[0065] (2)邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯半抗原的鉴定
[0066] 将制得的半抗原经红外光谱（图2)、核磁共振光谱（图3)鉴定，结 果为：IR(KBr)V/cm1Z3565. 49 (-NH2)，3473. 78, 3376. 37 (-NH2)，1714. 16(C= 0),1280.38, 1127.72 (C-O-C) ,29 58. 83,2930. 61, 28 73. 27, 2860. 21 (-CH3), 1463. 19 (d-0CH2CH(CH2CH3)CH2CH2CH2-),1603. 78, 1569. 83, 1382. 04(C=C), 1628.00,835.80(C-H，Ar)!1HNMR(400MHz,CDCl3) :5 7. 68 (d，lH,ArH)，7.24 (d，lH,ArH)， 6. 76 (d，1H，ArH)，4. 19 (b，2H，-NH2)，4. 14 (t，2H，OCH2)，4. 12 (t，2H，OCH2)， I. 64 (m，2H，OCH2CH)，I. 62 -I. 04 (m，16H，OCH2CH(CH2CH3)CH2CH2CH2)，0? 95 - 0? 87 (t，12H，OCH 2CH2 (CH2CH3)CH2CH2CH2CH3)ppm。红外、核磁表征结果表明，DEHP半抗原具有苯环、（2-乙基） 己氧基、氨基等基团的特征吸收峰，证明制备的DEHP半抗原分子中含有氨基官能团，最终 实验中成功制备了DEHP半抗原。
[0067] 从以上分析可知，所合成的产物为目标物。
[0068] 实施例3、邻苯二甲酸二（2-乙基）P1醅人工包被原的合成与鉴宙
[0069] (1)邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原的合成
[0070] 通过戊二醛法制备DEHP包被原DEHP-0VA，具体合成步骤：将0. 0406g(0.Immol) DEHP半抗原装入容积为25mL的锥形瓶中，边滴加ImLN，N-二甲基甲酰胺（DMF)边 搅拌，搅拌均匀后再逐滴加入到〇.〇8mMOVA溶液（0.OlMpH7. 40磷酸盐缓冲液溶 解）10mL(0. 0008mmol)中，随后向该混合体系中缓慢加入0. 038mL(0. 55mmol)25%戊二醛， 4°C低温闭光搅拌反应30h后，将得到的抗原粗品装入透析袋，置于0.OlMpH7. 40磷酸盐缓 冲液中低温4°C透析3d，每隔8h换水1次，最后将终产物4000r?min1离线15min，取其上 清液即DEHP包被原DEHP-0VA。包被原经紫外-可见分光光度计鉴定后，冷冻干燥、小量分 装，-20°C冷冻保存。
[0071] (2)邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原的鉴定
[0072] 可进行包被原鉴定的方法有色谱法、红外光谱法、紫外光谱法、SDS-PAGE凝胶电 泳等。其中最常用的方法是紫外可见光谱法。一般来说，只要包被原的紫外-可见光谱与 载蛋白和半抗原的紫外光谱不同，即可间接说明半抗原成功与蛋白质偶联，包被原合成成 功。因为根据朗伯-比尔定律，当波长一定时，混合物的紫外吸收具有加合性。
[0073] 包被原的紫外光谱表征具体为：将制备的包被原适当稀释，使其吸光度在0. 1~ 2. 0之间，以PBS为空白对照，用紫外分光光度计在200~500nm分别测定邻苯二甲酸二 (2_乙基）己酯半抗原和包被原腿P-OVA的吸光值，绘制紫外吸收光谱图，并根据以下公式 计算偶联比：
[0074]
[00"75]式中：ODccinjugate偶联物吸光度；ODprotein蛋白质吸光值；ODhapten半 抗原吸光值；Chapten--半抗原浓度；Cprotein--蛋白质浓度；Mhapten--半抗原分子量； Mprotein--蛋白质分子量。
[0076] 本发明采用全波长紫外分光光度计对半抗原、载体蛋白和包被原进行扫描，根据 特征吸收峰的位置确定偶联是否成功。元素分析结果进一步证明了产物的结构和所设计的 路线一致。
[0077] 由紫外光谱（图4)可知，DEHP半抗原有两个紫外吸收峰即286nm和309nm，其中 309nm处紫外吸收峰为特征峰；载体蛋白OVA有三个紫外吸收峰，分别位于219nm、224nm、 268nm处有特征吸收峰，其中268nm紫外吸收峰处的吸收值较低；包被原DEHP-OVA有两个 紫外吸收峰，分别位于229nm和343nm处。231nm和374nm处。此外，我们可以清晰发现，半 抗原在309nm处的紫外吸收峰发生红移后转移到343nm处，这可能是受到载体蛋白的吸收 峰的影响所致，吸收峰红移现象的出现说明偶联成功。计算DEHP-OVA中DEHP与OVA的结 合比分别为36.1:1。
[0078] (3)邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原蛋白质浓度的测定
[0079] 根据考马斯亮蓝G250法测定包被原蛋白质浓度。考马斯亮蓝G250在游离时为红 色，与蛋白质结合后为青蓝色，前者最大吸收值在465nm，后者在595nm处。以OVA为标准物 质配置不同浓度标准溶液，与一定量考马斯亮蓝G250反应后，分别在595nm处测定溶液吸 光度值。标准溶液在0-150yg/mL范围内线性关系良好。在稀释一定倍数的包被原溶液中 加入考马斯亮蓝染色，在相同波长处测量吸光度值，后与标准曲线比较，得制备的包被原蛋 白质浓度为I. 〇9mg/mL。
[0080] 这些包被原可以作为免疫竞争对象而使用。
[0081]实施例4、邻苯二甲酸二（2-乙基）P1醅人工包被原的合成与鉴宙
[0082] (1)邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原的合成
[0083] 通过戊二醛法制备DEHP包被原DEHP-0VA，具体合成步骤：将0. 0406g(0.Immol) DEHP半抗原装入容积为25mL的锥形瓶中，边滴加ImLN，N-二甲基甲酰胺（DMF)边 搅拌，搅拌均匀后再逐滴加入到〇. 4mMOVA溶液（0.OlMpH7. 40磷酸盐缓冲液溶 解）12. 5mL(0. 005mmol)中，随后向该混合体系中缓慢加入0. 051mL(0. 7mmol)25%戊二醛， 3°C低温闭光搅拌反应36h后，将得到的抗原粗品装入透析袋，置于0.OlMpH7. 40磷酸盐 缓冲液中低温4°C透析3d，每隔8h换水1次，最后将终产物4000r?min1离线15min，取其 上清液即DEHP包被原DEHP-OVA。包被原经紫外-可见分光光度计鉴定后，冷冻干燥、小量 分装，-20°C冷冻保存。
[0084] (2)邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原的鉴定
[0085] 可进行包被原鉴定的方法有色谱法、红外光谱法、紫外光谱法、SDS-PAGE凝胶电泳 等。其中最常用的方法是紫外可见光谱法。一般来说，只要包被原的紫外_可见光谱与载 蛋白和半抗原的紫外光谱不同，即可间接说明半抗原成功与蛋白质偶联，包被原合成成功。 因为根据朗伯-比尔定律，当波长一定时，混合物的紫外吸收具有加合性。
[0086] 包被原的紫外光谱表征具体为：将制备的包被原适当稀释，使其吸光度在0.1~ 2. 0之间，以PBS为空白对照，用紫外分光光度计在200~500nm分别测定邻苯二甲酸二 (2_乙基）己酯半抗原和包被原腿P-OVA的吸光值，绘制紫外吸收光谱图，并根据以下公式 计算偶联比：
[0087]
[0088]式中：ODccinjugate偶联物吸光度；ODprotein蛋白质吸光值；ODhapten半 抗原吸光值；Chapten--半抗原浓度；Cprotein--蛋白质浓度；Mhapten--半抗原分子量； Mprotein--蛋白质分子量。
[0089] 本发明采用全波长紫外分光光度计对半抗原、载体蛋白和包被原进行扫描，根据 特征吸收峰的位置确定偶联是否成功。元素分析结果进一步证明了产物的结构和所设计的 路线一致。
[0090] 由紫外光谱（图4)可知，DEHP半抗原有两个紫外吸收峰即286nm和309nm，其中 309nm处紫外吸收峰为特征峰；载体蛋白OVA有三个紫外吸收峰，分别位于219nm、224nm、 268nm处有特征吸收峰，其中268nm紫外吸收峰处的吸收值较低；包被原DEHP-OVA有两个 紫外吸收峰，分别位于229nm和343nm处。231nm和374nm处。此外，我们可以清晰发现，半 抗原在309nm处的紫外吸收峰发生红移后转移到343nm处，这可能是受到载体蛋白的吸收 峰的影响所致，吸收峰红移现象的出现说明偶联成功。计算DEHP-OVA中DEHP与OVA的结 合比分别为36.1:1。
[0091] (3)邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原蛋白质浓度的测定
[0092] 根据考马斯亮蓝G250法测定包被原蛋白质浓度。考马斯亮蓝G250在游离时为红 色，与蛋白质结合后为青蓝色，前者最大吸收值在465nm，后者在595nm处。以OVA为标准物 质配置不同浓度标准溶液，与一定量考马斯亮蓝G250反应后，分别在595nm处测定溶液吸 光度值。标准溶液在0-150yg/mL范围内线性关系良好。在稀释一定倍数的包被原溶液中 加入考马斯亮蓝染色，在相同波长处测量吸光度值，后与标准曲线比较，得制备的包被原蛋 白质浓度为I. 〇9mg/mL。
[0093] 这些包被原可以作为免疫竞争对象而使用。
[0094]实施例5、邻苯二甲酸二（2-乙基）P1醅人工包被原的合成与鉴宙
[0095] (1)邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯人工包被原的合成
[0096] 通过戊二醛法制备DEHP包被原DEHP-0VA，具体合成步骤：将0. 0406g(0.Immol) DEHP半抗原装入容积为25mL的锥形瓶中，边滴加lmLN，N-二甲基甲酰胺（DMF)边 搅拌，搅拌均匀后再逐滴加入到〇.〇8mMOVA溶液（0.OlMpH7. 40磷酸盐缓冲液溶 解）6.25mL(0. 0005mmol)中，随后向该混合体系中缓慢加入0. 036mL(0. 5mmol) 25 %戊二 醛，2°C低温闭光搅拌反应24h后，将得到的抗原粗品装入透析袋，置于0.OlMpH7. 40磷酸 盐缓冲液中低温4°C透析3d，每隔8h换水1次，最后将终产物4000r?min1离线15min，取 其上清液即DEHP包被原DEHP-0VA。