专利名称：一种键合型手性固定相的制备方法
技术领域：
本发明属于手性固定相领域，具体涉及一种适用于高效液相色谱(HPLC)的以二 氧化硅为载体的多糖类手性固定相。
背景技术：
手性固定相由具有光学活性的小分子或手性聚合物通过化学键合反应到或涂敷 到硅胶载体表面上而得到。拆分时，由对映体样品与键合或涂敷的手性分子形成非对映 异构体络合物的结合能力的差别而达到分离，分离效率和洗脱顺序取决于复合物的相对强 度。手性固定相的主要类型有蛋白质键合相、多糖类键合相、手性聚合物键合相、环糊精键 合相和大环抗体类等。其中多糖，具有良好精细的结构，经过改性后适用手性识别的范围和 能力大大扩展，为当前手性固定相的首选材料。由于手性固定相分离测定对映体速度快、柱 效高、操作简单、适应范围广，目前在三点作用分离理论的指导下已经发展成对映体分离最 迅速的领域，也是手性色谱发展的关键和核心。在目前报道的手性柱固定相合成中涉及的基本方法分为涂敷法、整体成球法、共 聚-交联法、键合法。涂敷法是将多糖衍生物溶解于合适的有机溶剂称为涂敷溶剂，再加入 硅胶载体，使其充分吸附多糖衍生物，然后蒸除涂敷溶剂，使多糖衍生物析出并附着于硅胶 表面。涂敷型多糖衍生物拆分能力强，但流动相选择范围窄。整体微球型手性固定相不使 用昂贵的大孔硅胶担体，降低了固定相的制备成本，同时也提高了固定相的柱载量。但这种 微球的孔性结构复杂，内扩散阻力大，溶质在短时间内很难达到吸附-脱附平衡而产生较 宽的洗脱峰，仅仅在低流速条件下才体现其柱载量高的优点。交联-共聚法同时克服了键 合型固定相拆分能力降低和涂敷型固定相流动相选择范围小的缺点。键合型固定相则是将 纤维素衍生物键合于担体表面，扩大了流动相的选择范围但手性选择性有所降低，但选用 糖类单体很好解决了这一问题。目前多糖衍生物手性固定相键合法，主要采用常规方法合成的手性聚合物的种类 少，分子结构不能进行设计、分子量及分子量分布很宽等；键合到二氧化硅粒子表面时接枝 率低下，操作麻烦、所接手性聚合物接联点分布不均勻且难以控制等导致固定相载样量低 使得拆分效率受到影响。
发明内容
本发明目的是提供一种键合型手性固定相的制备方法，控制聚合物的分子量以及 分子量分布，同时提高多糖衍生物手性链在二氧化硅的表面接枝率。为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种键合型手性固定相的制备方法， 包括合成手性聚合物链，制备二氧化硅载体以及将手性聚合物链键合到二氧化硅载体上， 具体地，包括以下步骤(1)合成手性聚合物链以对双丙酮-D-半乳糖苯乙烯(VBPG)作为单体，以含炔 基的有机卤化物为引发剂，采用原子转移自由基聚合(ATRP)反应合成含炔基的手性聚合物链聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯；(2)制备二氧化硅载体采用史托伯(StSber)法合成二氧化硅粒子，通过氯甲基 化硅烷偶联剂进行氯甲基化得到氯甲基化的二氧化硅粒子，然后与叠氮化钠反应得到叠氮 化二氧化硅粒子；(3)将步骤(1)制备的含炔基的手性聚合物链与步骤(2)所得叠氮化二氧化硅粒 子通过点击化学(click chemistry)反应键合将步骤(1)制备的手性聚合物链与步骤(2) 所得叠氮化二氧化硅粒子充分溶解和分散在溶剂中，再加入抗坏血酸钠和无水硫酸铜的水 溶液，反应得到手性聚合物链修饰的二氧化硅粒子，所述手性聚合物链修饰的二氧化硅粒 子即键合型手性固定相。具体地，上述技术方案包括以下步骤(1)以对双丙酮-D-半乳糖苯乙烯作为单体，以含炔基的有机卤化物为引发剂，按 摩尔比，单体引发剂催化剂=20 200 1 0.1 1，将单体、引发剂、催化剂和配位 剂加入溶剂中，在惰性气氛下，于70 100°C下，进行铜盐催化的原子转移自由基聚合反应 合成含炔基的手性聚合物链聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯，所得含炔基的手性聚合物链聚双 丙酮-D-半乳糖苯乙烯的聚合度为20 200 ；合成手性聚合物链聚双丙酮-D-半乳糖苯乙 烯(P(VBPG))的结构通式如下
(-CH2-)、-CH2CH2-或-C (CH3) 2_，聚合度 η = 20 200 ；其中，所述引发剂选自α-溴异丁酸丙炔酯、α-溴异丁酸丁炔酯和α-溴异丁酸 甲基丁炔酯中的一种；所述催化剂选自溴化亚铜或者氯化亚铜中的一种；所述配位剂选 自-.2,2' -二联吡啶或者五甲基二乙烯基三胺中的一种；所述溶剂选自甲苯、四氢呋喃或 者苯甲醚中的一种；(2)按照现有技术，采用史托伯法合成粒径为100 5000nm的二氧化硅粒子，然后 将二氧化硅粒子分散在溶剂A中，在惰性气氛中，加入氯甲基化硅烷偶联剂，90 105°C反 应10 21h，得到氯甲基化的二氧化硅粒子；然后将氯甲基化的二氧化硅分散在含有叠氮 化钠的溶液中，于75 95°C反应18 24h，得到叠氮化二氧化硅粒子；上述反应过程如下所示
式中，X为溴(Br)或氯(Cl)，R为亚甲基
二氧化硅球
氯甲基化二氧化硅球
叠氮化二氧化硅球其中，所述溶剂A为苯或甲苯；所述含有叠氮化钠的溶液中的溶剂为N，N-二甲基 甲酰胺或者四氢呋喃；叠氮化二氧化硅粒子的叠氮化程度即接枝率可以通过氯甲基化的时 间和反应温度来控制；其接枝率可以通过元素分析来表征；(3)按摩尔比，n(叠氮化二氧化硅粒子)n(聚双丙酮-D-半乳糖苯乙 烯)n(CuS04) η(NaVc) = 100 (102 110) 1 3，依次加入聚双丙酮-D-半乳糖 苯乙烯，叠氮化二氧化硅粒子，充分溶解和分散在溶剂B中，再加入抗坏血酸钠和无水硫酸 铜的水溶液，搅拌条件下，于45 75°C下进行炔基和叠氮的点击化学(Click Chemistry) 反应，反应12 18h得到手性链修饰的二氧化硅粒子，所述手性聚合物链修饰的二氧化硅 粒子即键合型手性固定相；上述反应过程如下所示
N，N-二甲基甲酰胺 硫酸铜，抗坏血酸钠，水
T-HwS
CX-Br, Cl)
键合型手性固定相
手性聚合物链其中，所述溶剂B为N，N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃。上述技术方案中，步骤(1)中，调整原子转移自由基聚合反应的时间可以调整手 性聚合物链的分子量，从而改变手性杂化粒子的拆分性能；并且所得手性聚合物链的分子 量分布PDI值保持在较低水平。步骤⑵中，采用史托伯(St6ber)法所得的二氧化硅粒子的粒径为100 5000nm，可以通过选择不同粒径的二氧化硅粒子改变最终手性固定相的粒径。步骤(3)中，采用“Click”反应将叠氮化二氧化硅粒子与手性聚合物链聚双丙 酮-D-半乳糖苯乙烯键合，反应操作简单，条件温和，对氧、水不敏感；快速，高通量合成；产 物收率高、选择性好；产物易纯化、后处理简单甚至不需要专门的分离提纯。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点1.由于采用ATRP法，聚合物的分子量可以很方便地设计，从而可以寻找最佳拆分 聚合物的链长；2.由于在二氧化硅粒子表面修饰过程中，选用“click”反应，反应操作简单、效率 高、副反应少，便于大规模生产；
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3.现有商品化的手性固定相无法很好地拆分外消旋的酒石酸、扁桃酸、3-氨 基-1，2-丙二醇和阿拉伯糖，本发明所得手性固定相可以很好地拆分外消旋的酒石酸、扁 桃酸、3-氨基-1，2-丙二醇和阿拉伯糖。
图IA为实施例四所得粒径为108nm 二氧化硅粒子；图IB为实施例四中聚合物(Mn,erc = 10050g/mol, PDI = 1. 18.)修饰后的二氧化 硅粒子的TEM图，标尺为IOOnm ；图IC为实施例四中聚合物(Mn,erc = 10050g/mol, PDI = 1. 18.)修饰后的二氧化 硅粒子的TEM图，标尺为200nm ；图2为实施例六中不同链长聚合物修饰所得杂化粒子对外消旋物质拆分；图3为实施例七中聚合物(Mn,erc = 10050g/mol,PDI = 1. 18.)修饰所得的杂化粒 子对酒石酸重复拆分；图4为实施例八中HPLC的手性拆分效果图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述所用的化学试剂D，L-阿拉伯糖，97% ；3-氨基-I，2_丙二醇，98%，Alfa Aesar 公司；五甲基二乙烯三胺(PMEDTA)98%，Sigma Aldrich公司；D，L-扁桃酸，L-(+)-扁桃酸， D-(-)-扁桃酸，98 % ；D, L-酒石酸，D-(-)-酒石酸，L- (+)-酒石酸，97 % ；溴化亚铜(CuBr)， 分析纯；对氯甲基苯乙烯，90% ；N-甲酰二甲胺，分析纯，中国医药(集团)上海化学试剂 公司四氢呋喃和乙醇，分析纯，常熟市杨园化学试剂有限公司；对双丙酮-D-半乳糖(PG)， 98%, Sigma Aldrich公司；氯甲基苯乙烯，90%，Sigma Aldrich公司；引发剂α-溴异丁 酸丁炔酯(BEiB)，自己合成；单体对双丙酮-D-半乳糖苯乙烯(VBPG)，自己合成；二氧化 硅粒子球，自己合成；乙醇，色谱纯，中国医药(集团)上海化学试剂公司。实施例一对双丙酮-D-半乳糖苯乙烯(VBPG)的合成把2. 36g对氯甲基苯乙烯滴入12g NaOH与0. 3g四丁基溴化胺的混合水溶液中 (30mL)，室温下搅拌数分钟；对双丙酮-D-半乳糖(PG)2. 89g溶解于30mL四氢呋喃中，缓慢 滴入上述混合水溶液，室温搅拌，反应24h。反应完成后，用三氯甲烷及蒸馏水洗涤该反应 液直至溶液呈中性，粗产物在三氯甲烷中为黄色液体，接着用层析柱提纯(硅胶柱，石油醚 /乙酸乙酯=8/1 (体积比))。最终产物VBPG为白色雪花状固体，产率46%。实施例二 α -溴异丁酸丁炔酯(BEiB)0°C下，103g，0.45mol溴代异丁酰溴的无水乙酸乙酯溶液200mL，滴加到含有 37. Ig (0. 53mol)正丁炔醇和43g(0. 53mol)吡啶的150mL乙酸乙酯溶液中，搅拌反应2h后， 再在室温下反应过夜。反应结束后分别用水、碳酸氢钠的盐酸溶液和饱和食盐水分别洗两 遍，干燥，蒸馏，得到70. Og α-溴异丁酸丁炔酯。实施例三以BEiB为引发剂的功能性P(VBPG)手性链的合成按配比η (VBPG) η (BEiB) η (CuBr) η (PMDETA) = 75 1 1 3。依次加 入CuBr，PMDETA, BEiB, VBPG以及甲苯(5mL)于IOmL的安瓿瓶中，通氩气10分钟后封管。将封管后的安瓿瓶置于恒定温度(75°C )下的油浴中按预定的时间进行反应(6 18d)。反 应结束后，取出封管，立即用冷水冷却，打开封管，用适量石油醚中沉淀、干燥即得到手性聚 合物。采用双官能团引发剂(BEiB)、VBPG为单体，在不同聚合时间下合成手性聚合链 的数据如表1所示。由表中数据可以看出，采用溶液聚合得到的手性聚合物分子量随聚合 时间呈线性增长，并且所有聚合物的分子量分布(PDI)值均保持在较低的水平(M^Mn = 1. 10 1. 26)。表1.通过ATRP法合成不同分子量的含炔基手性P (VBPG)链序号反应时间(h)单体转化率(％ )Mn(th)Mn(GPc) PDI
PVBPG-I6X242568906700 1.10
PVBPG-212X24431186010050 1.18
PVBPG-318X24641759015310 1.26
注聚合条件=VBPG = 0. 6g；甲苯=ImL ;[VBPG] [BEiB] [CuBr][
=75 1 1 3 ;Τ = 75°C。 实施例四含叠氮基的二氧化硅粒子的合成 (1)、采用StOber法合成SiO2纳米粒子250mL无水乙醇中加入15mL氨水 (28wt%)，强力搅拌下，滴加IOmL四乙氧基硅烷，30°C下反应(24 30h)得到白色的乳液。 离心后得到白色SiO2纳米粒子，分别在乙醇、丙酮和乙醚中洗涤得以纯化物，如图I(A)所
示，干燥备用。(2)、取2. 5g上述得到108nm的SiO2纳米粒子分散在40mL甲苯中，通氩气30min， 加入0. 3g氯甲基化硅烷偶联剂，(90 105°C )反应(16 21h)，离心的固体分别用甲苯、 丙酮和乙醚洗涤两次，烘干得到氯甲基化的SiO2纳米粒子(SiO2-Cl)，备用。(3)、取2g SiO2-Cl分散在含有0.8g叠氮化钠的IOOmL的DMF溶液中(75 95°C) 反应(18 24h)，离心的固体分别用DMF、水和乙醚洗涤，干燥得到叠氮化的二氧化硅粒子 (SiO2-N3)。采用相同的氯甲基和叠氮化试剂和实验方法，使用粒径为5μπι的二氧化硅粒子， 同样可以得到粒径为5 μ m的叠氮化二氧化硅粒子。实施例五“click”反应合成杂化手性粒子(手性固定相)按配比η (SiO2-N3) η (P (VBPG)) η (CuSO4) η (NaVc) = 100 (102 110) 1 3，依次加入P (VBPG) ,SiO2-N3，充分溶解和分散在DMF中，再加入抗坏血酸钠和 无水硫酸铜的水溶液，(45 75°C )下搅拌反应(12 18h)反应得到的手性链修饰的二氧 化硅球(手性固定相)如图1 (B和C)所示。采用IOSnm叠氮化的二氧化硅粒子，使用不同聚合度带炔基手性聚合物，得到不 同聚合物修饰的杂化手性粒子。5 μ m的手性杂化粒子球的合成步骤同上。实施例六手性拆分为了验证上述实施例合成的有机/无机手性杂化粒子(实施例三所得手性固定 相)对拆分的有效性，首先分别用三种不同聚合度聚合物修饰过IOSnm的手性杂化粒子在 乙醇溶剂，分别对外消旋的酒石酸、扁桃酸、3-氨基-1，2-丙二醇和阿拉伯糖进行手性拆分(拆分条件外消旋在乙醇溶液中浓度为lmg/mL ；外消旋和杂化粒子的质量比为lg/20g ； 拆分温度为20°C)。该粒子在乙醇溶液中，表现出良好的分散性能。对拆分液乙醇溶液进 行旋光测试，得到结果如图2所示。可看出该手性杂化粒子对所选定的外削旋物质都有较 好的手性拆分能力。实施例七手性杂化粒子的重复拆分为考察该手性杂化纳米粒子(实施例三所得手性固定相)重复拆分使用的次数和 效率。分别在溶解了 20mg酒石酸的20mL乙醇和四氢呋喃溶液中加入400mg的杂化纳米粒 子球(Mn,ere = 10050g/mol,Mw/Mn = 1. 18)，在反应7. 5h，静置取得溶液测其旋光度；收集杂 化粒子用乙醇溶液反复超声洗涤后，真空烘箱烘干进行下次拆分(拆分条件外消旋在乙 醇溶液中浓度为lmg/mL ；外消旋和杂化粒子的质量比为1/20 ；拆分温度为20°C )。由图3结果可看出以四氢呋喃为溶剂时拆分后的旋光度为-13° (光学纯L-型 酒石酸在四氢呋喃中旋光度为-14° )；以乙醇为拆分溶剂拆分后的旋光度为-11° (光学 纯L-型酒石酸在四氢呋喃中旋光度为-12° )。从实验结果还可看出在首次拆分后，重复 拆分时拆分效能能够保持在比较高的拆分效率，且稳定性较好。实施例八HPLC的手性拆分将合成的5 μ m的手性杂化粒子(实施例三所得手性固定相)填充到HPLC柱子 中(150mmX4. 6mm，5ym)作为手性固定相，以正己烷/异丙醇/甲酸(85 15 0.1， 体积比)为流动相，在PH = 4.5时，选用扁桃酸的外消旋体进行拆分试验(拆分条 件柱子(150mmX4.6mm，5ym，苏州赛分科技填装)，流动相正己烷/异丙醇/甲酸 (85 15 0.1，体积比)，流速=0.5111171^11，紫外检测灯波长=2301111^ = 20°0。结果 如图4所示，通过改手性相可以达到很好的分离效果。
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权利要求
一种键合型手性固定相的制备方法，包括合成手性聚合物链，制备二氧化硅载体以及将手性聚合物链键合到二氧化硅载体上，其特征在于，包括以下步骤(1)合成手性聚合物链以对双丙酮 D 半乳糖苯乙烯作为单体，以含炔基的有机卤化物为引发剂，采用原子转移自由基聚合反应合成含炔基的手性聚合物链聚双丙酮 D 半乳糖苯乙烯；(2)制备二氧化硅载体采用史托伯法合成二氧化硅粒子，通过氯甲基化硅烷偶联剂进行氯甲基化得到氯甲基化的二氧化硅粒子，然后与叠氮化钠反应得到叠氮化二氧化硅粒子；(3)将步骤(1)制备的含炔基的手性聚合物链与步骤(2)所得叠氮化二氧化硅粒子通过点击化学反应键合将步骤(1)制备的手性聚合物链与步骤(2)所得叠氮化二氧化硅粒子充分溶解和分散在溶剂中，再加入抗坏血酸钠和无水硫酸铜的水溶液，反应得到手性聚合物链修饰的二氧化硅粒子，所述手性聚合物链修饰的二氧化硅粒子即键合型手性固定相。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体包括以下步骤以对双 丙酮-D-半乳糖苯乙烯作为单体，以含炔基的有机卤化物为引发剂，按摩尔比，单体引发 剂催化剂=20 200 1 0.1 1，将单体、引发剂、催化剂和配位剂加入溶剂中，在 惰性气氛下，于70 100°C下，进行铜盐催化的原子转移自由基聚合反应合成含炔基的手 性聚合物链聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯，所得含炔基的手性聚合物链聚双丙酮-D-半乳糖 苯乙烯的聚合度为20 200 ；合成手性聚合物链聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯的结构通式如 下=20 200 ；其中，所述引发剂选自α-溴异丁酸丙炔酯、α-溴异丁酸丁炔酯和α-溴异丁酸甲基 丁炔酯中的一种；所述催化剂选自溴化亚铜或者氯化亚铜中的一种；所述配位剂选自2， 2' -二联吡啶或者五甲基二乙烯基三胺中的一种；所述溶剂选自甲苯、四氢呋喃或者苯 甲醚中的一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)具体包括以下步骤按照现 有技术，采用史托伯法合成粒径为100 5000nm的二氧化硅粒子，然后将二氧化硅粒子分 散在溶剂A中，在惰性气氛中，加入氯甲基化硅烷偶联剂，90 105°C反应10 21h，得到 氯甲基化的二氧化硅粒子；然后将氯甲基化的二氧化硅分散在含有叠氮化钠的溶液中，于式中，X为溴或氯，R为-CH2-、-CH2CH2-或-C (CH3) 2_，聚合度η75 95°C反应18 24h，得到叠氮化二氧化硅粒子；其中，所述溶剂A为苯或甲苯；所述含有叠氮化钠的溶液中的溶剂为N，N- 二甲基甲酰 胺或者四氢呋喃。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)具体包括以下步骤按摩尔 比，η(叠氮化二氧化硅粒子)η(聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯)Ii(CuSO4) η(NaVc) =100 (102 110) 1 3，依次加入聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯，叠氮化二氧化硅粒 子，充分溶解和分散在溶剂B中，再加入抗坏血酸钠和无水硫酸铜的水溶液，搅拌条件下， 于45 75°C下进行炔基和叠氮的点击化学反应，反应12 18h得到手性链修饰的二氧化 硅粒子，所述手性聚合物链修饰的二氧化硅粒子即键合型手性固定相； 其中，所述溶剂B为N，N- 二甲基甲酰胺或四氢呋喃。
全文摘要
本发明属于手性固定相领域，具体涉及一种适用于高效液相色谱的以二氧化硅为载体的多糖类手性固定相的制备方法，具体包括以下步骤(1)合成手性聚合物链以对双丙酮-D-半乳糖苯乙烯)作为单体，原子转移自由基聚合反应合成手性聚合物链聚双丙酮-D-半乳糖苯乙烯；(2)制备二氧化硅载体采用史托伯法合成二氧化硅粒子，通过氯甲基化硅烷偶联剂进行氯甲基化得到氯甲基化的二氧化硅粒子，然后与叠氮化钠反应得到叠氮化二氧化硅粒子；(3)将步骤(1)制备的手性聚合物链与步骤(2)所得叠氮化二氧化硅粒子通过点击化学反应，形成共价键连接而键合，得到键合型手性固定相。本发明可以设计不同分子量的手性聚合物链，不同粒径的二氧化硅粒子，从而得到不同性能的手性固定相。
文档编号B01J20/29GK101912772SQ20101025686
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月19日 优先权日2010年8月19日
发明者周年琛, 张丽芬, 张正彪, 朱秀林, 程振平, 许文亮 申请人:苏州大学