专利名称：：一种脂肪酶键合固定相及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种脂肪酶键合固定相及其制备方法和用途，属于色谱固定相制备领域。技术背景用固定化酶作为液相色谱固定相拆分对映体早有文献报道。1988年，Wainer等人提出了用固定化糜蛋白酶作为液相色谱的固定相来拆分手性物质。拆分了很多氨基酸、氨基酸的衍生物及二肽。1989年，他们用同样的方法合成了固定化胰蛋白酶拆分了大量O-衍生化的外消旋氨基酸。1989年，Kalbe等人固定化了糜蛋白酶和胰蛋白酶，拆分了大量芳香族和脂肪族的氨基酸酯。1992年，Marl等人合成了4种固定化糜蛋白酶，拆分了大量的对映体。2001年G,Fe'lk等人固定化了青霉素酶，他们在制得的固定相分离了大量的手性羧酸，并且该固定相作为在线反应器对某些酯也具有不对称水解效果。到目前为止，还未有人报道将固定化脂肪酶作为液相色谱固定相用于拆分对映体。
发明内容本发明的目的是提供一种脂肪酶键合固定相及其制备方法和用途，以提高酶在载体表面的键合量，保留酶的活性，提高柱效。为实现上述目的，本发明的技术方案为一种脂肪酶键合固定相，其特征在于，该固定相由表面带有醛基的球形硅胶填料与脂肪酶的氨基以亚胺键直接键合，而后把亚胺还原为氨基制得。所述固定相制备方法的具体步骤为1)环氧基硅胶的制备在100mL三口瓶中加入3.0g球形硅胶和50mL10。/o的盐酸溶液，加热回流1214h后，停止加热，抽滤，用蒸馏水洗涤至中性，60°C真空干燥12h，将干燥好的硅胶置于100mL三口瓶中，然后加入58mL3-縮水甘油丙氧基三甲氧基硅烷和50mL无水甲苯，氮气保护下于11(TC回流搅拌反应12~14h，然后停止加热，抽滤，依次用甲苯，甲醇，丙酮和正己垸洗净，60°C真空干燥12h;2)二醇基硅胶的制备将上述步骤l)中制备的环氧基硅胶置于500mL三口瓶中，然后加入300mL、pH-34的硫酸溶液回流搅拌反应1.5h，然后停止加热，抽滤，用蒸馏水洗涤至中性，室温下真空干燥12h;3)醛基硅胶的制备将上述步骤2)中制备的二醇基硅胶置于100mL三口瓶中，然后加入60mL90n/。的醋酸水溶液和23g高碘酸钠搅拌反应2h，抽滤，用蒸馏水洗净；4)脂肪酶键合固定相的制备称取南极假丝酵母脂肪酶B150~600mg，置于250mL三口瓶中，加入100mL、pI^56的0.1mol/L醋酸盐缓冲液，搅拌溶解，加入上述步骤3)中制备的醛基硅胶3g和75mg氰基硼氢化钠，于04'C搅拌反应3~5天，抽滤，用pI^8的0.1mol/L磷酸盐缓冲液洗净；所得固定相在100mLp1^8的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，在23h内分3次共加入硼氢化钠75mg,每次25mg，以还原硅胶表面剩余的醛基，抽滤，用pH-8的0.1mol/L磷酸盐缓冲液洗净，得到所需脂肪酶键合固定相。所述球形硅胶的粒径为530微米，孔径为2004000埃。所述球形硅胶由日本富士公司购得；所述南极假丝酵母脂肪酶B由荷兰Chiralvision公司购得。所述脂肪酶键合固定相用作手性色谱柱及在线液相色谱反应器填料。所述脂肪酶键合固定相用作手性色谱柱填料，分离手性化合物。所述脂肪酶键合固定相用作手性色谱柱填料，分离l-萘乙醇、2-萘乙醇、1-萘丙醇、2-萘丙醇或烯唑醇。所述脂肪酶键合固定相用作在线液相色谱反应器填料，催化手性仲醇酯和3-氯-l-(2-噻吩)丙醇丁酸酯的不对称水解。本发明的优点1)该脂肪酶键合固定相具有很高的手性识别能力，装填有这种固定相的色谱柱，既可以用做手性色谱柱，又可以用做在线液相色谱反应器；2)该脂肪酶键合固定相的化学性质相当稳定，三个月之内都可以保持相当高的活性；3)该脂肪酶键合固定相的制备成本相对较低，不论是装填分析柱还是制备柱都有很好的应用前景。图1为l-萘乙醇的拆分谱图；图2为2-萘乙醇的拆分谱图；图3为l-萘丙醇的拆分谱图；图4为2-萘丙醇的拆分谱图；图5为烯唑醇的拆分谱图；图6为2-萘乙醇乙酯的不对称水解谱图；图7为2-萘乙醇丙酯的不对称水解谱图；图8为4-甲氧基苯乙醇丙酯的不对称水解谱图；图9为4-甲基苯乙醇丙酯的不对称水解谱图；图10为3-氯-l-(2-噻吩)丙醇丁酯的不对称水解谱图。具体实施方式以下实施例用于解释本发明，但是这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。实施例l:环氧基硅胶的制备在100mL三口瓶中加入3.0克球形硅胶(粒径5微米，孔径300埃，曰本富士公司)和50mL10。/。的盐酸溶液，加热回流12h，然后停止加热，抽滤，用蒸馏水洗漆至中性，6(TC真空干燥12h。将干燥好的硅胶置于100mL三口瓶中，然后加入5mL3-縮水甘油丙氧基三甲氧基硅烷和50mL无水甲苯，氮气保护下于ll(TC回流搅拌反应12h，然后停止加热，抽滤，依次用甲苯，甲醇，丙酮和正己烷洗净，6(TC真空干燥12h。实施例2:二醇基硅胶的制备将上述环氧基硅胶置于500mL三口瓶中，然后加入300mLpH=3的硫酸溶液回流搅拌反应1.5h，然后停止加热，抽滤，用蒸馏水洗涤至中性，室温下真空干燥12h。实施例3:醛基硅胶的制备将上述二醇基硅胶置于100mL三口瓶中，然后加入60mL90%的醋酸水溶液和3g高碘酸钠搅拌反应2h，抽滤，用蒸馏水洗净。实施例4:脂肪酶键合固定相的制备称取南极假丝酵母脂肪酶B300mg(荷兰Chiralvision公司)，置于250mL三口瓶中，加入100mLpH^6的0.1mol/L醋酸盐缓冲液，搅拌溶解，加入上述实施例3中制备的醛基硅胶3g和75mg氰基硼氢化钠，于24。C搅拌反应3天，抽滤，用pI^8的0.1mol/L磷酸盐缓冲液洗净；所得固定相在100mLpH=8的O.lmol/L磷酸盐缓冲液中，在2h内分3次共加入硼氢化钠75mg，每次25mg，以还原硅胶表面剩余的醛基，抽滤，用pH=8的O.lmol/L磷酸盐缓冲液洗净，得到所需固定相。实施例5:色谱柱装填上述固定相以pH=8的O.lmol/L磷酸盐缓冲液为匀浆液，在4000psi压力下装入不锈钢柱(250mmx4.6mm)中。实施例6:对手性仲醇的分离装填有上述固定相的色谱柱可以作为手性色谱柱来使用，可以拆分多种手性化合物。图1-图5为手性仲醇的拆分色谱图。色谱实验数据列于表1中。表1拆分部分手性仲醇的色谱实验数据样品名禾尔K！(X流动相流速1-萘乙醇0.321.50A0.5mlVmin2-萘乙醇0.371.21A0.5mL/min1-萘丙醇1.471.38Blmlv/min2-萘丙醇1.471.20BlmL/min烯唑醇2.131.52AlmL/min流动相A:pH=8的O.lmol/L磷酸盐缓冲液:乙腈100/5流动相B:pH=8的O.lmol/L磷酸盐缓冲液检测波长230nm^为保留因子；a为选择性因子实施例7:对手性仲醇酯的不对称水解装填有上述固定相的色谱柱又可以作为在线液相色谱反应器来使用，并且同时具备了酶催化的高立体选择性与色谱分离的高效性。因此，当把消旋的底物进样到此色谱系统中，在一次色谱过程中就可以得到某一种绝对构型的催化产物和另一种绝对构型的未反应的底物，并且产物与底物在此过程中还会被分离开。图6、图7、图8和图9是几种手性仲醇酯的不对称水解色谱图。其中，每个图的第一个色谱峰为水解产物一醇的峰，第二个峰为未水解的底物一酯的峰。色谱实验数据列于表2中。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>流动相pH=8的0.1mol/L磷酸盐缓冲液:乙腈100/5流速lm!7min检测波长230nm实施例8:3-氯-1-(2-噻吩)丙醇丁酸酯的不对称水解抗抑郁药物度洛西汀的中间体,3-氯-1-(2-噻吩)丙醇的丁酸酯也可以在此固定相上被不对称水解，转化率和光学纯度都很高。图10是3-氯-l-(2-噻吩两醇的丁酸酯的不对称水解色谱图。其中，第一个色谱峰为水解产物-醇的峰，第二个峰为未水解的底物一酯的峰，醇的绝对构型为R，ee值>99%。权利要求1.一种脂肪酶键合固定相，其特征在于，该固定相由表面带有醛基的球形硅胶填料与脂肪酶的氨基以亚胺键直接键合，而后把亚胺还原为氨基制得。2.权利要求1所述的脂肪酶键合固定相的制备方法，其特征在于，所述方法具体步骤为1)环氧基硅胶的制备在100mL三口瓶中加入3.0g球形硅胶和50mL10。/。的盐酸溶液，加热回流1214h后，停止加热，抽滤，用蒸馏水洗涤至中性，60°C真空干燥12h，将干燥好的硅胶置于100mL三口瓶中，然后加入58mL3-縮水甘油丙氧基三甲氧基硅烷和50mL无水甲苯，氮气保护下于11(TC回流搅拌反应12~14h，然后停止加热，抽滤，依次用甲苯，甲醇，丙酮和正己垸洗净，60°C真空干燥12h;2)二醇基硅胶的制备将上述步骤l)中制备的环氧基硅胶置于500mL三口瓶中，然后加入300mL、pP^34的硫酸溶液回流搅拌反应1.5h，然后停止加热，抽滤，用蒸馏水洗涤至中性，室温下真空干燥12h;3)醛基硅胶的制备将上述步骤2)中制备的二醇基硅胶置于100mL三口瓶中，然后加入60mL90e/。的醋酸水溶液和23g高碘酸钠搅拌反应2h，抽滤，用蒸馏水洗净；4)脂肪酶键合固定相的制备称取南极假丝酵母脂肪酶B150~600mg，置于250mL三口瓶中，加入100mL、pH-56的0.1mol/L醋酸盐缓冲液，搅拌溶解，加入上述步骤3)中制备的醛基硅胶3g和75mg氰基硼氢化钠，于04。C搅拌反应35天，抽滤，用pH-8的0.1mol/L磷酸盐缓冲液洗净；所得固定相在100mLpH二8的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，在23h内分3次共加入硼氢化钠75mg，每次25mg，以还原硅胶表面剩余的醛基，抽滤，用pH-8的0.1mol/L磷酸盐缓冲液洗净，得到所需脂肪酶键合固定相。3.根据权利要求2所述的脂肪酶键合固定相的制备方法，其特征在于，所述球形硅胶的粒径为530微米，孔径为2004000埃。4.根据权利要求2所述的脂肪酶键合固定相的制备方法，其特征在于，所述球形硅胶由日本富士公司购得；所述南极假丝酵母脂肪酶B由荷兰Chiralvision公司购得。5.权利要求l所述的脂肪酶键合固定相的用途，用作手性色谱柱及在线液相色谱反应器填料。6.根据权利要求5所述的脂肪酶键合固定相的用途，其特征在于，所述脂肪酶键合固定相用作手性色谱柱填料，分离手性化合物。7.根据权利要求5所述的脂肪酶键合固定相的用途，其特征在于，所述脂肪酶键合固定相用作手性色谱柱填料，分离l-萘乙醇、2-萘乙醇、l-萘丙醇、2-萘丙醇或烯唑醇。8.根据权利要求5所述的脂肪酶键合固定相的用途，其特征在于，所述脂肪酶键合固定相用作在线液相色谱反应器填料，催化手性仲醇酯和3-氯-l-(2-噻吩)丙醇丁酸酯的不对称水解。全文摘要本发明公开了色谱固定相制备领域一种脂肪酶键合固定相及其制备方法和用途。该固定相由表面带有醛基的球形硅胶填料与脂肪酶的氨基以亚胺键直接键合，而后把亚胺还原为氨基制得。该固定相具有很高的手性识别能力，既可以用作手性色谱柱的填料，又可以用做在线液相色谱反应器的填料；化学稳定性好，三个月之内都可以保持相当高的活性；制备成本也相对较低，不论是装填分析柱还是制备柱都有很好的应用前景。文档编号B01J20/30GK101574646SQ200910086839公开日2009年11月11日申请日期2009年6月8日优先权日2009年6月8日发明者吕春光,周志强,范鑫鑫,贺泽英申请人:中国农业大学