感性，并促进脂肪细胞摄取葡萄糖，从而明确了 GPR120抗炎和增强机体胰岛素敏 感性的作用。另有报道GPR120参与调节胰岛的胰高血糖素以及生长抑素分泌，起到一定的 血糖调控作用。对欧洲人群GPR120基因进行大规模样本分析发现，人GPR120L R270H失功能 性基因突变与肥胖显著正相关，并且与空腹血糖水平升高显著正相关，与胰岛功能降低相 关，这提示GPR120功能异常可影响血糖水平，促进肥胖的发生。GPR120有望成为治疗肥胖和 2型糖尿病的药物开发的有效靶点。
[0003] 目前关于GPR120生理和病理学作用的分子机制研究还十分有限，这主要是由于 GPR120细胞分布较为分散，数量较少，难以获得分离纯化用于体外功能分析。例如胃肠道 GPR120阳性细胞大多单个地夹在上皮细胞之间，所占比例极小，目前无法从中获得纯化的 GPR120细胞。建立良好的GPR120阳性细胞标记模型，易化GPR120的分离纯化，这将极大推进 有关GPR120生理和病理学作用的研究。目前用于活细胞标记和分离的方法有流式抗体标 记、质粒转染标记等，这些方法存在的主要问题是假阳性标记、抗体消耗成本大、组间操作 差异大、标记成功率变化大等。建立一个更为稳定的、简便的GPR120阳性细胞标记的方法十 分必要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种eGFP标记GPR120阳性细胞的小鼠模型构建方法，该方法 可以使GPR120表达细胞同时表达eGFP，从而可以在激光激发下辨别出GPR120阳性细胞。
[0005] 本发明所采用的技术方案是，eGFP标记GPRl 20阳性细胞的小鼠模型构建方法，具 体步骤如下：
[0006] 步骤1，设计针对目的位点基因组的guideRNA靶序列，并根据序列将其进行体外转 录获得针对该基因的guideRNA;
[0007] 步骤2,构建用于目的片段重组的donor DNA重组质粒；
[0008] 步骤3,将体外转录的guideRNA及构建的donor DNA重组质粒进行受精卵注射，获 得FO代小鼠，通过长片段PCR的方式，对FO代小鼠的基因型进行鉴定，PCR结果经测序确认， 获得正确同源重组的阳性Η)代小鼠；
[0009]步骤4,将FO代小鼠与野生型小鼠交配获得Fl代小鼠，通过长片段PCR的方式，对Fl 代小鼠的基因型进行鉴定，PCR结果经测序确认，获得正确同源重组的阳性Fl代小鼠；
[0010] 步骤5，F1中阳性转基因小鼠同胞交配产生F2代小鼠，经过筛选鉴定之后，得到纯 合子的转基因小鼠，并用纯合子来保存育种。
[0011]本发明的特点还在于，
[0012]步骤 1 中guideRNA序列如SEQ ID No. 1 所示。
[0013] 步骤2中donor DNA重组质粒的序列如SEQ ID Νο·2所示。
[0014] 步骤2中donor DNA重组质粒的构建方法如下：
[0015]首先，PCR扩增克隆四个片段:5'同源臂片段、IRES-gfp-ployA片段、
[0016] 3'同源臂片段、载体片段；
[0017] 5'同源臂端所用引物是：
[0018] 上游引物:5'-GGG GAG AGA CGC GGC GGT GGG TCA CAG TCA AGC AAG-3' ；
[0019] 下游引物：5'-GGG AGG GAG AGG GGC TTA GCT GGA AAT AAC AGA CAA GTC ATT-3，；
[0020] IRES-gfp-ployA片段扩增用引物是：
[0021] 上游引物：5'-GCC CCT CTC CCT CCC CCC-3'；
[0022] 下游引物：5'-AAA GCA CTG AAC TAA CGA TAA GAT ACA TTG ATG AGT TTG GAC AAA C-3,；
[0023] 3'同源臂端所用引物是：
[0024] 上游引物：5'-TTA GTT CAG TGC TTT CGT AGA TTc tag cct ctg gtg Tea ggt gaa cc-3'；
[0025] 下游引物：5'-Aga atg aga cgc ggc TGG GGA AGT TTA GGG ATG GG -3'；
[0026] 载体扩增引物是：
[0027] 上游引物：5'-gcc gcg tct cat tcC TAC TGG GCG GTT TTA TGG AC-3'；
[0028] 下游引物：5'-gcc gcg tct etc ccC GTA TAT CTG GCC CGT ACA TCG -3'；
[0029] 四个片段扩增的PCR反应体系和反应条件如下：
[0030] PCR反应体系包括：去离子水11.7微升、5倍PCR Buffer 4微升、2.5mM dNTP 2微 升、上游引物（IOpm0IAU)0.5微升、下游引物（IOpm0IAU)0.5微升、DNA聚合酶0.8微升、小 鼠尾组织DNA模板0.5微升，合计20微升；
[0031] 反应条件是:第一步是95°C、2min，第二步是98°C、10sec，第三步是60°C、15sec，第 四步是68°C、4min，第二步到第四步重复进行40次循环，随后一步是68°C、5min;
[0032] 反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后对PCR产物回收纯化，测定浓度，取四种 PCR胶回产物各80ng，加入in-fusion 2ul，补水至IOul，置于50度15min，进行片段的连接； 随后转化DH5a感受态进行克隆，挑取克隆，抽取DNA，酶切鉴定正确测序，收取正确质粒，用 于后续受精卵注射。
[0033] 步骤3中FO代小鼠和步骤4中Fl代小鼠5'同源臂和3'同源臂PCR鉴定用引物、反应 体系和反应条件相同；
[0034] 5'同源臂PCR鉴定用引物序列如下：
[0035] 上游引物：5'-GCC ATA ATG CCG ATG AAC CC-3'；
[0036] 下游引物：5'-AAT CTA CGA AAG CAC TGA ACT AAC GA-3'；
[0037] PCR反应体系包括：去离子水11.7微升、5倍PCR Buffer 4微升、2.5mM dNTP 2微 升、上游引物（IOpm0IAU)0.5微升、下游引物（IOpm0IAU)0.5微升、DNA聚合酶0.8微升、小 鼠尾组织DNA模板0.5微升，合计20微升；
[0038] 反应条件是:第一步是95°C、2min，第二步是98°C、10sec，第三步是60°C、15sec，第 四步是68°C、4min，第二步到第四步重复进行40次循环，随后一步是68°C、5min;
[0039] 反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA扩增片段;5'臂同源重组阳性基因组 应扩增出5.3kb片段，杂合子同时有6.7k产物，野生型基因组6.7k产物；
[0040] 3'同源臂PCR鉴定用引物序列如下：
[0041] 上游引物：5'-CTA CCT GAG CAC CCA GTC CG-3'；
[0042] 下游引物：5'-CCC CAC CTC CCC TAC CTT C-3'；
[0043] 反应条件是:第一步是95°C、2min，第二步是98°C、10sec，第三步是65°C、15sec，第 四步是68°C、2min，第二步到第四步重复进行40次循环，随后一步是68°C、5min;
[0044] 反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA扩增片段;3'臂同源重组阳性基因组 应扩增出3.2kb片段，野生型基因组无特异性PCR产物。
[0045] 步骤5中F2代小鼠中转基因成功小鼠的鉴定用引物包括引物1、引物2和引物3;
[0046] 引物1 的序列：5'-GCA CGC TCT TCC TGC TCA T-3'；
[0047] 引物2的序列：5'-GTG GGG ACT CAG GGT GGC-3'；
[0048] 引物3的序列：5'-TCA CTG CAT TCT AGT TGT GGT TTG-3'；
[0049] 反应体系是：去离子水14.9微升、10倍PCR Buffer 2微升、2.5mM dNTP 1微升、弓丨 物1 (lOpmol/μΙ )0 · 5 微升、引物2( lOpmol/μΙ )0 · 5微升、引物3(10ρπιο1/μ1 )0 · 5 微升、DNA 聚合 酶0.1微升、小鼠尾组织DNA模板1微升，合计20微升；
[0050] 反应条件是:第一步是94°C、5min，第二步是94°C、30sec，第三步是56°C、30sec，第 四步是72°C、Imin，第二步到第四步重复进行32次循环，随后一步是72°C、5min;
[0051] 反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA扩增片段，只有651bp扩增片段的是 野生型小鼠，同时有651bp和428bp扩增片段的是杂合型小鼠，只有428bp扩增片段的是纯合 型转基因小鼠。
[0052]本发明的有益效果是，本发明构建方法可以使GPR120表达细胞同时表达eGFP，从 而可以在激光激发下辨别出GPRl 20阳性细胞。此构建方法中eGFP和GPRl 20在mRNA水平即相 互分离，互不干扰蛋白的合成，从而保证了GPR120蛋白的功能和代谢过程不受影响。
【附图说明】
[0053] 图1是donor DNA同源重组载体质粒构建图；
[0054]图2是donor DNA同源重组载体酶切鉴定及线性化电泳图；在不同条件下酶切，获 得大小片段与重组质粒的设计完全一致；
[0055]图3A是同源重组阳性FO代小鼠5'同源臂PCR鉴定电泳图；
[0056]图3B是同源重组阳性FO代小鼠5'同源臂PCR鉴定电泳图；
[0057]图4是Fl代小鼠5'同源臂和3'同源臂PCR鉴定电泳图；
[0058] 图5是F2代小鼠基因型PCR鉴定电泳图；
[0059] 图6是eGFP在转基因纯合子小鼠不同组织内6?1?120和66??的1111?财表达检测电泳 图；
[0060] 图7是转基因纯合子小鼠体内eGFP阳性细胞表达GPR120的染色图，其中图A是细胞 的eGFP荧光图，图B是细胞的GPR120红色荧光标记图，图C是细胞的光镜图；
[0061 ]图8是转基因纯合子小鼠的垂体内eGFP特异性标记的GPR120阳性细胞的荧光观察 图；其中图A是转基因纯合子小鼠垂体的eGFP荧光图，图B是转基因纯合子小鼠垂体的光镜 图，图C是野生型小鼠垂体的eGFP荧光图，图D是野生型小鼠垂体的光镜图；
[0062]图9是转基因纯合子小鼠的脂肪组织内eGFP特异性标记的GPRl 20阳性细胞的荧光 观察图；其中图A是转基因纯合子小鼠脂肪组织的eGFP荧光图，图B是转基因纯合子小鼠脂 肪组织的光镜图，图C是野生型小鼠脂肪组织的eGFP荧光图，图D是野生型小鼠脂肪组织的 光镜图；
[0063]图10是转基因纯合子小鼠的结肠内eGFP特异性标记的GPR120阳性细胞的荧光观 察图；其中图A是转基因纯合子小鼠结肠的eGFP荧光图，图B是转基因纯合子小鼠结肠的光 镜图，图C是野生型小鼠结肠的eGFP荧光图，图D是野生型小鼠结肠的光镜图；
[0064]图11是转基因纯合子小鼠的腹腔分离培养细胞中eGFP特异性标记细胞的荧光观 察图，其中图A是eGFP荧光图，图B是光镜图。
【具体实施方式】
[0065]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0066] 本发明eGFP标记GPRl 20阳性细胞的小鼠模型构建方法，利用CRISPR技术，将IRES-EGFP-pA表达单元定点插入至GPR120基因编码框的终止密码子处。针对目的基因终止密码 子的附近寻找祀序列，设计针对该位点的guide-RNA，将具有活性的guide-RNA体外转录成 mRNA，通过显微注射将guide-RNA的mRNA以及含有IRES-EGFP-pA单元的donor DNA片段注射 到受精卵中，从后代中筛选获得成功定点插入的阳性小鼠。该方法可使eGFP特异性表达于 阳性小鼠的GPRl 20阳性细胞。
[0067] 基因敲入位点上下游序列信息如下：
[0068] cttttcttctgggtggtggccttcacgtttgccaactctgccctaaaccccatactgtacaacatgtcgctgttcag gaacgaatggaggaagattttttgctgcttcttttttccagagaagggagccatttttacagatacgtctgtcaggc gaaatgacttgtctgttatttccagcTAActagcctctggtgccaggtgaaccacggtgtgcatgtaaagggagtta acttcaaggaaagcccaccagtgcgccctgctttaaaaatacccgacttccaacagcaggcatctacggagccagca aattaaggaatgatcgctcagtataaaaatatttttccttaaaagaactttctatgggttccttttgtgaacttttt ttagtgtgtttgtaatatgatctagttaataaatttttatttataactgttcctaca〇
[0069] 在TAA位点后定点敲入IRES-EGFP表达框。
[0070]具体包括以下步骤：
[0071 ]步骤1，设计针对目的位点基因组的guideRNA靶序列，并根据序列将其进行体外转 录获得针对该基因的guideRNA，guideRNA序列如SEQ ID No.l所示；
[0072]步骤2,构建用于目的片段重组的donor DNA重组质粒
[0073]首先，PCR扩增克隆四个片段:5'同源臂片段、IRES-gfp-ployA片段、
[0074] 3 '同源臂片段、载体片段；
[0075] 5'同源臂端所用引物是：
[0076] 上游引物：5'-GGG GAG AGA CGC GGC GGT GGG TCA CAG TCA AGC AAG-3' ；
[0077] 下游引物：5'-GGG AGG GAG AGG GGC TTA GCT GGA AAT AAC AGA CAA GTC ATT-3，；
[0078] IRES-gfp-ployA片段扩增用引物是：
[0079] 上游引物：5'-GCC CCT CTC CCT CCC CCC-3'；
[0080] 下游引物：5'-AAA GCA CTG AAC TAA CGA TAA GAT ACA TTG ATG AGT TTG GAC AAA C-3,；
[0081] 3'同源臂端所用引物是：
[0082] 上游引物：5'-TTA GTT CAG TGC TTT CGT AGA TTc tag cct ctg gtg Tea ggt gaa cc-3'；
[0083] 下游引物：5'-Aga atg aga cgc ggc TGG GGA AGT TTA GGG ATG GG -3'；
[0084]载体扩增引物是：
[0085] 上游引物：5'-gcc gcg tct cat tcC TAC TGG GCG GTT TTA TGG AC-3'；
[0086] 下游引物：5'-gcc gcg tct etc ccC GTA TAT CTG GCC CGT ACA TCG -3'；
[0087] 四个片段扩增的PCR反应体系和反应条件如下：
[0088] PCR反应体系包括：去离子水11.7微升、5倍PCR Buffer 4微升、2.5mM dNTP 2微 升、上游引物（IOpm0IAU)0.5微升、下游引物（IOpm0IAU)0.5微升、DNA聚合酶0.8微升、小 鼠尾组织DNA模板0.5微升，合计20微升；
[0089] 反应条件是:第一步是95°C、2min，第二步是98°C、10sec，第三步是60°C、15sec，第 四步是68°C、4min，第二步到第四步重复进行40次循环，随后一步是68°C、5min;
[0090] 反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后对PCR产物回收纯化，测定浓度，取四种 PCR胶回产物各80ng，加入in-fusion 2ul，补水至IOul，置于50度15min，进行片段的连接。 随后转化DH5a感受态进行克隆，挑取克隆，抽取DNA，酶切鉴定正确测序，收取正确质粒，用 于后续受精卵注射。
[0091] 用于目的片段重组的donor DNA重组质粒序列如SEQ ID No.2所示，构建的donor DNA重组质粒的图谱如图1所示，包括载体片段中的卡纳抗性筛选基因（kana)元件、5'同源 臂（5'31'111)元件、1(11〇〇1^11(11^3-66??)元件、3￥40?〇15^多聚腺苷酸加尾信号（3￥40)元件、 3'同源臂（3'arm)元件，总长度为7977bp。应用EcoRl+kpnl酶切获得条带大小为2k和6k;应 用pstl+notl酶切获得条带大小为1.7k和6.31^ ;应用把11(13酶切获得条带大小为7977&?;重 组质粒的酶切结果如图2所示，EcoRl+kpnl酶切鉴定结果的条带大小为2k和6k;pstl+notl 酶切鉴定的条带大小为1.7k和6.3k;Hind3酶切鉴定的条带大小为7977bp，其中M指代Ikb DNA ladder。酶切片段大小完全符合设计，说明质粒构建成功。
[0092]步骤3,将体外转录的guideRNA及构建的donor DNA重组质粒进行受精卵注射，获 得FO代小鼠，通过长片段PCR的方式，对FO代小鼠的基因型进行鉴定，PCR结果经测序确认， 获得正确同源重组的阳性代小鼠。
[0093] 5'同源臂重组阳性FO代小鼠 PCR鉴定用引物序列如下：
[0094] 上游引物：5'-GCC ATA ATG CCG ATG AAC CC-3'；
[0095] 下游引物：5'-AAT CTA CGA AAG CAC TGA ACT AAC GA-3'；
[0096] PCR反应体系包括：去离子水11.7微升、5倍PCR Buffer 4微升、2.5mM dNTP 2微 升、上游引物（IOpm0IAU)0.5微升、下游引物（IOpm0IAU)0.5微升、DNA聚合酶0.8微升、小 鼠尾组织DNA模板0.5微升，合计20微升。
[0097] 反应条件是:第一步是95°C、2min，第二步是98°C、10sec，第三步是60°C、15sec，第 四步是68°C、4min，第二步到第四步重复进行40次循环，随后一步是68°C、5min。
[0098]反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA扩增片段。5'臂同源重组阳性基因组 应扩增出5.3kb片段(杂合子有可能同时有6.7k产物），野生型基因组6.7k产物。同源重组阳 性代小鼠5'同源臂PCR鉴定电泳结果如图3A所示，其中8、12、14、17、18、20、21号为阳性FO 小鼠。
[0099] 3'同源臂重组阳性FO代小鼠 PCR鉴定用引物序列如下：
[0100] 上游引物：5'-CTA CCT GAG CAC CCA GTC CG-3'；
[0101] 下游引物：5'-CCC CAC CTC CCC TAC CTT C-3'；
[0102] 反应条件是:第一步是95°C、2min，第二步是98°C、10sec，第三步是65°C、15sec，第 四步是68°C、2min，第二步到第四步重复进行40次循环，随后一步是68°C、5min。
[0103]反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA扩增片段。3'臂同源重组阳性基因组 应扩增出3.2kb片段，野生型基因组无特异性PCR产物。同源重组阳性FO代小鼠3'同源臂PCR 鉴定电泳结果如图3B所示，其中8、12、14、17、18、20、21号为阳性!^0小鼠。
[0104]步骤4，将FO代小鼠与野生型小鼠交配获得Fl代小鼠
[0105] Fl代小鼠5'和3'同源臂PCR鉴定用引物、反应体系和反应条件与上述FO代小鼠鉴 定所用完全相同。Fl代小鼠5'和3'同源臂PCR鉴定结果见图4,其中数字代表F130.com代小 鼠编号，M代表DNA ladder，其中片段大小如图最右侧所示。凝胶电泳图中，DNA ladder左侧 为5'同源臂PCR鉴定结果，右侧是3'同源臂PCR鉴定结果。Fl代阳性小鼠为1、3、5、7、8、9号。
[0106] 步骤5，F1中阳性转基因小鼠同胞交配产生F2代小鼠，经过筛选鉴定之后，得到纯 合子的转基因小鼠，并用纯合子来保存育种。
[0107] F2代小鼠中转基因成功小鼠的鉴定用引物包括引物1、引物2和引物3。
[0108] 引物1 的序列：5'-GCA CGC TCT TCC TGC TCA T-3'；
[0109] 引物2的序列：5'-GTG GGG ACT CAG GGT GGC-3'；
[0110] 引物3的序列：5'-TCA CTG CAT TCT AGT TGT GGT TTG-3'；
[0111] 反应体系是：去离子水14.9微升、10倍PCR Buffer 2微升、2.5mM dNTP 1微升、引 物1 (lOpmol/μΙ )0 · 5 微升、引物2( lOpmol/μΙ )0 · 5微升、引物3(10ρπιο1/μ1 )0 · 5 微升、DNA 聚合 酶0.1微升、小鼠尾组织DNA模板1微升，合计20微升。
[0112] 反应条件是:第一步是94°C、5min，第二步是94°C、30sec，第三步是56°C、30sec，第 四步是72°C、lmin，第二步到第四步重复进行32次循环，随后一步是72°C、5min。
[0113] 反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA扩增片段。只有651bp扩增片段的是 野生型小鼠，同时有651bp和428bp扩增片段的是杂合型小鼠，只有428bp扩增片段的是纯合 型转基因小鼠。F2代小鼠基因型的PCR鉴定结果见图5，其中3号、7号、8号小鼠的DNA扩增只 有428bp片段，为纯合子转基因小鼠；2号、4号、6号小鼠的DNA扩增有651bp和428bp片段，为 杂合子转基因小鼠；1号和5号小鼠的DNA扩增只有651bp片段，为野生型小鼠。
[0114] 本发明构建的小鼠模型具有eGFP表达，结果如图6所示。F2代之后纯合子转基因小 鼠经麻醉处死后，取小鼠的垂体、心脏、结肠、脂肪，运用RNA提取试剂盒提取RNA，进行反转 录之后观察GPR120的基因表达和eGFP基因的表达。
[0115] GPR120的上游引物：5'-GTG CCG GGA CTG GTC ATT GTG-3'；
[0116] GPRl20的下游引物：5'-TTG TTG GGA CAC TCG GAT CTG G-3'。
[0117]扩增片段为123bp。
[0118] eGFP的上游引物是：5'-TCT TCT TCA AGG ACG ACG GCA ACT-3'；
[0119] 下游引物是5'-CCT TGA TGC CGT TCT TCT GCT TGT-3'，
[0120]扩增片段是195bp。
[0121] PCR反应体系包括：去离子水11.7微升、5倍PCR Buffer 4微升、2.5mM dNTP 2微 升、上游引物（IOpm0IAU)0.5微升、下游引物（IOpm0IAU)0.5微升、DNA聚合酶0.8微升、小 鼠尾组织DNA模板0.5微升，合计20微升。
[0122] 反应条件是:第一步是94°C、5min，第二步是94°C、IOsec，第三步是60°C、15sec，第 四步是72°C、15sec，第二步到第四步重复进行32次循环，随后一步是72°C、5min。
[0123] 图6中泳道1是DNA marker，2-5分别是垂体、心脏、结肠、脂肪的GPR120表达，6-9分 别是垂体、心脏、结肠、脂肪的eGFP表达。可见，表达GPR120的组织中具有eGFP表达，这说明 转基因小鼠的中eGFP和GPRl 20表达存在组织的一致性。
[0124] F2代之后纯合子转基因小鼠经麻醉处死后，取组织经消化成单细胞进行切片，应 用GPR120的抗体进行免疫染色，结果如图7所示，eGFP标记细胞与GPR120阳性细胞重合率达 到100%，这说明eGFP标记的细胞均为GPRl20阳性细胞。应用激光激发筛选出的eGFP阳性细 胞即是GPR120阳性细胞。
[0125] F2代之后纯合子转基因小鼠经麻醉处死后，取不同组织切片，在荧光显微镜下蓝 色激光激发下观察，本方法构建的纯合子转基因小鼠的垂体中可见绿色荧光蛋白标记细胞 散在分布，而野生型小鼠的垂体内未见eGFP表达，结果如图8所示。本方法构建的纯合子转 基因小鼠的脂肪中可见绿色荧光蛋白标记细胞分布，而野生型小鼠的脂肪内未见eGFP表 达，结果如图9所示。本方法构建的纯合子转基因小鼠的结肠中可见绿色荧光蛋白标记细 胞，而野生型小鼠的结肠内未见eGFP表达，结果如图10所示。这说明本发明构建的纯合子转 基因小鼠可用于在组织中辨认出GPRl 20阳性细胞。
[0126] 取F2代之后纯合子转基因小鼠的腹腔细胞，体外无菌培养1天后，在激光激发下可 见其中eGFP阳性细胞，结果如图11所示，其中图A是eGFP荧光照片，图B是光镜照片。箭头所 示为eGFP阳性细胞，说明应用此方法建立的转基因小鼠可通过荧光识别体外培养的eGFP阳 性细胞。说明本发明构建的转基因小鼠可用于离体培养条件下辨认GPR120阳性细胞。
【主权项】
1. eGFP标记GPR120阳性细胞的小鼠模型构建方法，其特征在于，具体步骤如下： 步骤1，设计针对目的位点基因组的guideRNA靶序列，并根据序列将其进行体外转录获 得针对该基因的guideRNA; 步骤2,构建用于目的片段重组的donor DNA重组质粒； 步骤3,将体外转录的guideRNA及构建的donor DNA重组质粒进行受精卵注射，获得F0 代小鼠，通过长片段PCR的方式，对F0代小鼠的基因型进行鉴定，PCR结果经测序确认，获得 正确同源重组的阳性F0代小鼠； 步骤4,将F0代小鼠与野生型小鼠交配获得F1代小鼠，通过长片段PCR的方式，对F1代小 鼠的基因型进行鉴定，PCR结果经测序确认，获得正确同源重组的阳性F1代小鼠； 步骤5，F1中阳性转基因小鼠同胞交配产生F2代小鼠，经过筛选鉴定之后，得到纯合子 的转基因小鼠，并用纯合子来保存育种。2. 根据权利要求1所述的eGFP标记GPR120阳性细胞的小鼠模型构建方法，其特征在于， 步骤1中guideRNA序列如SEQ ID No. 1所示。3. 根据权利要求1所述的eGFP标记GPR120阳性细胞的小鼠模型构建方法，其特征在于， 步骤2中donor DNA重组质粒的序列如SEQ ID No.2所示。4. 根据权利要求1或3所述的eGFP标记GPR120阳性细胞的小鼠模型构建方法，其特征在 于，步骤2中donor DNA重组质粒的构建方法如下： 首先，PCR扩增克隆四个片段:5'同源臂片段、IRES-gfp-ployA片段、3'同源臂片段、载 体片段； 5'同源臂端所用引物是： 上游引物:5'-GGG GAG AGA CGC GGC GGT GGG TCA CAG TCA AGC AAG-3'； 下游引物：5'-GGG AGG GAG AGG GGC TTA GCT GGA AAT AAC AGA CAA GTC ATT-3'； IRES-gfp-ployA片段扩增用引物是： 上游引物:5'-GCC CCT CTC CCT CCC CCC-3'； 下游引物：5'-AAA GCA CTG AAC TAA CGA TAA GAT ACA TTG ATG AGT TTG GAC AAA C-3,； 3'同源臂端所用引物是： 上游引物：5'-TTA GTT CAG TGC TTT CGT AGA TTc tag cct ctg gtg Tea ggt gaa cc_3'； 下游引物：5'-Aga atg aga ege ggc TGG GGA AGT TTA GGG ATG GG-3'； 载体扩增引物是： 上游引物：5'-gcc geg tet cat tcC TAC TGG GCG GTT TTA TGG AC-3'； 四个片段扩增的PCR反应体系和反应条件如下： PCR反应体系包括:去离子水11.7微升、5倍PCRBuffer4微升、2.5mMdNTP2微升、上 游引物（1 Opmo l/μL) 0 · 5微升、下游引物（lOpmo l/μL) 0 · 5微升、DNA聚合酶0 · 8微升、小鼠尾组 织DNA模板0.5微升，合计20微升； 反应条件是:第一步是95°C、2min，第二步是98°C、10sec，第三步是60°C、15sec，第四步 是68°C、4min，第二步到第四步重复进行40次循环，随后一步是68°C、5min; 反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后对PCR产物回收纯化，测定浓度，取四种PCR胶 回产物各80ng，加入in-fusion 2ul，补水至10ul，置于50度15min，进行片段的连接;随后转 化DH5a感受态进行克隆，挑取克隆，抽取DNA，酶切鉴定正确测序，收取正确质粒，用于后续 受精卵注射。5. 根据权利要求1所述的eGFP标记GPR120阳性细胞的小鼠模型构建方法，其特征在于， 步骤3中F0代小鼠和步骤4中F1代小鼠5'同源臂和3'同源臂PCR鉴定用引物、反应体系和反 应条件相同； 5 '同源臂PCR鉴定用引物序列如下： 上游引物：5'-GCC ATA ATG CCG ATG AAC CC-3'； 下游引物:5'-AAT CTA CGA AAG CAC TGA ACT AAC GA-3'； PCR反应体系包括:去离子水11.7微升、5倍PCR Buffer 4微升、2.5mM dNTP 2微升、上 游引物（1 〇pmo l/μL) 0 · 5微升、下游引物（lOpmo l/μL) 0 · 5微升、DNA聚合酶0 · 8微升、小鼠尾组 织DNA模板0.5微升，合计20微升； 反应条件是:第一步是95°C、2min，第二步是98°C、10sec，第三步是60°C、15sec，第四步 是68°C、4min，第二步到第四步重复进行40次循环，随后一步是68°C、5min; 反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA扩增片段;5'臂同源重组阳性基因组应扩 增出5.3kb片段，杂合子同时有6.7k产物，野生型基因组6.7k产物； 3 '同源臂PCR鉴定用引物序列如下： 上游引物：5'-CTA CCT GAG CAC CCA GTC CG-3'； 下游引物：5'-CCC CAC CTC CCC TAC CTT C-3'； 反应条件是:第一步是95°C、2min，第二步是98°C、10sec，第三步是65°C、15sec，第四步 是68°C、2min，第二步到第四步重复进行40次循环，随后一步是68°C、5min; 反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA扩增片段;3'臂同源重组阳性基因组应扩 增出3.2kb片段，野生型基因组无特异性PCR产物。6. 根据权利要求1所述的eGFP标记GPR120阳性细胞的小鼠模型构建方法，其特征在于， 步骤5中F2代小鼠中转基因成功小鼠的鉴定用引物包括引物1、引物2和引物3; 引物1 的序列:5'-GCA CGC TCT TCC TGC TCA T-3'； 引物2的序列：5'-GTG GGG ACT CAG GGT GGC-3'； 引物3的序列:5'-TCA CTG CAT TCT AGT TGT GGT TTG-3'； 反应体系是：去离子水14.9微升、10倍PCR Buffer 2微升、2.5mM dNTPl微升、引物1 (10?111〇1/^1)0.5微升、引物2(10?111〇1/^1)0.5微升、引物3(10?111〇1/^1)0.5微升、0嫩聚合酶 0.1微升、小鼠尾组织DNA模板1微升，合计20微升； 反应条件是:第一步是94°C、5min，第二步是94°C、30sec，第三步是56°C、30sec，第四步 是72°C、lmin，第二步到第四步重复进行32次循环，随后一步是72°C、5min; 反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA扩增片段，只有651bp扩增片段的是野生 型小鼠，同时有651bp和428bp扩增片段的是杂合型小鼠，只有428bp扩增片段的是纯合型转 基因小鼠。
【文档编号】A01K67/027GK106086072SQ201610424507
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月14日 公开号201610424507.9, CN 106086072 A, CN 106086072A, CN 201610424507, CN-A-106086072, CN106086072 A, CN106086072A, CN201610424507, CN201610424507.9
【发明人】赵玉峰, 苏兴利, 徐曦, 闫爱丽, 王莉, 陈镝, 谢荣, 刘英光
【申请人】西安医学院