一种酶法制备1,3-氧硫杂戊烷手性中间体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于制药工程领域，特别涉及一种酶法制备1，3_氧硫杂戊烷手性中间体的 合成方法。
【背景技术】
[0002] 拉米夫定，化学名为（2R)-羟甲基_(5S)_(胞嘧啶-V-基)-1，3_氧硫杂环戊烷，是 由加拿大Biochem Pharma公司开发的核苷类抗病毒药物，目前是用于治疗HIV、慢性乙型 肝炎、失代偿期肝硬化的一线药物，国内年销售额达数亿元。目前，大部分拉米夫定靠进口， 由于专利已经到期，国内生产增速较快。用化学法制取手性拉米夫定的路线较多，但是存 在着手性原料价格贵、部分原料毒性腐蚀性大、反应路线长、收率不高等缺点。
[0003] 以L -薄荷醇乙醛酸酯一水合物为手性源，直接与2，5 -二羟基-1，4-二噻烷反应，经过不对称合成而得拉米夫定，这是目前最经济实用，也是实现工业生产 最为常用的经典方法。该方法中，（2R，5S)-5-羟基-1，3-氧硫杂环戊烷-2-羧酸-L-薄荷 基酯，经过氯化亚砜氯代后，与胞嘧啶的硅醚化物反应制得(2R，5S)-5-(胞嘧啶-V-基)-1，3-氧硫杂环戊烷-2-羧酸-L-薄荷基酯，后经硼氢化钠还原，经水杨酸成盐，然后用三乙 胺碱化游离纯化，得到拉米夫定。然而，该路线中使用了毒性大腐蚀性强的氯化亚砜，反应 路线长，总收率低。
[0004] 采用化学法生产拉米夫定或者中间体的中国专利申请包括201210231945.5、 201210233212.5、201010275302.1、201010270061.1、201010187105.4、201310627166.1、 201010273165.8、200910043203.8,相比上述的经典方法，均有较多改进，但是，在环境友 好、反应总收率、反应路线长、有毒、腐蚀原料试剂等方面，还有较多改进空间。
[0005] 采用化学-酶法生产拉米夫定是改进的重要方向之一。采用化学-酶法制取拉米夫 定，充分发挥酶手性催化的优势，得到反应条件温和、环境友好、收率较高、适合工业化生产 的合成路线，对有效降低拉米夫定生产成本、大幅度降低价格、造福广大患者具有重要意 义。
[0006] 本发明将采用酶法动态共价动力学拆分工艺，理论产率为100%，远优于传统的动 力学拆分。具体的，本发明将采用蛋白酶催化合成拉米夫定新工艺的关键手性中间体(1)。
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【发明内容】
[0008] 2R-苯甲酰氧甲基-5S-乙酰氧基-1，3-氧硫杂戊烷(I)是合成拉米夫定新工艺的关 键手性中间体，本发明采用酶催化一锅法合成I (国家自然科学基金资助项目，项目批准号： 21546004)。酶-化学法制备拉米夫定的新工艺只需3步，第一步得到中间体I，再经过親合、 脱保护反应得拉米夫定。新工艺步骤大大简化，操作简单、易控，总收率大于46%。此合成拉 米夫定新工艺优于现有的工艺。其中的酶法是关键一步，即酶法合成关键手性中间体I:
用1，4_二噻烷-2,5-二醇（Π )与苯甲酰氧乙醛（ΙΠ )反应，反应介质为四氢呋喃(THF)、 乙酸乙酯，或者四氢呋喃与乙酸乙酯的混合物。用固定化蛋白酶催化反应，酶的使用量为 300-600U/mL，使用带夹套搅拌反应釜，加入反应介质，等摩尔加入底物Π 和ΙΠ ，反应液中浓 度为0.04-0.2 111〇1/1，用三乙胺调节?!1，？!1为9-11，反应温度30-50°(3，加入固定化酶2，开始 反应。采用流加操作，反应1-2小时后，开始流加操作，等摩尔流加2和3，流加量为0 . Οδ-Ο. 2mol/h L ， 反应时间 10-28小时 。产率 92-98 % ， 对映体过量率 ee值为 95-99 % 。 滤出 固定化 酶，蒸出有机溶剂，得到产品。固定化酶可以重复使用10次以上。显然，本工艺采用的是动态 共价动力学拆分工艺，理论产率为100%，远优于传统的动力学拆分。
[0009]
[0010] 所用的酶为蛋白酶，特别是碱性蛋白酶，例如来自地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、 短小芽孢杆菌的蛋白酶。这些酶可以在市场上购买，也可以自行生产，均可催化本发明的反 应。本发明用上述3种酶进行了实验。其中地衣芽孢杆菌蛋白酶为自行生产。本发明筛选出 一株地衣芽孢杆菌，命名为QDKD-23，将其发酵，得到地衣芽孢杆菌蛋白酶，用双水相分离纯 化2次，然后，进行固定化。所用固定化载体为硅藻土，用吸附法进行固定化，得到固定化地 衣芽孢杆菌蛋白酶，简称固定化酶2，酶活为7-9 X 104U/g。反应温度为30-50°C，pH为9-11。 反应10次后，剩余酶活>80 %。
[0011] 同时，本发明也用市场上购买的地衣芽孢杆菌蛋白酶、短小芽孢杆菌蛋白酶，并采 用固定化酶2的固定化方法得到相应的固定化酶后，进行了催化反应，均可得到手性中间体 I，反应条件与固定化酶2相似，所以不再赘述。
[0012] 实施例1 用1，4_二噻烷_2,5_二醇（Π )与苯甲酰氧乙醛（ΙΠ )反应，反应介质为四氢呋喃(THF，用 固定化地衣芽孢杆菌蛋白酶(BL)，即固定化酶2催化反应，固定化酶2的生产见说明书。酶的 使用浓度为300U/mL，使用0 . lm3带夹套搅拌反应釜，加入反应介质，等摩尔加入底物Π 和 ΙΠ ，反应液中浓度为0.04 mol/L，用三乙胺调节pH，pH为9，反应温度30°C，加入固定化酶2， 开始反应。采用流加操作，反应2小时后，开始流加操作，等摩尔流加 π和m，流加量为 0.05mol/h L，反应时间20小时。滤出固定化酶，蒸出有机溶剂，得到产品，固定化酶可以重 复使用。产率94%，对映体过量率ee值为99%。
[0013] 实施例2 用1，4-二噻烷-2，5-二醇（Π )与苯甲酰氧乙醛（ΙΠ )反应，反应介质为乙酸乙酯，用固定 化酶2催化反应。酶的使用浓度为600U/mL，使用lm3带夹套搅拌反应釜，加入反应介质，等摩 尔加入底物Π 和ΙΠ ，反应液中浓度为0.15 mol/L，用三乙胺调节pH，pH为11，反应温度45°C， 加入固定化酶2,开始反应。采用流加操作，反应1小时后，开始流加操作，等摩尔流加 Π 和 ΙΠ ，流加量为0.2mo 1/h L，反应时间28小时。滤出固定化酶，蒸出有机溶剂，得到产品，固定 化酶可以重复使用。产率98%，对映体过量率ee值为97%。
[0014] 实施例3 用1，4_二噻烷-2,5-二醇（Π )与苯甲酰氧乙醛（ΙΠ )反应，反应介质为四氢呋喃与乙酸 乙酯的混合物（1: 〇 . 3)。用固定化酶2催化反应。酶的使用浓度为500U/mL，使用10m3带夹套 搅拌反应釜，加入反应介质，等摩尔加入底物Π 和ΙΠ ，反应液中浓度为0.1 mol/L，用三乙胺 调节pH，pH为10.5，反应温度45°C，加入固定化酶2，开始反应。采用流加操作，反应1小时后， 开始流加操作，等摩尔流加 Π 和ΙΠ ，流加量为0.15mol/h L，反应时间14小时。滤出固定化 酶，蒸出有机溶剂，得到产品，固定化酶可以重复使用。产率97 %，对映体过量率ee值为 98% 〇
[0015] 实施例4 用1，4_二噻烷-2,5-二醇（Π )与苯甲酰氧乙醛（ΙΠ )反应，反应介质为四氢呋喃与乙酸 乙酯的混合物（1: 〇 .