Dehp人工包被原dehp-ova及其制备和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于小分子有机污染物的免疫化学及生物分析技术领域，涉及有机合成、 免疫化学、分子生物学、理化检测等技术，具体涉及一种邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯DEHP 人工包被原DEHP-OVA及其制备和用途。
【背景技术】
[0002] 邻苯二甲酸酯类塑化剂（缩写为PAEs)，又称酞酸酯类，是一类由邻苯二甲酸与含 有4-15个碳的醇发生费歇尔（Fischer)酯化反应所形成的酯的重要衍生物的统称。这类物 质有特殊性气味，毒性较大，一般情况下状态为粘稠液体；液态条件下温度范围宽，流动性 大，挥发性低，不溶于水，易溶于大多数有机溶剂。这类物质用途广泛，它不仅可作为食品包 装材料、玩具、农药载体、驱虫剂、润滑剂、乙烯地板和壁纸、去泡剂、清洁剂、医用材料（如 人工心脏瓣膜等人工器官、血袋、注射器和胶管）和个人护理用品（主要有化妆品、香味品、 指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液）等近千种产品的生产原材料，还常作为塑料增塑剂被 用于改造塑料制品性能。
[0003] 邻苯二甲酸二（2_乙基）己酯（英文名称：Diethylhexylphthalate，简称DEHP)， 又名酞酸双（2-乙基己）酯，CAS号为117-81-7,分子式为C24H38O4，分子量为390. 56,无色液 体，易溶于乙醇、乙醚和矿物油等。该物质强毒性，可能会造成小孩性别错乱、生殖器短小， 对动物会产生致癌反应；可在人体中累加，可危害男性生殖能力，促使女性性早熟。该物质 主要作为塑胶制品（如：软性PVC产品、医疗注射用品、玩具等）的增塑剂而广泛使用。近 些年来，台湾地区食品中检测到该物质含量较高，已对人体健康构成威胁，因此，DEHP在各 类食品中的含量引起了社会的高度关注。
[0004] 目前对邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯的检测手段主要为气相色谱和高效液相色谱 等仪器检测方法，这些方法虽然准确可靠，但对样品的预处理方法和操作人员的专业性有 很高的要求。正因为这些方法的处理复杂、耗时、仪器价格昂贵而不适合推广使用，也不利 于在环境污染事故现场快速检测。为克服这些缺点，寻求一种快速、简便、灵敏且经济实用 的分析方法就成为环境监测领域的主要研究方向。因此，开展研究并建立有效、可靠的塑 化剂的检测方法及标准，并通过相关的法规予以保障，成为一项极为重要和迫切的工作。
[0005] 20世纪60年代发展起来的免疫分析（Immunoassay,IA)是基于抗原和抗体的特 异性、可逆性结合反应的分析技术。免疫分析具有常规理化分析技术无可比拟的选择性和 高灵敏性，非常适合复杂介质中痕量组分的分析。因此免疫分析具有的特异性强、灵敏度 高、方法快捷简单、分析通量大、检测成本低等优点，使得该类方法可以满足简单、快速、灵 敏地检测持久性有机污染物的要求。1971年Engvail,VanWeerman等报道了检测体液中 微量物质的固相免疫分析技术，即酶联免疫吸附分析法（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)。目前，ELISA方法已经成为免疫分析方法中重要的组成部分。ELISA方法是 将抗原-抗体之间的免疫反应与酶的高效催化特性有机结合而发展起来的一种免疫分析 方法。其中，以亲和素-生物素信号放大系统为基础的亲和素-生物素化酶联免疫吸附分 析方法（BA-ELISA)，以生物素标记抗体（抗原），并以酶标亲和素代替ELISA方法中酶标抗 体。亲和素是卵白蛋白中的一种碱性糖蛋白，分子量约为68kDa。一个亲和素分子由4个亚 单位组成，每个亚单位都可以与一个生物素分子（分子量为244)特异性结合。生物素与亲 和素结合特异性强，其亲和力比抗原抗体反应大得多，亲和常数高达IO15M^由于一个亲和 素能与4个生物素分子结合，因此在检测中可提高被固相结合酶的数量，进而提高检测方 法的灵敏度。
[0006]目前尚没有亲和素-生物素化酶联免疫吸附分析法检测邻苯二甲酸二（2-乙基） 己酯的相关报道。对于邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯免疫监测方法的建立，制备合格的邻 苯二甲酸二丁酯人工包被原是建立邻苯二甲酸二丁酯生物免疫分析检测方法的关键，更是 建立邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯免疫检测方法的关键。
[0007] 因此，邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原的制备是采用免疫方法测定邻苯 二甲酸二（2-乙基）己酯的基础，对于建立塑化剂单体的监测方法，具有重要的应用价值和 理论研究意义。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种步骤简单，速度快，产 率高的邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原（DEHP-OVA)的制备和用途；本发明制备的 塑化剂邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原（DEHP-OVA)为利用包被原、高特异性的多 克隆抗体建立亲和素_生物素化酶联免疫吸附分析方法奠定基础。该亲和素-生物素化 酶联免疫吸附分析方法克服了现有检测方法的缺点：样品预处理复杂费时，检测仪器昂贵， 操作人员操作要求高，方法不易于推广，不能用于环境污染事故的批量现场检测等。
[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
[0010] 第一方面，本发明涉及一种邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原，其结构式如 下：
[0011]
[0012] 第二方面，本发明涉及一种邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原的制备方法， 所述方法包括：
与卵清白蛋白（OVA)偶联反应，即得所述邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原 (DEHP-OVA)〇
[0014] 优选的，所述偶联反应是在0~4°C冰浴遮光条件下进行的，反应时间为24~ 36h。所述偶联反应是在非质子性有机溶剂存在的条件下进行的，所述非质子性有机溶剂选 自N，N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜。
[0015] 优选的，所述方法还包括离心分离，透析上清液，再次离心分离得到所述邻苯二甲 酸二（2-乙基）己酯人工包被原的步骤。
[0016]优选的，所述邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原、戊二醛和卵清白蛋白的摩尔比 为 1: (5 ~7) : (0? 005 ~0? 05)。
[0017] 优选的，所述方法包括将所述邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原溶解于非质子 性有机溶剂中形成半抗原溶液的步骤；所述非质子性有机溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺或 二甲亚砜。
[0018] 优选的，所述邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原是通过包括如下步骤的方法制 备而得的：
生酯化反应，生成4-硝基邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯；
[0020]S2、在非质子性有机溶剂存在的条件下，所述4-硝基邻苯二甲酸二（2-乙基）己 酯和锌粉在强酸B的作用下发生还原反应，生成邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原，即 DEHP半抗原，化学名称为4-氨基邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯，分子式：C24H39NO4，分子量： 405. 57〇
[0021] 优选的，步骤Sl中，4-硝基邻苯二甲酸、异辛醇、强酸A的摩尔比为1: (5~ 6) : (0. 6~0. 7)，反应温度为120~150°C，酯化反应时间为5~6小时；所述强酸A选自 浓盐酸、浓硫酸或浓硝酸。
[0022] 优选的，步骤S2中，所述4-硝基邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯与强酸B、非质子性 有机溶剂和锌粉的摩尔比为1: (20~25) : (550~580) : (18~20)，（其中非质子性有机溶 剂作为基质溶液并不参与反应），还原反应的温度为25~30°C，还原反应时间为10~12 小时；所述非质子性有机溶剂选自苯或甲苯。所述强酸B选自浓盐酸、浓硫酸或浓硝酸。
[0023] 优选的，步骤Sl还包括酯化反应结束后蒸馏除去未反应的异辛醇和生成的水，再 趁热将液体倒入冰水中，下层的黄色油状粗品用10%Na2OV^液洗涤至水层呈无色，重结 晶，得到纯化后的4-硝基邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯的步骤。
[0024] 优选的，步骤S2还包括回流反应结束后用冰水和强碱以终止反应，苯萃取反应 液，分离、干燥并减压蒸馏去除有机相，得到的粗品再用硅胶柱层析（洗脱剂为体积比为 1:15的乙酸和正己烷的混合液）纯化，得到纯化后的邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原 的步骤。有机相以除去苯，后减压蒸馏，
[0025] 优选地，所述采用戊二醛法将邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原与蛋白质分子 卵清白蛋白OVA偶联制备人工包被原DEHP-OVA具体包括以下步骤：
[0026]B、将DEHP半抗原溶于非质子溶剂中，形成DEHP半抗原溶液；卵清白蛋白OVA溶于 PBS中，形成卵清白蛋白溶液；将所述DEHP半抗原溶液滴入卵清白蛋白OVA溶液中形成反 应液；
[0027]C、向上述反应液中加入戊二醛，搅拌反应；
[0028]D、反应结束后，离心分离上清液，将上清液装入透析袋中透析，离心分离沉淀后得 即得邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原DEHP-0VA。
[0029] 本发明采用戊二醛法合成邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原，其反应方程 式如下：
[0030]
[0031] 上述反应方程式中，戊二醛一端的醛基与邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原 4_氨基邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯的氨基结合，戊二醛另一端的醛基与卵清白蛋白OVA 一端的氨基结合，偶联脱水，生成了DEHP人工包被原
[0033] 优选地，所述DEHP半抗原、戊二醛、OVA的摩尔比为1: (5~7) : (0. 005~0. 05)。
[0034] 优选地，步骤C中，所述搅拌时间为24~36小时。
[0035] 为充分反应，根据经验，当半抗原与戊二醛、OVA反应的摩尔比是1:7:0. 005时搅 拌反应24小时就可以，当半抗原与戊二醛、OVA反应的摩尔比是1:5:0. 05时反应就需要36 小时。
[0036] 优选地，步骤B中，所述非质子溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜；所述将 DEHP半抗原溶液滴入OVA溶液是在0~4°C低温磁力搅拌下进行。所有需要保持蛋白活性 的长时间反应都需要在低温情况下进行，经验表明〇~4°C最合适。
[0037] 第三方面，本发明涉及一种邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原