白多克隆抗体为检测抗体建立的竞争性酶联免疫吸附测定方法检测 乳铁蛋白，竞争性ELISA的IC50值为24. 5yg/mL，检测限为11. 2yg/mL，检测线性范围为 8-40yg/mL。本发明的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体可以用于鉴定乳制品中的乳铁蛋白，为 进一步研究奶牛乳腺合成的乳铁蛋白以及定量检测乳制品中的乳铁蛋白提供了有效科研 材料。
[0036] 本发明提供的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体具有纯度高、抗体效价高、特异性强、成 本低廉、检测范围广、操作简便、结果迅速可靠等优点，含有此抗体的ELISA检测试剂盒可 广泛应用于奶牛乳腺、乳及乳制品中乳铁蛋白的定性或定量检测。
【附图说明】
[0037] 图1纯化后抗体电泳图；1为蛋白质Marker，2为纯化后多克隆抗体。
[0038] 图2兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体效价曲线。
[0039]图3本发明制备的多克隆抗体与乳铁蛋白的竞争性ELISA工作曲线；蛋白浓度 为 0 (阴性对照）、8yg/mL、12yg/mL、16yg/mL、20yg/mL、24yg/mL、28yg/mL、32yg/mL、 36yg/mL和 40yg/mL的乳铁蛋白对应的OD值分别为：2. 300, 2. 120,1. 825,1. 537,1. 322， L166,L045,0? 916,0? 830 和 0? 714,抑制率分别为 100 %，92. 19 %，79. 37 %，66. 84 %， 57. 48%，50. 71%，45. 46%，39. 83%，36. 11 %和 31. 05%。
[0040] 图4Western-blot法鉴定乳铁蛋白抗体特异性(M:蛋白质分子量标准；1-2:乳铁 蛋白）。
[0041] 图5Western-blot法鉴定本发明制备的抗体与奶牛乳腺组织及奶制品中提取的 乳铁蛋白的反应性;M:蛋白质分子量标准；1-2 :乳腺组织样品；3 :奶粉样品。
[0042] 图6Sigma抗体与乳铁蛋白的竞争性ELISA工作曲线。
【具体实施方式】
[0043] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0044]实施例1兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体的制备及鉴定
[0045] 1材料与试验方法
[0046] I. 1试验材料
[0047] 试验材料包括乳铁蛋白标准品（美国Sigma公司，纯度彡85 %)、Al(OH) 3佐剂 (美国InvivoGen公司）、CpGODN佐剂（生工生物工程（上海）股份有限公司合成）、 蛋白A-琼脂糖 _4B(ProteinA-Sepharose4B，美国Sigma公司）、磁珠（Dynabeads? M_280SheepAnti-RabbitIgG，美国Dynal公司），羊抗兔辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋 白G(IgG-HRP，武汉博士德公司）、放射免疫沉淀测定（RIPA)裂解液（上海碧云天公司）、 BCA蛋白质定量试剂盒（北京康润诚业生物科技有限公司）、DAB辣根过氧化物酶显色试剂 盒（北京康润诚业生物科技有限公司）。
[0048] 1. 2试验动物及饲养管理
[0049] 试验选取4只健康纯种新西兰大白兔，单笼饲养，每日饲喂颗粒饲料，自由采食和 饮水。饲养前对对兔舍进行彻底清扫和消毒，待兔适应饲养环境1周后，耳缘静脉采血，测 定其血清与乳铁蛋白无反应，因此按免疫程序进行免疫。
[0050] 1. 3免疫程序及抗血清的制备
[0051 ] 试验开始第1周，将0? 5mg乳铁蛋白与50ygCpG佐剂溶于ImLPBS中，与A1(0H)3(1:5,v/v)混合后，采用皮下多点注射法，每只兔注射ImL含有复合佐剂的蛋白溶 液（含500yg乳铁蛋白），4周后，同样方法背部皮下多点注射含有该复合佐剂的乳铁蛋白 (含250yg乳铁蛋白），以后每2周重复1次，每次免疫后的第7天耳缘静脉采血，ELISA 方法检测抗血清效价。第4次免疫后的第7天进行心脏采血。待血液凝结后，于3000Xg/ min离心20min，取上清分装后置-80°C保存备用。
[0052] 1. 4免疫磁珠法纯化抗血清
[0053] 取100yL磁珠加入2mL离心管中，在磁力分离器上放置3min后吸去上清液，加入 300yL稀释抗血清（I: 100)，4°C条件下保持倾斜缓慢旋转lOmin，而后静置3min后吸去上 清液，用PBS(pH= 7. 4)重悬磁珠，重复清洗3遍后，离心管再次在磁力分离器上放置3min 吸去上清液，加入0.lmol/L枸橼酸钠缓冲液（pH= 3. 0)，涡旋震荡3min，然后再在磁力分 离器上放置2min后吸取上清液，重复清洗3遍，将所得上清液混合，得到纯化后抗体。
[0054] 1. 5蛋白A亲和层析法进一步纯化抗体
[0055]结合/洗涤缓冲液为含有IMNaCl的0?lmol/LTris-HCl缓冲液（pH= 8. 6)，上 样前首先用结合/洗涤缓冲液平衡蛋白A-琼脂糖-4B并装柱，以lmL/min流速洗去所含蛋 白质和防腐剂等杂质，待流出洗脱液0D2fffl〈0. 02时可上样。将结合/洗涤缓冲液稀释后的 血清样本（1:4,v/v)加入柱中，待全部血清样品进入柱床后，用结合/洗涤缓冲液冲洗柱子 并使缓冲液流出速度约1111171^11，待洗脱液00 28。〈0.02时改变洗脱条件，用3.5%冰乙酸（?11 =2. 8)洗脱，将含有抗体的洗脱液收集到含平衡缓冲液的烧杯中以中和洗脱液pH至7. 3， 洗脱出来的抗体溶液用IOkDa超滤管进行浓缩。
[0056] 1. 6十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯化后抗体纯度
[0057] 配制12%的分离胶和5%的浓缩胶，取80yL抗体样品与20yL5X上样缓冲液 混勾，在沸水中煮沸5min。每孔上样12yL，电压调为80V开始电泳，当指示染料进入分离 胶后，将电压调至120V，继续电泳直至染料抵达距分离胶下端约Icm处停止电泳，固定液固 定，考马斯亮蓝染色，脱色液脱色，直至条带清晰可辨，用凝胶成像系统拍照观察。
[0058] I. 7ELISA检测纯化后抗体的效价
[0059] 将乳铁蛋白标准品用包被液稀释至0. 31yg/mL，每孔100yL包被酶标板，4°C过 夜，并用PBS做阴性对照，次日弃去孔内液体，每孔加入200yL封闭液（1 %卵清白蛋白 (OVA))，置37°C恒温箱lh，倾去液体后，用洗涤缓冲液（PBST)洗涤4次，每次静置3min后 迅速倾去洗涤液，拍干。取不同稀释度的纯化后抗体（1 :2000、1 :4000、1 :8000、1 :16000、1 : 32000、I:64000和I:128000)，每个稀释度3个重复，37°C温育lh，然后倾去液体，PBST洗 涤，倾去液体，拍干。每孔加100yL按I:5000稀释的羊抗兔IgG-HRP抗体，37°C温育lh， PBST洗涤，倾去液体，拍干。每孔加入100yL新鲜配制的底物溶液A和底物溶液B，室温孵 育20min。每孔加入50IiL终止液（H2S04, 2mol/L)，5min后在酶标仪上测定450nm下的吸 光度值。若待测孔OD45。大于或等于阴性对照孔的2. 1倍，即认为是阳性值，从而得出抗体 的效价。
[0060] 1. 8乳铁蛋白工作曲线及检出限的测定
[0061] 用本发明制备的多克隆抗体检测乳铁蛋白
[0062] 检测乳铁蛋白的标准曲线的建立
[0063] (1)包被抗原：取含乳铁蛋白0. 50yg/mL的包被液；将该包被液按0.ImL/孔的量 加入酶标板中，4 °C过夜，次日弃去孔内液体；
[0064] ⑵封闭：加封闭液200yL/孔，在37°C恒温箱中封闭Ih;弃液体，用洗涤液洗3 次，每次3min，拍干。
[0065] (3)本发明制备的多克隆抗体与竞争抗原的加入：将本发明制备的多克隆抗体 作适当浓度稀释（1:8000)后，以等体积分别与不同浓度乳铁蛋白（40yg/mL、36iig/mL、 32yg/mL、28yg/mL、24yg/mL、20yg/mL、16yg/mL、12yg/mL、8yg/mL)标准品溶液混勾 后，室温反应15min，每孔加入0.ImL上述混合液，每个标准品做3孔平行；37°C温育lh，然 后倾去液体，PBST洗涤，倾去液体，拍干。
[0066] (4)酶标二抗的加入：每孔加IOOyL用抗体稀释液按I:5000稀释的羊抗兔 IgG-HRP抗体，37°C温育lh，弃液体后，用PBST洗涤4次，倾去液体，拍干。
[0067] (5)显色：取底物溶液（将底物溶液A、B按照1 :1的比例混合），每孔加入100yL， 37°C避光反应20min。
[0068](6)终止：每孔加入50yL终止液（H2SO4, 2mol/L)，5min后在酶标仪上测定450nm 下的吸光度值。
[0069] 结果计算：以乳铁蛋白标准溶液的浓度（ng/mL)的Ig值为横坐标，以抑制率为纵 坐标，制作标准工作曲线，计算抗体与乳铁蛋白的抑制率。
[0070] 1. 9乳腺组织及乳制品中乳铁蛋白浓度的测定
[0071] 将从屠宰场采集的奶牛乳腺组织样品迅速放入液氮保存。测定时，将乳腺组织样 品取出后，倒入液氮进行研磨，称取一定量乳腺组织样品，充分溶解于5倍质量的PBS中，同 时加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂，12000Xg离心IOmin，取上清液，用BCA蛋白浓度测定 试剂盒检测待检样品中总蛋白的含量。取ImL液态奶，加入蒸馏水进行稀释后，3000Xg离 心lOmin，去除上层脂肪。加入稀盐酸调节pH值为4. 6,去除酪蛋白，得到乳铁蛋白粗品。取 3g奶粉样品，加水定容至lOOmL，离心去除脂肪和酪蛋白后，得到乳铁蛋白粗品。利用乳铁 蛋白测定工作曲线，检测乳腺组织、液态奶及奶粉粗提物中乳铁蛋白的含量。
[0072] 1. 10免疫印迹法（Western-blot)鉴定纯化后抗体特异性及反应性
[0073] 将乳铁蛋白纯品溶于PBS溶液中，奶牛乳腺组织、液态奶和奶粉前处理方式同 1.9。以总蛋白浓度作为SDS-PAGE上样量依据，配制12%分离胶和5%浓缩胶，对乳铁蛋白 纯品、奶牛乳腺组织和奶粉样品进行电泳，电泳结束