在用于痕量 塑化剂邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯检测中的用途。
[0038] 优选的，所述检测采用亲和素-生物素化酶联免疫吸附分析方法，检测时所述邻 苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原与被分析物邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯直接竞争 具特异性免疫反应的抗邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯特异性抗体。
[0039] 本发明的抗邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯特异性抗体可以是邻苯二甲酸二（2-乙 基）己酯半抗原与牛血清蛋白BSA偶联制备人工免疫原；该人工免疫原通过生物体免疫反 应法制备得到的抗邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯的特异性抗体。
[0040] 由于邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原（DEHP-OVA)可以与被分析物邻苯 二甲酸二（2-乙基）己酯形成直接竞争关系，它们都能特异性识别抗邻苯二甲酸二（2-乙 基）己酯的多克隆抗体，进而建立专一、高效的生物免疫方法用于水体、土壤、大气等环境 样品和各类食品中痕量塑化剂邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯的检测。
[0041] 本发明的机理在于：由于邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯是小分子物质，只具有反应 原性而没有包被原性，而且该分子上没有能与蛋白质分子直接结合的氨基、羧基等官能团， 故本发明选择4-硝基邻苯二甲酸为原料，通过两步反应（包括酯化反应和还原反应）制备 带有氨基活性基团的邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原，然后用戊二醛法将这个含氨基 的半抗原与卵清白蛋白偶联制备人工包被原，将其用于建立针对邻苯二甲酸二（2-乙基） 己酯的亲和素-生物素化酶联免疫吸附分析方法。
[0042] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0043] 1)人工包被原实用性强：邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原的制备具有重 要的实用价值和现实意义。利用本专利中介绍的方法，成功制备了邻苯二甲酸二（2-乙基） 己酯人工包被原（DEHP-OVA)。该人工包被原保留了邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯的结构， 具有针对邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯的抗原决定簇，为建立荧光免疫PCR方法提供了保 障。
[0044] 2)人工包被原稳定性好：此法合成的邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原具 有较好的稳定性，在〇~4°C环境下可保存12个月不变性，-20°C环境下可保存3~5年。
[0045] 3)人工包被原制备技术简便可行：抗原的整个制备过程无需特别的仪器设备，成 本低廉，容易工业化规模生产。
【附图说明】
[0046] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0047] 图1为邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原的制备流程示意图；
[0048] 图2为邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原红外光谱；
[0049] 图3为邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原核磁共振光谱；
[0050] 图4为邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原、蛋白质和人工包被原的紫外吸收光 谱图；
[0051] 图5为间接竞争BA-ELISA免疫分析方法检测邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯的标 准工作曲线。
【具体实施方式】
[0052] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述，这些实例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读本发明讲授的内容后，本领域技术人员可以 对本发明作各种改动或修改，这些等价同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0053] 本发明的邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原的制备流程示意图如图1所 示，制备时，4-硝基邻苯二甲酸与异辛醇在强酸的催化作用下发生酯化反应得4-硝基邻苯 二甲酸二（2-乙基）己酯；4-硝基邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯和锌粉、强酸发生还原反应 得邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原；采用戊二醛法，将所述半抗原与卵清白蛋白偶联， 即得DEHP人工包被原DEHP-0VA。戊二醛法反应中，邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原 4_氨基邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯的氨基与戊二醛一端的醛基结合，戊二醛另一端的醛 基与卵清白蛋白OVA-端的氨基结合，偶联脱水，生成了DEHP人工包被原DEHP-OVA。具体 制备及应用见以下各实施例：
[0054] 实施例1、邻苯二甲酸二（2-乙基）己醅半抗原的制备与鉴宙
[0055] (1)邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原的制备
[0056] 称取IOg(0. 0474mol) 4-硝基邻苯二甲酸加入到圆底烧瓶中，随后缓慢加入 44. 6mL(0. 2850mol)异辛醇，边搅拌边加入 1.65mL*H2S04(0 . 0 3 04mol)催化，120°C搅拌 回流，反应混合物滴到薄层层析硅胶板（2. 5cmX8. 0cm)以便检验反应是否完成；直至薄板 层析法（TLC)检测原料点消失为止（显色剂：丙酮溶剂中溶解少量的高锰酸钾；展开剂，正 己烷：乙酸乙酯=5:1);搅拌回流6h后反应完成；蒸馏除去未反应的异辛醇和生成的水； 此时将液体趁热倒入冰水中，磁力搅拌5min后静置一段时间分层，将下层黄色油状液体用 10%Na2CO3溶液洗涤至水层呈无色（pH7.0-8. 0);最后，油状粗品用无水硫酸钠脱水干燥， 得到黄色油状液体4-硝基邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯即DEHP半抗原中间体。
[0057] 将2. 0g(0. 0046mmol)DEHP半抗原中间体（4-硝基邻苯二甲酸二（2-乙基）己 酯）装入到容积为500mL三口圆底烧瓶底部，随后边搅拌边向瓶底加入230mL(2. 5871mol) 苯，待搅拌均匀后再加入2. 8g(0. 0428mol)纯锌粉，搅拌均匀后再分次加入8. 2mL浓 HC1(0. 0984mol)，25°C搅拌 15min后再次加入 2. 8g(0. 0428mol)纯锌粉，25°C搅拌反应 Ilh;反应结束后，将230mL冷水加入反应体系，并用IM氢氧化钠溶液中和至弱碱性（pH 7. 0-8. 5);静置Ih后分离出苯层，再用苯萃取水层，合并萃取液，水洗后用无水Na2SOJ^bK 干燥；萃取液减压蒸馏以除去苯，得到的黄色固体经过硅胶柱层析（洗脱剂为，乙酸和正己 烷的混合液（V/V= 15:1))后减压蒸馏，得到黄色晶体4-氨基邻苯二甲酸二（2-乙基） 己酯，即DEHP半抗原。邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原分子式：C24H39NO4，分子量： 405. 57 ;产率 65. 2% ;熔点：34 ~36°C;纯度 98%。
[0058] (2)邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原的鉴定
[0059]将制得的半抗原经红外光谱（图2)、核磁共振光谱（图3)鉴定，结 果为：IR(KBr)V/cm1Z3565. 49 (-NH2)，3473. 78, 3376. 37 (-NH2)，1714. 16(C= 0),1280.38, 1127.72 (C-O-C) ,29 58. 83,2930. 61, 28 73. 27, 2860. 21 (-CH3), 1463. 19 (d-0CH2CH(CH2CH3)CH2CH2CH2-) , 1603. 78, 1569. 83, 1382. 04(C=C), 1628.00,835.80(C-H，Ar)!1HNMR(400MHz,CDCl3) :5 7. 68 (d，lH,ArH)，7.24 (d，lH,ArH)， 6. 76 (d，1H，ArH)，4. 19 (b，2H，-NH2)，4. 14 (t，2H，OCH2)，4. 12 (t，2H，OCH2)， I. 64 (m，2H，OCH2CH)，I. 62 -I. 04 (m，16H，OCH2CH(CH2CH3)CH2CH2CH2)，0? 95 - 0? 87 (t，12H，OCH 2CH2 (CH2CH3)CH2CH2CH2CH3)ppm。红外、核磁表征结果表明，DEHP半抗原具有苯环、（2-乙基） 己氧基、氨基等基团的特征吸收峰，证明制备的DEHP半抗原分子中含有氨基官能团，最终 实验中成功制备了DEHP半抗原。
[0060] 从以上分析可知，所合成的产物为目标物。
[0061] 实施例2、邻苯二甲酸二（2-乙基）己醅半抗原的合成与鉴宙
[0062] (1)邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原的制备
[0063] 称取IOg(0. 0474mol) 4-硝基邻苯二甲酸加入到圆底烧瓶中，随后缓慢加入 37.2mL(0.2375mol)异辛醇，边搅拌边加入 1.55mL*H2S04(0 . 0 2 8 5mol)催化，150°C搅拌 回流，反应混合物滴到薄层层析硅胶板（2. 5cmX8.Ocm)以便检验反应是否完成；直至薄板 层析法（TLC)检测原料点消失为止（显色剂：丙酮溶剂中溶解少量的高锰酸钾；展开剂，正 己烷：乙酸乙酯=5:1);搅拌回流6h后反应完成；蒸馏除去未反应的异辛醇和生成的水； 此时将液体趁热倒入冰水中，磁力搅拌5min后静置一段时间分层，将下层黄色油状液体用 10%Na2CO3溶液洗涤至水层呈无色（pH7.0-8. 0);最后，油状粗品用无水硫酸钠脱水干燥， 得到黄色油状液体4-硝基邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯即DEHP半抗原中间体。
[0064]将2. 0g(0. 0046mmol)DEHP半抗原中间体（4_硝基邻苯二甲酸二（2-乙基）己 酯）装入容积为500mL三口圆底烧瓶底部，随后向瓶底边搅拌边加入227mL(2. 5534mol) 苯，待半抗原被苯溶解后再加入3.Og(0. 0460mol)纯锌粉，搅拌均匀后分次加入7. 7mL浓 HCl(0. 0924mol)，室温搅拌15min后再次加入3. 0g(0. 0460mol)纯锌粉，28°C搅拌反应 12h;反应结束后，将227mL冷水加入反应体系，并用IM氢氧化钠溶液中和至弱碱性（pH 7. 0-8. 5);静置Ih后分离出苯层，再用苯萃取水层，合并萃取液，水洗后用无水Na2SO4脱水 干燥，萃取液减压蒸馏以除去苯，得到的黄色固体经过硅胶柱层析（洗脱剂为，乙酸和正己 烷的混合液（V/V= 15:1))后减压蒸馏，得到黄色晶体4-氨基邻苯二甲酸二（2-乙基）己 酯，即DEHP半抗原。邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原分子式：C24H39NO4，分子量：405. 57; 产率66. 1% ;熔点：34~36°C;纯度98%。