人胰高血糖素类似肽2（glp-2c）聚乙二醇化同源二聚体及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及人胰高血糖素类似肽2 (GLP-2C)聚乙二醇化同源二聚体的制备及用 途，属于生物技术及药物领域。
[0002]
【背景技术】
[0003]GLP-2(ghcagon_likep印tide2,GLP-2)是美国Lilly实验室在克隆胰高血糖素 原基因（proglucagon，PG)时发现并命名的。1996年，Drucker等发现胰高血糖素原衍生 肽（proglucagon,derivedpeptides,P⑶P)中促进肠粘膜生长的有效成分是GLP-2,其作 用强于其他已发现的生长因子且其促生长作用具有器官特异性（仅限于胃肠道）。
[0004] 人胰高血糖素类似肽2 (Glucagon-likepeptide-2,GLP-2)是人体肠道L型细胞 分泌的一种肠道激素，在体内具有促进肠上皮细胞增殖和小肠绒毛增生的作用。其含有33 个氨基酸，分子量为3900道尔顿。GLP-2在血液中存在的主要形式是GLP-2 (1-33)，也有 部分经二酰肽肽酶IV(DPPIV)水解氨基末端前2个氨基酸残基后形成的GLP-2 (3-33)，水 解后失去生物活性。
[0005] 天然的人GLP-2 (1-33)的氨基酸序列如下（SEQN0 :2): His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-A Ia-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp 天然的人GLP-2易被二酰肽肽酶IV(DPPIV)水解，在人体内的半衰期只有7分钟。为 达到延长其半衰期的目的，如GLP-2类似物的上市药品Teduglutide将其氨基酸序列第2 位的丙氨酸替换成甘氨酸（Gut2005;54:1224 - 1231)，可延长其体内半衰期至2小时。也 有文献报道将改构后的GLP-2类似物与其他蛋白相融合，达到进一步延长半衰期，减少给 药次数的目的（GLP2-2G-XTEN:APharmaceuticalProteinwithImprovedSerumHalf-Life andEfficacyinaRatCrohn'sDiseaseModel，SusanE.Alters)。该类改构蛋白或融合白 主要通过基因工程重组技术表达和制备而实现。
[0006] 在另外的公开文献和专利中报道GLP-2的PEG修饰的蛋白偶联物，主要偶联位点 位于Lys上的氨基或C末端的C00H上（US6284727,US9/561，226)，同样实现延长体内半衰 期的目的。
[0007]GLP-2或GLP-2类似物具有多重生物作用，主要包括：（1)刺激肠粘膜隐窝细胞的 增殖和抑制其凋亡，从而促进肠粘膜的生长及损伤后的再生修复；（2)GLP-2还可以抑制胃 酸的分泌和胃的运动；（3)增加肠道的血液供应；（4)提高肠道的屏障功能；（5)促进肠道 对营养物质的吸收等。因此，Teduglutide(商品名：Gattex)已被美国FDA批准作为治疗 短肠综合症和过敏性肠炎的多肽药物，相关的研究已成为该领域的热点。
[0008] 本发明提供了一种衍生于GLP-2的人胰高血糖素类似肽聚乙二醇化同源二聚体， 该同源二聚体通过位于C末端为半胱氨酸的巯基与双活化无甲氧基或羟基的聚乙二醇分 子两端活化基团共价而成。本发明人经研究发现，聚乙二醇同源二聚体形式的人胰高血糖 素（GLP-2)类似肽具有可显著延长其体内半衰期的作用，可作为一种新型治疗短肠综合征 或过敏性肠炎的长效药物或药物组合物。
[0009]
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种人胰高血糖素类似肽2 (GLP-2C)聚乙二醇化同源二聚 体，以及实现该聚乙二醇化同源二聚体的制备方法。
[0011] 本发明中人胰高血糖素类似肽2 (GLP-2C)的氨基酸序列具有以下特征，由34个 氨基酸组成。
[0012] 序列SEQNO:1 (GLP-2(l-33)的衍生物）： His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-A Ia-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Cys与天然GLP-2(SEQN0 :2)相比较， 本发明提供的人胰高血糖素类似肽2 (GLP-2C)序列SEQNO:1的特征是第2位的丙氨 酸由甘氨酸代替。
[0013] 本发明提供的人胰高血糖素类似肽2 (GLP-2C)序列SEQNO:1的另一特征是C末 端增加了一个半胱氨酸。
[0014] 本发明提供的人胰高血糖素类似肽2 (GLP-2C)序列SEQNO:1的另一特征是C末 端增加的半胱氨酸可以是酰胺化形式。
[0015] 本发明中人胰高血糖素类似肽2 (GLP-2C)除SEQNO:1的序列外，还包括由此经 一个或多个氨基酸替换、缺失或添加而成的衍生物，与SEQNO:2序列具有50%的同源性并 保留了促进小肠增长、增重和小肠绒毛增深作用的类似物。
[0016] 本发明的另一目的提供制备人胰高血糖素类似肽2 (GLP-2C)聚乙二醇化同源二 聚体的制备方法和实施过程。通过本发明中的GLP-2的C末端的半胱氨酸游离巯基在一定 反应条件下与双活化的聚乙二醇两端的活性基团化学偶联。聚乙二醇化同源二聚体，具以 下特征： (GLP-2C) -PEG- (GLP-2C)。
[0017] 双活化不含单甲氧基或羟基的聚乙二醇分子（PEG)包括：双活化的马来酸琥珀酰 亚胺PEG，表述为MAL-PEG-MAL;或包括双活化的巯基PEG，表述为SH-PEG-SH;或双活化的 乙烯砜PEG，表述为VS-PEG-VS;或双活化的邻二硫吡啶PEG，表述为0PSS-PEG-0PSS。
[0018] 用于本发明中人胰高血糖素类似肽2(GLP-2C)聚乙二醇化同源二聚体中的聚乙二 醇分子量范围从5000至40, 000道尔顿。通过分子量大于5000的PEG分子作为二聚体偶 联物可实现将人胰高血糖素类似肽2 (GLP-2C)同源二聚体在体内半衰期的显著延长。优 选的PEG分子量大小在20KD-40KD之间。
[0019] 本发明的另一目的是提供了用于制备人胰高血糖素类似肽2(GLP_2C)(SEQN0:1) 的化学固相合成或重组DNA技术的方法。重组DNA技术指应用表达载体插入编码人胰高血 糖素类似肽2 (GLP-2C)的cDNA基因片段后，转化宿主细胞。再经发酵或培养，纯化制备相 对应重组多肽的技术过程。
[0020] 本发明的另一目的，提供了分离和纯化人胰高血糖素类似肽2 (GLP-2C)聚乙二醇 化同源二聚体的方法，包括离子交换色谱、亲和色谱、疏水层析、反相层析色谱、分子排阻色 谱和超滤等技术手段。
[0021] 本发明的另一目的，提供了人胰高血糖素类似肽2 (GLP-2C)聚乙二醇化同源二聚 体的促进小肠增重和小肠绒毛增深的作用，可作为治疗短肠综合征或过敏性肠炎的长效药 物或药物组合物。
[0022] 作为一种药物组合物，它包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效 剂量的本发明所述的聚乙二醇化同源二聚体多肽。
[0023] 本发明中所用"同源二聚体"，是指通过共价结合键将氨基酸序列和组成完全相同 的人胰高血糖素类似肽2 (GLP-2C)通过C末端与一个分子的PEG两端共价结合而形成的 二聚体。
[0024] 本发明中所用"聚乙二醇偶联"，是指通过不同分子量的聚乙二醇在两端分别与人 胰高血糖素类似肽2 (GLP-2C)共价结合而成的聚乙二醇化偶联物。
[0025] 本发明中所用"宿主细胞"，是指大肠杆菌。
[0026] 本发明中所用"表达载体"，是指含有表达启动子包括T7、Tac、Trp、Iac的大肠杆 菌表达载体。
[0027] 至此已对本发明进行了项下的描述，通过参考下列实例，能够对本发明有更清晰 的理解。
[0028] 说明书【附图说明】： 附图I:GLP-2C、PEG40K-GLP-2C和（GLP-2C)-PEG35K- (GLP-2C)的RP-HPLC谱 图。图A为GLP-2C的RP-HPLC谱图，图B为PEG40K-GLP-2C的RP-HPLC谱图，图C为 (GLP-2C) -PEG35K- (GLP-2C)的RP-HPLC谱图。
[0029]附图 2 :GLP-2，GLP-2C，PEG40K- (GLP-2C)和（GLP-2C)-PEG35K- (GLP-2C)体外细 胞活性测定结果 附图3 :GLP-2C和（GLP-2C)-PEG35K- (GLP-2C)在大鼠体内的促进小肠增生的作用。 图A为促进小肠增重的数据，图B为促进小肠长长的数据。
[0030] 下述实例仅为说明目的而并不旨在对本发明的限制。
【具体实施方式】
[0031] 实例1、GLP-2C的化学固相合成 GLP-2C的氨基酸序列（SEQNO: 1)如下： His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-A Ia-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu