专利名称：一种用于生物靶细胞药物敏感性试验细胞的培养方法
技术领域：
本发明属于一种测定生物细胞反应性方法，具体涉及一种用于生物耙细胞药物 敏感性i微细胞的培养方法。
背景技术：
由于先天和后天因素，不同患者的细胞对药物的敏感性存在个体差异性，导致 不同药物用于不同患者后，其患者反应性不同，包括对耙细胞的增值抑制作用，细 胞毒作用，细胞因子分泌作用等，检测患者耙细IM不同药物的敏感性，可以为患 者筛选出有效的治疗药物，可以增加治疗疗效和减少副作用，防止无效治疗和对患 者身体和经济的损失，实现个体化治疗。可是目前市场上尚没有专门用于生物耙细 胞药物敏感性i，细胞的培养方法。
发明内容
本发明就是针对不同患者对药物敏感性不同的特点，樹共一种用于生物耙细胞 药物敏感性i^^细胞的培养方法，解决盲目治疗疗效差、副作用大，对患者身体和 经济易造成不必要的损失的问题。
本发明通过以下技术方案实现
一种用于生物革卿胞药物敏感性i微细胞的培养方法，由以下步^^M: (1) 外周血淋巴细胞制备，采取患者外周静脉血3 5毫升，抗凝，用磷舰缓冲液等体积禾凝畢，将禾辦畢后的血液加在含有淋巴细胞分离液离心管内的淋巴细胞分离液表面，
2000转/分，离心20射中，吸出淋巴细胞于另一离心管，加入5 10mL磷酸盐缓冲 液混匀，1500转/分，离心15^H中，弃上清液，.再加入5 10mL磷,缓冲液混匀， 计辦，1000转/分，离心10倂中，弃上清液，细鹏细胞培养液禾凝畢成1X 10fi/ 毫升细胞悬液，备用，组织细胞制备将新鲜手术组织用常规组织细胞分离方法， 分离为单细胞悬液，用细胞培养液稀释成1X IOV毫升细胞悬液，备用；(2)含各 种待测药物i歸基制备将各种待测药物用细胞培#^配制成2倍临床常规!顿剂 量峰值浓度的药液，备用；(3)细胞培养将含各种待测药物培养液加入96孑L土咅 养板，每孔100微升，每个药加2孔，设空白对照孔，不含ftf可药物的细胞培养液， 将制备好的患者细胞悬液加入±3#咅养孔中，每孔100微升，震荡混匀，置37'C， 5°/￡02环境中保湿±咅养3-7天；(4)细胞t斜己将培养后的细胞收集到^;细胞仪 样品管中，每一种药物分别收集到一管中，加入2mL磷麟缓冲液混匀，1000转/ 分，离心10倂中，弃上清液，细胞沉淀中加入100uL磷酸盐缓冲液，混匀，再加 入荧光^"i己的各种的单克隆抗体室温下，18 22°C，避光放置20 30辦中，加入 2mL磷Kk缓冲液混匀，1000转/分，离心10^H中，弃上清液，加入0.3 0.5毫 升磷麟缓冲液，混匀，待测。流式细胞仪测定按照箭式细胞仪常规操作，检测 特定耙细胞的百分率，计算各种药物对耙细胞的增殖或抑制或细胞毒作用，细胞因 子，细胞培养上清液检测，流式细胞仪测定分泌细胞因子含量，选择出对患者最 有效的药物。其中，可检测的生物耙细胞包括总T细胞，总B细胞，辅助性T细 胞，抑制性T细胞，NK细胞，Y ST细胞，T调节性细胞，ot PT细胞，肿瘤细胞，肿瘤干细胞，IL-2， IL-4， IL~6, IL-10， INF- y ， TNF- a的细胞。
本发明与现有技斜目比具有以下有益效果不同患者细胞功能异常可能由不同 的细胞，细M群，亚亚群异常引起，M本发明可以精确为细胞功能异常的患者 选择出最有效的治疗药物，显著提高治疗疗效和M^无效治疗，M^、患者身体的伤 害和经济的损失，为国家和患者节约大量医疗成本。另外可以用于刑古^用药方 案的效果，体外筛选新的药物，研究药物的作用机理，研究和制定新的治疗方案， 研克新的药物等。同时，由于药物敏感性检测在治疗传染病，自身免疫性鹏，肿 瘤等有较大的应用范围，所以临床应用可以产顿著的经济^^。
具体实施例方式
一种用于生物革巴细胞药物敏感性检测的方法，由以下步^^且成(l)外周血淋 巴细胞制备，采取患者外周静脉血4毫升，抗凝，用磷麟缓冲液靴积稀释，将
稀释后的血勵口在含有淋巴细胞分离液离心管内的淋巴细胞分离液表面，2000转/ 分，离心20么H中，吸出淋巴细胞于另一离心管，加入8niL磷麟缓冲液混匀，1500 转/分，离心15併中，弃上清液，再加入8mL磷鹏缓冲液混匀，计辦，1000转 /分，离心10倂中，弃上清液，细胞用细胞i咅养液禾凝華成lX10V新细脱悬液， 备用。组织细胞制备将茅賴羊手术组织用常规组织细胞分离方法，分离为单细胞悬 液，用细胞培养液禾糖成1X IOY毫升细胞悬液，备用；(2)含各种待测药物培养
基制备将各种待测药物用细胞培养液配制成2傲临床常规^顿齐U量峰值浓度的药
液，备用；(3)细胞培泰将含各种待测药物培养液加入96孑L培鎌，每孔IOO 微升，^h药加2 L设空白对照孔，不含招可药物的细胞培养液，将制备好的患者细胞悬液加入上述培銜L中，每孔100微升，震荡混匀，置37°C， 02环境中
保湿培养5天；(4)细胞新己将培养后的细胞收集到、 细胞仪样品管中，每
一种药物分别收集至'J一管中，加入2mL磷酸盐缓冲液混匀，1000转/分，离心10分 沐弃上清液，细胞沉淀中加入100 u L磷酸盐缓冲液，混匀，再加入荧光^i己的各 种的单克隆抗体室温下，20°C，避^^爐25^H中，加入2mL磷麟缓冲液混匀， 1000转/分，离心10^H中，弃上清液，加入0.4毫升磷麟缓冲液，混匀，待测。 流式细胞仪测定按照》試细胞仪常规操作，检测特定耙细胞的百分率，计算各种 药物对耙细胞的增殖或抑制或细胞毒作用，细胞因子采用细胞培养上清液检测，流 式细胞仪测定分泌细胞因:？ ，选择出对患者最有效的药物。其中，可检测的生 物耙细胞包括总T细胞，总B细胞，辅助性T细胞，抑制性T细胞，NK细胞， Y ST细胞，T调节性细胞，a 细胞，肿瘤细胞，肿瘤干细胞，分泌 IL-2, IL-4， IL-6， IL-IO， INF- Y ， TNF- a的细胞。
权利要求
1、一种用于生物靶细胞药物敏感性试验细胞的培养方法，其特征是由以下步骤组成(1)外周血淋巴细胞制备，采取患者外周静脉血3～5毫升，抗凝，用磷酸盐缓冲液等体积稀释，将稀释后的血液加在含有淋巴细胞分离液离心管内的淋巴细胞分离液表面，2000转/分，离心20分钟，吸出淋巴细胞于另一离心管，加入5～10mL磷酸盐缓冲液混匀，1500转/分，离心15分钟，弃上清液，再加入5～10mL磷酸盐缓冲液混匀，计数后，1000转/分，离心10分钟，弃上清液，细胞用细胞培养液稀释成1×106/毫升细胞悬液，备用；组织细胞制备将新鲜手术组织用常规组织细胞分离方法，分离为单细胞悬液，用细胞培养液稀释成1×106/毫升细胞悬液，备用；(2)含各种待测药物培养基制备将各种待测药物用细胞培养液配制成2倍临床常规使用剂量峰值浓度的药液，备用；(3)细胞培养将含各种待测药物培养液加入96孔培养板，每孔100微升，每个药加2孔，设空白对照孔，不含任何药物的细胞培养液，将制备好的患者细胞悬液加入上述培养孔中，每孔100微升，震荡混匀，置37℃，5％CO2环境中保湿培养3-7天；(4)细胞标记将培养后的细胞收集到流式细胞仪样品管中，每一种药物分别收集到一管中，加入2mL磷酸盐缓冲液混匀，1000转/分，离心10分钟，弃上清液，细胞沉淀中加入100μL磷酸盐缓冲液，混匀，再加入荧光标记的各种的单克隆抗体室温下，18～22℃，避光放置20～30分钟，加入2mL磷酸盐缓冲液混匀，1000转/分，离心10分钟，弃上清液，加入0.3～0.5毫升磷酸盐缓冲液，混匀，待测；流式细胞仪测定按照流式细胞仪常规操作，检测特定靶细胞的百分率，计算各种药物对靶细胞的增殖或抑制或细胞毒作用，细胞因子采用细胞培养上清液检测，流式细胞仪测定分泌细胞因子含量，选择出对患者最有效的药物；其中，可检测的生物靶细胞包括总T细胞，总B细胞，辅助性T细胞，抑制性T细胞，NK细胞，γδT细胞，T调节性细胞，αβT细胞，肿瘤细胞，肿瘤干细胞，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，INF-γ，TNF-α的细胞。
全文摘要
本发明公开了一种用于生物靶细胞药物敏感性试验细胞的培养方法，通过外周血淋巴细胞制备，组织细胞制备，细胞培养，细胞标记等步骤，将培养后的细胞收集到流式细胞仪样品管中，通过流式细胞仪测定特定靶细胞的百分率，计算出各种药物对靶细胞的作用，选择出对患者最有效的药物。可检测的生物靶细胞包括总T细胞，总B细胞，辅助性T细胞，抑制性T细胞，NK细胞，γδT细胞，T调节性细胞，αβT细胞，肿瘤细胞，肿瘤干细胞，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，INF-γ，TNF-α的细胞。通过本发明可以精确为细胞功能异常者选择出最有效的治疗药物，显著提高治疗疗效和减少无效治疗，减少患者身体的伤害和经济的损失，为国家和患者节约大量医疗成本。
文档编号G01N21/64GK101407789SQ200810079830
公开日2009年4月15日 申请日期2008年11月14日 优先权日2008年11月14日
发明者(请求不公开姓名) 申请人:张 雯