包被原经紫外-可见分光光度计鉴定后，冷冻干燥、小 量分装，-20°C冷冻保存。
[0097] (2)邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原的鉴定
[0098] 可进行包被原鉴定的方法有色谱法、红外光谱法、紫外光谱法、SDS-PAGE凝胶电泳 等。其中最常用的方法是紫外可见光谱法。一般来说，只要包被原的紫外_可见光谱与载 蛋白和半抗原的紫外光谱不同，即可间接说明半抗原成功与蛋白质偶联，包被原合成成功。 因为根据朗伯-比尔定律，当波长一定时，混合物的紫外吸收具有加合性。
[0099] 包被原的紫外光谱表征具体为：将制备的包被原适当稀释，使其吸光度在0. 1~ 2. 0之间，以PBS为空白对照，用紫外分光光度计在200~500nm分别测定邻苯二甲酸二 (2_乙基）己酯半抗原和包被原腿P-OVA的吸光值，绘制紫外吸收光谱图，并根据以下公式 计算偶联比：
[0100]
[01 01 ]式中：ODccinjugate 偶联物吸光度；ODprotein 蛋白质吸光值；ODhapten 半 抗原吸光值；Chapten--半抗原浓度；Cprotein--蛋白质浓度；Mhapten--半抗原分子量； Mprotein--蛋白质分子量。
[0102] 本发明采用全波长紫外分光光度计对半抗原、载体蛋白和包被原进行扫描，根据 特征吸收峰的位置确定偶联是否成功。元素分析结果进一步证明了产物的结构和所设计的 路线一致。
[0103] 由紫外光谱（图4)可知，DEHP半抗原有两个紫外吸收峰即286nm和309nm，其中 309nm处紫外吸收峰为特征峰；载体蛋白OVA有三个紫外吸收峰，分别位于219nm、224nm、 268nm处有特征吸收峰，其中268nm紫外吸收峰处的吸收值较低；包被原DEHP-OVA有两个 紫外吸收峰，分别位于229nm和343nm处。231nm和374nm处。此外，我们可以清晰发现，半 抗原在309nm处的紫外吸收峰发生红移后转移到343nm处，这可能是受到载体蛋白的吸收 峰的影响所致，吸收峰红移现象的出现说明偶联成功。计算DEHP-OVA中DEHP与OVA的结 合比分别为36. 1:1。
[0104] (3)邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原蛋白质浓度的测定
[0105] 根据考马斯亮蓝G250法测定包被原蛋白质浓度。考马斯亮蓝G250在游离时为红 色，与蛋白质结合后为青蓝色，前者最大吸收值在465nm，后者在595nm处。以OVA为标准物 质配置不同浓度标准溶液，与一定量考马斯亮蓝G250反应后，分别在595nm处测定溶液吸 光度值。标准溶液在0-150yg/mL范围内线性关系良好。在稀释一定倍数的包被原溶液中 加入考马斯亮蓝染色，在相同波长处测量吸光度值，后与标准曲线比较，得制备的包被原蛋 白质浓度为I. 〇9mg/mL。
[0106] 这些包被原可以作为免疫竞争对象而使用。
[0107] 实施例6、间接竞争BA-ELISA免痔分析方法检测环境样品中邻苯二甲酸二（2-乙 基）P1醅
[0108] 为了证明DEHP人工包被原DEHP-OVA制备成功，通过与DEHP标准溶液竞争与抗 DEHP多克隆抗体之间的特异性识别反应，进而建立间接竞争BA-ELISA免疫分析方法检测 环境中的DEHP，具体步骤如下：用用包被缓冲液（0.05MpH9. 60碳酸盐缓冲液）适当稀释 包被原溶液（DEHP-OVA)，100yL/孔，加入96孔酶标板中，4°C包被过夜；次日倒掉包被液， 每孔加入200yL洗涤液（0.OlMpH7. 40PBST)，重复洗涤三次，每次3min;用吸水纸拍干 酶标板后，每孔加入封闭液200yL，37°C温育1小时；倒掉封闭液，重复上述洗涤过程三次， 生物素化抗DEHP多克隆抗体（Bio-pAb-DEHP)稀释至适当浓度，每孔依次加入50yL生物 素化抗体及50yLDEHP标准样品（用含5%二甲亚砜（DMSO)的PBS(v/v)梯度稀释），空 白孔每孔加入100yLPBS缓冲液，37°C温育30分钟；倒掉抗原-抗体反应液，重复洗涤三 次，用PBST适当稀释辣根过氧化酶（HRP)标记的链霉亲和素（HRP-SA)，每孔加入IOOyL， 37°C温育1小时；倒掉HRP-SA溶液，重复洗涤五次，每孔加入新鲜配制的显色液（400yL 2. 5mg/mL3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺底物溶液与IOmL磷酸盐-柠檬酸底物缓冲液、10yL 30%的H2O2混合形成显色液）100yL/孔，室温下避光反应15min;每孔加入50yL终止液 (2mol/L硫酸溶液）以终止显色，然后用酶标仪测定各孔在450nm和630nm处吸光度值（0D 值），以OD=OD4m-OD63。作为最终读数。实验结果用抑制率来表示，并以抑制率为纵坐标， 标准样品浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线，建立的标准工作曲线如图5所示。其中，抑 制率（％) = (1-A/A。）X100,其中A为有样品存在的孔的OD值，A。为没有样品存在的孔的 OD值。
[0109] 生物素化抗体的制备如下：用0. 05MpH9. 60碳酸盐缓冲液将纯化后的抗DEHP多 克隆抗体稀释至I.Omg/mL左右，取2mL加入锥形瓶中；用DMSO配制I.Omg/mL生物素-N-琥 珀酰亚胺基酯（BNHS)溶液，向上述锥形瓶中加入BNHS溶液，使BNHS:IgG的质量比为1 :10， 室温下搅拌反应4小时；反应结束后将反应液装入透析袋中，用PBS缓冲液透析3d，每天换 水3次。离心分离去除少量沉淀后，即得相应的生物素化抗体溶液（Bio-pAb-DEHP)，抗体溶 液小体积分装后，于_20°C冷冻保存。
[0110] 间接竞争BA-ELISA免疫分析方法检测邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯的标准曲 线方程为Y= 21. 57LgCDEHP+56. 01，相关系数R= 0. 9832,其中IC5。表示检测方法的灵敏 度，即抑制率为50%时对应的分析物浓度0. 526yg/LJC1。表示方法的检测下限，即抑制 率为10 %时对应的分析物浓度0. 0074yg/L;IC2Q-ICS。表示线性范围，即0. 021yg/L~ 12. 948yg/L。与传统仪器分析方法相比，灵敏度提高了 100-500倍。
[0111] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影 响本发明的实质内容。
【主权项】
1. 一种邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原，其结构式如下：2. -种如权利要求1所述的邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原的制备方法，其 特征在于，所述方法包括： 采用戊二醛法，将邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原_ 卵清白蛋白偶联反应，即得所述邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原。3. 根据权利要求2所述的邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原的制备方法，其特 征在于，所述偶联反应是在0~4°C冰浴遮光条件下进行的，反应时间为24~36h。4. 根据权利要求2所述的邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原的制备方法，其 特征在于，所述方法还包括离心分离，透析上清液，再次离心分离得到所述邻苯二甲酸二 (2-乙基）己酯人工包被原的步骤。5. 根据权利要求2所述的邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原的制备方法，其 特征在于，所述邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原、戊二醛和卵清白蛋白的摩尔比为 1: (5 ~7) : (0? 005 ~0? 05) 〇6. 根据权利要求2所述的邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原的制备方法，其 特征在于，所述邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原是通过包括如下步骤的方法制备而得 的： 51、 在强酸性介质存在的条件下，4-硝基邻苯二甲酿与异辛 醇发生酯化反应，生成4-硝基邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯； 52、 在非质子性有机溶剂存在的条件下，所述4-硝基邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯和 锌粉、强酸发生还原反应，生成邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原。7. 根据权利要求6所述的邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原的制备方法，其特 征在于，步骤S1中，4-硝基邻苯二甲酸、异辛醇、强酸性介质的摩尔比为1: (5~6) : (0. 6~ 〇. 7)，所述酯化反应的反应温度为120~150°C，反应时间为5~6小时；所述强酸性介质 选自浓盐酸、浓硫酸或浓硝酸。8. 根据权利要求6所述的邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原的制备方法，其特 征在于，步骤S2中，所述4-硝基邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯与强酸、非质子性有机溶剂 和锌粉的摩尔比为1: (20~25) : (550~580) : (18~20);所述还原反应的温度为25~ 30°C，还原反应时间为10~12小时。9. 一种如权利要求1所述的邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原在用于痕量塑化 剂邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯检测中的用途。10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述检测为亲和素-生物素化酶联免疫 吸附分析方法，检测时所述邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原与被分析物邻苯二甲 酸二（2-乙基）己酯直接竞争具特异性免疫反应的抗邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯特异性 抗体。
【专利摘要】本发明提供一种DEHP人工包被原DEHP-OVA及其制备和用途；所述人工包被原结构式如下：制备时，4-硝基邻苯二甲酸与异辛醇在强酸催化作用下酯化反应得4-硝基邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯；4-硝基邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯和锌粉在强酸作用下发生还原反应得邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯半抗原；采用戊二醛法，将所述半抗原与卵清白蛋白偶联制得所述人工包被原DEHP-OVA。本发明的人工包被原可以与被分析物邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯形成直接竞争关系，都能特异性识别抗邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的多克隆抗体，为建立免疫检测方法奠定基础。此外，本发明的制备方法简单，稳定性好，成本低，易于工业化生产。
【IPC分类】C07K14/77, C07K1/107, G01N33/543
【公开号】CN105085668
【申请号】CN201510515734
【发明人】庄惠生, 孙瑞艳
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月20日