用于将dna导入靶细胞的筛选方法

专利名称：用于将dna导入靶细胞的筛选方法
技术领域：
本发明一般涉及用于检测任何靶细胞或生物体的组合物和方法，靶细胞或生物体用外源核酸转化而不需要可选择的标记。这些组合物和方法使DNA导入任何可转化的细胞类型并随后使用这些细胞用于高通量筛选药物或其它化合物。
发明的背景迅速和有效鉴制成功地用外源DNA转化的细胞的测定在多种应用中有用，包括例如鉴别细胞系和/或转基因生物体和进行高通量药物筛选。确实，仅有一次外源DNA的插入证实细胞系或转基因生物体可作为动物模型用于药物发现、阐明生化途径、毒性研究等。
最普遍使用的检测外源核酸是否导入靶细胞的方法是用选择，或通过由导入DNA补充的营养缺陷或通过药物抗性。为补充营养缺陷型突变体，受体细胞必须缺乏此基因功能。为了药物抗性，细胞必须对药物敏感。不幸的是，许多细胞(如病原体)对药物选择技术有抗性。例如白色念珠菌(Candida albicans)显示对潮霉素、苯菌灵、放线酮、丝裂霉素C和衣霉素的抗性。类似的，其它致病生物(如二甲氧基苯青霉素抗性的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)和一些结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的变种)对许多这些常规使用的抗生素产生抗性。因此，转化这些细胞并检测到成功的整合被证明是非常困难的。
二甲氧基苯青霉素抗性的金黄色葡萄球菌菌株(MRSA)是世界上最普遍的医院病原体。在美国大的教学医院中超过40％医院产生的葡萄球菌感染是由MRSA引起的。它们在较小的医院(200到500病床的医院中发生率为20％)及在疗养院中变得普遍(Wenzel等.，1992，Am.J.Med 91(Supp 3B)221-227)。MRSA菌株不寻常的性质是它们获得其它抗性因子的能力，这种能力导致这些菌株对化学疗法上有用的抗生素敏感性很小或没有。现在这种多抗性细菌菌株在全世界普遍，且这些病原体中最厉害的携带对所有可用的抗菌剂的抗性机制，除了一种抗菌剂(即万古霉素)(Blumberg等.，1991，J.Inf.Disease(631279-1285))。
另一种医院病原体粪肠球菌(Enterococcus faecium)因其从一个细胞转移至另一个携带质粒的抗性因子的能力而众所周知，如万古霉素抗性。这种抗性因子转移机制会导致越来越多对已知抗生素的细菌抗性。粪肠球菌的高水平万古霉素抗性菌株1986年在英格兰首次分离。在20世纪90年代，文献记录万古霉素抗性肠球菌(VRE)已传播到全世界。鉴定抗高浓度氨苄青霉素或庆大霉素或抗万古霉素的多药物抗性菌株产生严重的治疗难题。此外，缺乏对抗生素的敏感性极大地干扰操作这些生物体的能力，尤其是考虑到大部分细菌转化载体依赖于抗生素抗性选择。对抗生素抗性的基础和抗性菌株的出现更完全的解释可在文献中发现(如美国专利6,136,587 Tomasz等.，2000年10月24日；Ohno，A等.，NipponRinsho(2001)59(4)673-680)。
某些生物体中缺乏有效筛选系统可严重削弱筛选候选药物的努力。部分由于免疫减弱的病人数目上升，感染药物抗性生物和通常良性生物的全身性真菌感染增加，例如许多这种感染起因于正常人体菌群白色念珠菌。假丝酵母种现在是医院血流感染的第四种最普遍的原因(Edmond等.，(1999)Clin InfectDis.29(2)239-44)。与患严重假丝酵母感染的人数上升相当的是抗真菌化合物抗性菌株发挥的增加(White，Marr等.，(1998)Clin Microbiol Rev 11(2)382-402)。为与此抵消，必须研究新种类的抗真菌化合物和它们可能的靶。
使用遗传方法研究白色念珠菌中适合于抗真菌攻击的新靶已受到一些因素的阻碍。首先用白色念珠菌的质粒通常作为随机拷贝存在于细胞中且在没有选择压力的情况下迅速丢失(Cannon等.，(1992)Mol Gen Genet.235(2-3)453457；Kurtz等.(1987)Mol Cell Biol.7(1)209-17；Pla等.(1995)Gene 165(1)115-20)。此外，不像酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，没有着丝粒序列或自主复制序列被克隆，使游离型质粒在没有任何选择的情况下维持。
另一个阻碍研究白色念珠菌和产生有效处理的因素是，此生物被认为是其整个生命周期中的二倍体。直到最近显示假丝酵母可强制交配(Magee(2000)Science289(5477)310-313；Hull等.(2000)Science 289(5477)310-310)，可能经历四倍体阶段。存在类似于酿酒酵母交配等位基因的遗传因子表明减数分裂可导致单倍体细胞，然而没有观察到这种单倍体分离的。因此，为研究一种新的抗真菌靶，候选基因的染色体拷贝必须失活以观察其对细胞的作用。为敲除两个拷贝，发展了一个称为“ura blaster”的构建物(Alani(1987)Genetics 117(1)5-12；Fonzi等.(1993)Genetics 134(3)717-28)。必须使细胞是URA3营养缺陷型，从临床分离的产生营养缺陷型菌株通常显著减小毒性或完全去除(Lay等.(1998)InfectImmun.66(11)5301-6；Kirsch等.(1991)Infect Immun.59(9)3297-300；Polak(1992)Mycoses 35(1-2)9-16；Cole等.(1995) FEMS Microbiol Lett.126(2)177-80)。研究显示即使在强毒株中，恢复URA3功能未必使毒性恢复到野生型水平(Lay等.(1998)，同前)。
第三个因素是极少数异源基因已在白色念珠菌中表达，这是由于其异常的密码子使用(CTG编码丝氨酸而不是亮氨酸)(Leuker(1994)Mol Gen Genet.245(2)212-7)。为使异源基因在白色念珠菌中功能性表达，基因中每个CTG密码子必须突变成其它亮氨酸密码子(Morschhauser等.(1998)Mol Gen Genet.257(4)412-20)。因此，这些和其它困难限制了假丝酵母基因对URA3或其它营养标记敲除的菌株的研究。许多报道基因由于诱变它们用于表达所需的努力而不使用。
美国专利5,650.135所述方法，有可能在活动物中检测生物发光细菌，而不需解剖或其它方式打开动物(“体内监控”)-用高灵敏照相机通过肌肉、皮肤、毛皮和其它传统上“不透明”组织检测光。尽管绿色荧光蛋白(GFP)在白色念珠菌中表达(Cormack，Bertram等.，(1997)Microbiology 143(Pt2)303-11；Morschhauser，Michel等.，(1998)Mol Gen Genet.257(4)412-20)，产生GFP的白色念珠菌细胞尚未在活动物体内发现。Srikantha等.，((1996)J Bacteriol.178(1)121-9)报道海洋三色堇肾脏形肾海鳃(Renilla reniformis)的荧光素酶在白色念珠菌中表达，但底物coelentrazine的成本使它在活动物中使用不现实。
除了白色念珠菌，许多其它致病生物对大部分或所有抗生素具有抗性，因此如果并非不可能用经典方法导入包括药物抗性基因的DNA和选择由用于转化的DNA赋予的药物抗性，那么使转化这些生物体困难。
因而，仍需要检测转化靶细胞的方法，具体是不包括可选择标记的方法。本发明尤其提供这种方法、表达盒、转座子盒和其它对产生发光生物有用的工具，例如致病生物(如MRSA、抗生素抗性细菌和白色念珠菌)，致病生物适合涉及体外和整个动物中的感染和/或发病机制的研究。
发明的概述本发明涉及将感兴趣的多核苷酸导入细胞的方法，其中没有使用可选择的标记，而用筛选光产生来鉴定包括感兴趣的多核苷酸的细胞。本发明也涉及由本发明方法生成的细胞以及这些细胞的使用。在本发明的一个实施方案中，细胞是抗生素抗性细菌，如二甲氧基苯青霉素抗性的金黄色葡萄球菌菌株和万古霉素抗性肠球菌(VRE)菌株通过本发明的方法转化。
本发明的一个方面是将多核苷酸导入细胞的方法，即转化靶细胞的方法。在此方法中提供了一群细胞。用感兴趣的多核苷酸在有利于由至少一个细胞亚群吸收多核苷酸的条件下处理细胞群体。感兴趣的多核苷酸包括发光蛋白编码序列。在较佳实施方案中，发光蛋白编码序列编码生物发光蛋白，如荧光素酶。可使用许多将多核苷酸导入靶细胞的方法，包括但不限于下列脂质-介导的转移(如用脂质体，包括中性和阳离子脂质)、直接注射(显微注射)、细胞融合、微粒轰炸(例如生物射弹法，如DNA粒子轰炸)、共沉淀(如用磷酸钙或醋酸锂)、DEAE-葡聚糖-或聚乙二醇-介导的转移和病毒载体-介导的转移。然后筛选细胞群体中吸收感兴趣的多核苷酸的细胞亚群。通过它们表达包括感兴趣的多核苷酸的发光蛋白编码序列的能力来鉴别这些细胞。分离发光的细胞。这些发光细胞是多核苷酸导入的细胞，即转化的细胞。然后分离这种发光细胞以提供发光细胞的基本上纯的菌落(即克隆)，例如通过单克隆的稀释或划线。
本发明转化方法所用的多核苷酸包括发光蛋白的编码序列。这种发光蛋白可以是，例如生物发光或荧光蛋白。在本发明的一个实施方案中，生物发光蛋白是荧光素酶(如由luc或lux序列编码的)。
任何可转化细胞可用于本发明的实践。通常这种细胞转化前不发光，尽管如果细胞已产生特定波长的光，产生蛋白的发光蛋白编码序列可用来转化这类细胞，序列生成的蛋白产生不同的可鉴别波长。本发明方法可用的细胞包括但不限于原核细胞(如革兰氏阳性、革兰氏阴性菌以及其它原核生物)、真核细胞(例如酵母，如假丝酵母或酵母(Saccharomyces)；植物细胞；动物细胞；肿瘤细胞；组织特异的细胞)。昆虫细胞也可用于本发明的方法。本发明的另一个方面中，细胞群体包括抗生物素抗性细菌，例如二甲氧基苯青霉素抗性的金黄色葡萄球菌菌株和万古霉素抗性肠球菌(VRE)菌株。在有利于多核苷酸吸收的条件下靶细胞用多核苷酸处理后，在细胞类型和培养基种类(液体或固体)基础上以适当筛选密度平板培养，在此基础上根据产生的光筛选细胞。
在本发明的一个实施方案中，导入细胞的多核苷酸包括无启动子的编码发光蛋白的多核苷酸序列。通常，这种多核苷酸序列在整合入靶生物体的基因组后表达，例如邻近靶生物体基因组中的内源启动子。许多载体可包括这类多核苷酸，包括但不限于整合载体、转座子(或其它可动遗传元件，如TY或marnier)。
另一方面，导入靶细胞的多核苷酸包括可操作连接到编码发光蛋白的多核苷酸序列的启动子。许多载体可包括这种含启动子的多核苷酸序列，包括但不限于整合载体、转座子(或其它可动遗传元件，如TY或marnier)、复制型质粒、非复制型质粒等。质粒可包括，例如允许在一种细胞类型中通过的穿梭载体序列，以便制备足够量的用于转化靶细胞的多核苷酸。用于这种构建物中的启动子在靶细胞中有功能。
发光蛋白编码序列用于筛选转化的细胞，因此其它感兴趣的序列发光蛋白编码序列有关(如在相同的载体构建物中)。其它感兴趣的序列可与用于表达发光蛋白的相同控制元件有关，或另外这种感兴趣序列的表达可通过独立与感兴趣的序列有关的控制元件来介导。例如，发光蛋白编码序列的表达可通过第一个启动子介导，且更多感兴趣序列的表达可通过第二个启动子介导。
本发明的一个方面中，酵母用本文所述的方法转化。酵母转化，例如假丝酵母细胞可铺在提高光产生的培养基上，例如筛选转化的细胞群体可通过将细胞铺在SD而不是YPD平板上进行(如补充50μg/ml尿苷的SD-ura平板，含600μg/ml萤光素)。酵母细胞以及其它类型的细胞可以各种密度铺板用于初步筛选，例如以约2.5×105细胞/140mm平板的密度。在本发明的一个实施方案中，在固体培养基平板上进行筛选。分离转化细胞可通过许多方法进行，包括从发光细胞的固体培养基的平板区域中挑取样品细胞、接种样品到液体培养物中、评估各液体培养物等分样品的光产生、鉴定包括发光细胞的液体培养物、稀释和平板接种液体培养的以获得分离的单一发光细胞并鉴定衍生自单一发光细胞的单一克隆。
因此本发明提供了在细胞群体中筛选转化细胞的方法，其中方法包括，例如提供细胞群体，其中所述细胞不能产生光，用包括发光蛋白编码序列的多核苷酸转化细胞群体，根据细胞产生的光筛选转化细胞群体，其中所述产生光的细胞是转化细胞。本发明也包括由本发明的方法和其使用所产生的转化细胞。
鉴于本文的披露，本领域的普通技术人员易想到本发明的这些和其它实施方案。
附图的简述

图1显示用于荧光素酶定点突变的互补寡核苷酸对，荧光素酶用于在白色念珠菌中表达编码序列。
图2A和2B显示用于产生荧光素酶表达载体的寡核苷酸，表达载体用于白色念珠菌的转化。图2C显示合成接头A和合成接头B的排列。
图3A、3B和3C图解pGTV-ENO质粒载体的构建。
发明的详述除非另有说明，本发明的操作使用常规化学、生化、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA技术，这些技术在本领域的技术范围内。参见如Sambrook，Frisch，Maniatis，《分子克隆实验室手册》(MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL)，第二版(1989)；《新编分子生物学》(CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY)(John Wiley和Sons，Inc.，Media，PA(1995))；系列丝书《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)(Academic Press，Inc.)；《PCR 2A一种实践方法》(A PRACTICAL APPROACH)(M.J.McPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编，1995)和《动物细胞培养》(Animal Cell Culture)(R.I.Freshney.编，1987)。
在详细描述本发明前，要理解此发明不限于具体制剂或过程参数，这些当然可以变化。也要理解本文所用术语仅为了描述发明的具体实施方案，并不想要限制。
定义在描述本发明中，将使用下列术语，且如下所述进行定义。除非另有说明，本文使用的所有术语对本发明领域技术人员有相同的意义。
如在此说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数，除非上下文清楚地另有所指。因此，例如，提到“一种抗原”包括两种或更多这种试剂的混合物。
术语“转化”、“转化方法”和“转化细胞的方法”指将核酸分子如载体构建物，转移或导入靶细胞，这样转化后靶细胞包括核酸分子。典型的转化方法用于的细胞群体，其中细胞亚群最终包括核酸分子。鉴定包括导入核酸分子的亚群细胞通常用，例如选择(如在选择性培养基上生长的能力)或筛选(如表型的表达，可鉴别含导入核酸的细胞与不含导入核酸的细胞)。“转化子”是细胞(如“转化细胞”)或转化产生的生物体。这种将核酸分子导入细胞可称为“遗传转化”，以便与“细胞转化”区分。细胞转化指将正常细胞转变成致瘤性(或肿瘤)细胞，转变通常作为在不同种致癌基因控制下的结果发生。除非另有明确说明，本文所用术语“转化”是指遗传转化，即将核酸分子导入靶细胞。
术语“核酸分子”和“多核苷酸”可交换使用且是指任何长度核苷酸的多聚形式，或脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可有任何三维结构，可执行任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制例子包括基因、基因片断、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核醣体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离DNA、任意序列的分离RNA、核酸探针和引物。
多核苷酸通常包括四种核苷酸碱基的特异序列腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)(当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T))。因此，术语多核苷酸序列是多核苷酸分子的字母表示。此字母表示可输入有中央处理器的计算机的数据库中并用于生物信息学应用如功能基因组和同源搜索。
“编码序列”或“编码”选择多肽的序列是在宿主系统中当置于适当调控序列(或“控制元件”)的控制下时，转录(在DNA的情况中)和翻译(在RNA的情况中)成多肽的核酸分子。编码序列的边界由5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可包括但不限于来自病毒的cDNA、原核或真核mRNA、来自病毒的基因组DNA序列、真核或原核DNA、和甚至合成DNA序列。转录终止序列可位于编码序列的3’。
典型“控制元件”包括但不限于转录调节物如启动子、转录增强子元件、转录终止信号和聚腺苷酸化序列；翻译调节物如翻译起始最优化的序列，例如SD(核糖体结合位点)序列和翻译终止序列。启动子可包括诱导型启动子(可操作连接于启动子的多核苷酸序列的表达由分析物、辅助因子、调节蛋白等诱导)、阻遏型启动子(可操作连接于启动子的多核苷酸序列的表达由分析物、辅助因子、调节蛋白等诱导)和组成型启动子。
双链DNA分子包括具有“相反方向”的DNA的两条链，一条链指定为5’到3’；第二条链是它的互补链。因此，第一条链中的第一个编码序列和互补链中的第二个编码序列有相互有关的“相反”方向，即第一个和第二个编码序列是在彼此有关的相反方向。
“分离的多核苷酸”分子是从整个生物体中分离和独立的核酸分子，分子与生物体在自然界中发现。这种分离的多核苷酸也许全部或部分缺乏通常在自然界中与它有关的序列。
广义上使用的“多肽”是指两种或多种亚基氨基酸、氨基酸类似物或其它肽模拟物的化合物。亚基可通过肽键或其它键例如酯、醚等连接。如本文所用，术语“氨基酸”或指天然和/或非天然氨基酸，或合成氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。
“可操作连接”指元件的排列，其中所述组分被配置以行使它们通常的功能。因此，当存在适当的酶时，可操作连接于编码序列(如报道基因)的特定启动子能影响编码序列表达。只要启动子或其它控制元件发挥作用指导编码序列表达，它们不需与编码序列毗邻。例如，干扰尚未翻译的转录序列可在启动子序列和编码序列之间存在，且启动子序列仍可认为是“可操作连接”于编码序列。
本文所用的“重组多核苷酸”描述了用分子生物技术获得的核酸分子，例如通过克隆、PCR扩增、质粒分离，使用表达系统等。关于蛋白或多肽使用的术语“重组体”意味着通过表达重组多核苷酸产生的多肽。
“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”、“细胞培养”和其它这种术语表示原核微生物或作为单细胞实体培养的真核细胞系，它们可交换使用并指可以或已经用作重组载体或其它转移DNA的受体的细胞，且包括被转化的原始细胞的后代。要理解的是单个亲代细胞的后代不一定在形态学或基因组或总DNA补体上完全与原始亲代相同，这是由于偶然突变或目的性突变。足够类似于亲本的亲代细胞的后代通过相关性质表现其特征，如存在编码所需肽的核苷酸序列，这些后代包括在此定义中所指的后代并被以上术语涵盖。
确定核苷酸和氨基酸“序列同一性”的技术也在本领域中已知。通常，这种技术包括确定用于基因的mRNA的核苷酸序列和/或确定从而编码的氨基酸序列、比较这些序列和第二个核苷或氨基酸序列。一般，“同一性”指分别相应于两种多核苷酸或多肽序列的精确的核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸。两种或多种序列(多核苷酸或氨基酸)可通过确定它们的“同一性百分比”来比较。不管核酸还是氨基酸序列，两种序列的同一性百分比是两种排列的序列间准确配对的数目除以较短序列的长度并乘以100。核酸序列的近似排列由Smith和Waterman，《应用数学的进展》(Advances in Applied Mathematics)2482-489(1981)的局部同源性算法提供。该算法可通过用Dayhoff，《蛋白质序列和结构的图谱集》(Atlas of ProteinSequences and Structure)，M.O.Dayhoff编，5 suppl.3353-358，全国生物医学研究基金会(National Biomedical Research Foundation)，Washington，D.C.，USA开发的得分矩阵(scoring matrix)应用于氨基酸序列，并通过Gribskov，Nucl.Acids Res.14(6)6745-6763(1986)来归一化。此算法确定序列百分比同一性的一个示范手段用是由Genetics Computer Group(Madison，WI)在“Bestfit”效用应用中提供的。此方法的默认参数描述于《威斯康星序列分析包程序手册》(Wisconsin Sequence Analysis Package ProGram Manual)第8版(1995)(可从Genetics Computer Group，Madison，WI获得)。本发明中建立百分比同一性的一个较佳方法是使用MPSRCH程序包，该程序包由爱丁堡大学(University ofEdinburgh)享有版权，由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发，由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)发行。从此套包中，默认参数用于记分表(例如间隙开放罚分12，间隙延伸罚分1，间隙6)的地方可使用Smith-Waterman算法。从数据产生的“配对”值反映了“序列同一性”。其它计算序列间百分比同一性或类似性的合适程序一般在本领域中已知，例如另一种排列程序是使用默认参数的BLAST。例如，BLASTN和BLASTP可使用下列默认参数遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两者；中止＝60；预期＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50序列；排序＝高分数；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白质+Spupdate+PIR。这些程序的详情可发现于下面的因特网地址http//www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
“基因”指含至少一个可读框的多核苷酸，多核苷酸能编码具体产物(如多肽、蛋白质或RNA)。通常，术语“基因”包括与产物表达相关的控制序列。术语“基因座”指生物体的基因组中基因的物理位置。本文所述的任何多核苷酸序列可用于鉴定与它们相关的基因的较大片断或全长编码序列。分离较大片断序列的方法对本领域技术人员是已知的。
两种核酸分子间序列相关性的程度影响这种分子间杂交的效率和强度。部分相同的核酸序列至少部分抑制完全相同的序列与靶分子杂交。抑制完全相同的序列杂交可用本领域熟知的杂交试验评估(如DNA印迹、RNA印迹、溶液杂交等，参见Sambrook等，分子克隆实验室手册(MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL)，第二版(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。这类试验可用不同程度的选择性进行，例如用从低到高不同严紧性的条件。如果使用低严紧性的条件，非特异结合的缺乏可用第二探针评估，第二探针缺乏甚至部分程度的序列同一性(例如具有与靶分子的序列同一性小于约30％的探针)，因此缺少非特异结合时第二探针不与靶杂交。
当使用以杂交为基础的检测系统时，选择与靶核酸序列互补的核酸探针，然后通过适当条件使探针和靶序列“选择性杂交”，或相互结合以形成杂种分子。在“适度严紧性”下能选择性与靶序列杂交的核酸分子通常在允许检测靶核酸序列的条件下杂交，靶核酸序列至少约10-14核苷酸长度并与选择的核酸探针序列有至少约70％的序列同一性。严紧的杂交条件一般允许检测的靶核酸序列至少约10-14核苷酸长度并与选择的核酸探针序列有大于约90-95％的序列同一性。在探针和靶有特异程度序列同一性的地方对探针/靶杂交有用的杂交条件可如本领域已知的确定(参见，例如《核酸杂交实践方法》(Nucleic Acid HybridizationA PracticalApproach)，编者B.D.Hames和S.J.Higgins(1985)Oxford；Washington，D.C；IRLPress)。
关于杂交的严紧性条件，本领域熟知的是可使用许多相同条件来建立不同的具体严紧性，例如下列因素探针和靶序列的长度和性质、多种序列的碱基组成、盐和其它杂交溶液成分的浓度、存在或缺乏杂交溶液中的封闭剂(如甲酰胺、硫酸葡聚糖和聚乙二醇)、杂交反应温度和时间参数以及不同的洗涤条件。具体杂交条件的选择按下列本领域标准方法选择(参见，例如Sambrook等，《分子克隆实验室手册》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版(1989)ColdSpring Harbor，N.Y.)。
包括确定的邻近核酸序列的核酸“编码”相应的多肽或RNA产物。例如，包括可读框的DNA序列编码多肽序列与可读框相符合。另一例子中，DNA序列可编码相应的rRNA、tRNA或mRNA序列。
“纯化的多核苷酸”指感兴趣的多核苷酸或其片断，片断本质上没有与多核苷酸天然相连的蛋白，如含少于约50％，较佳的是少于约70％，更佳的是少于约90％的蛋白。纯化感兴趣的多核苷酸的技术在本领域中熟知，包括例如用离液剂破裂含多核苷酸的细胞和通过离子交换层析、亲和层析及依照密度的沉降来分离多核苷酸和蛋白质。
“载体”能转移基因序列到靶细胞中(如病毒载体、非病毒载体、颗粒运载体和脂质体)。通常，“载体构建物”指能转移感兴趣的序列到靶细胞的核酸载体。核酸载体可暂时存在于靶细胞中或能在其中复制。瞬时载体一般没有可在靶细胞中发挥作用的复制起点，或在靶细胞中在一定条件下没有功能(“条件”复制起点)。
“核酸表达载体”指能指导感兴趣的序列或基因表达的集合。核酸表达载体包括可操作连接于感兴趣的序列或基因的启动子。其它控制元件也可存在。例如，除了表达盒的组成，质粒构建物也可包括一个或多个复制起点、一个或多个可选择标记、允许质粒构建物作为单链DNA(如M13复制起点)存在的信号、多克隆位点和“哺乳动物”复制起点(如SV40或腺病毒复制起点)。
“表达盒”包括任何含能在细胞中表达的多核苷酸基因或序列的核酸构建物。除了感兴趣的多核苷酸基因或序列，表达盒可包含另外的转录、翻译或其它调节或控制元件。为了转移表达盒到靶细胞中，这种盒通常构建到“载体”、“载体构建物”或“表达载体”(即核酸表达载体)中。
本文所用“转座子”定义的多核苷酸包括能从一个基因座重新定位到另一个基因座的重复元件(如从一个染色体点到另一个染色体点，或从一个附加体点到另一个染色体点，即转座子是移动遗传元件。在本发明的一个较佳实施方案中，“转座子盒”包括转座所需的最小单位(如在内部多核苷酸序列侧翼的第一个和第二个转座子反向重复序列，重复序列包括至少一个能诱导转座的转座酶，转座由所述转座子反向重复介导)。另外，转座子盒可以是内部多核苷酸序列侧翼的第一个和第二个转座子反向重复序列，其中转座酶功能以反式提供或由转座子盒外部编码(即内部多核苷酸序列侧翼的两种转座子反向重复的外部)。如本文所述，转座子盒包括至少两种内部区域侧翼的反向重复序列。内部区域可包含转座酶编码序列和/或其它感兴趣的序列。转座子盒的示意图如下IR-内部区域-IR，其中IR代表反向重复。在另一个实施方案中，示意图如下IR-tnp-IR，其中tnp代表转座酶基因。此外，感兴趣IR-序列-tnp-IR代表另一个实施方案，能诱导IR序列介导的转座。更多的序列、反向重复的5’和3’可包括在所示的转座子盒中。宿主生物中“功能性”转座子盒能在该生物中发生转座。术语“转座体”(transposant)通常指细胞，在其中转座子整合到细胞基因组中。
“发光蛋白”或“光发射蛋白”是能产生光的生物发光或荧光蛋白，光通常在200nm到1100nm范围，优选在可见光谱(即在约400nm到750nm间)。生物发光蛋白通过化学反应产生光(通常需要底物、能源和氧)。荧光蛋白通过吸收和重发射辐射产生光(如用绿色荧光蛋白)。生物发光蛋白的例子包括但不限于下列除非另有说明，“荧光素酶”包括原核(如细菌lux-编码)和真核(如萤火虫luc-编码或肾海鳃荧光素酶)荧光素酶，以及具有不同或改变光学性质的变体，如产生不同颜色的光的荧光素酶(如Kajiyama，N.和Nakano，E.，(Protein Engineering4(6)691-693(1991))；和“光蛋白”例如钙激活光蛋白(如Lewis，J.C.等.，Fresenius J.Anal.Chem.366(6-7)760-768(2000))。荧光蛋白的例子包括但不限于绿色、黄色、青色、蓝色和红色荧光蛋白(如Hadjantonakis，A.K.，等.，Histochem.Cell Biol.115(1)49-58(2001))。
“发光生蛋白底物”或“光发射蛋白底物”描述了发光蛋白的底物，如荧光素酶产生能量衰减的底物(如萤光素)和通常外加能源的光的光子，如ATP或FMNH2和氧。这些底物的例子包括但不限于细菌lux系统中的癸醛(decanal)、萤火虫荧光素酶(luc)系统中的4，5-二氢-2-(6-羟基-2-苯并噻唑基)-4-噻唑羧酸(或简称为萤光素)、生物发光真菌止血扇茹(Panellus stipticus)系统中的“泛醛”(panal)(Tetrahedron 441597-1602，1998)和重胃蚯蚓(Diplocardialonga)系统中的N-异-戊酰-3-氨丙醇(Biochem.151001-1004，1976)。如本文所述，在一些系统中醛可用作发光蛋白的底物。
除非另有说明，本文的“光”定义为波长在约200nm(如用于UV-C)和约1100nm(如红外线)间的电磁辐射。可见光的波长范围在约400nm到约750nm间(即在约4,000埃和约7,500埃间)。
“动物”通常指非人的动物，包括但不限于农场动物如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物如狗和猫；实验室动物包括雪貂、野兔、兔和啮齿动物，如小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠和豚鼠；非人的灵长类动物包括黑猩猩。术语“动物”也可包括但不限于鸟包含家养、野生和猎鸟如小鸡、火鸡和其它家禽的鸟、鸭、鹅等以及两栖动物、鱼、昆虫、爬行动物等，。术语不指定一个具体年龄。因此，涵盖成年、胚胎、胎儿和新生个体。
“转基因动物”指遗传工程动物或遗传工程动物的后代。转基因动物通常含来自至少一种不相关生物的物质，如来自病毒、微生物、植物或其它动物。术语“嵌合动物”用于指在其中发现异源基因的动物，或异源基因在动物的一些但不是所有细胞中表达。
本文所用的术语“可选择标记”描述了一种编码序列，它赋予转化生物体相对未转化生物体在培养基上的生长优势，生物体用可选择标记编码序列转化。可选择标记的例子包括但不限于，(i)通过功能基因互补突变体基因，例如营养缺陷型突变的互补，如用URA3基因互补ura3-突变体(这种突变体不能在缺乏尿苷或尿嘧啶的情况下生长)，(ii)将编码序列导入细胞，编码序列提供显性、可选择的表型，例如编码药物抗性核糖体蛋白的序列，(iii)将编码序列导入细胞，编码序列赋予对加入培养基中药物的抗性，如使细菌(大肠杆菌)在含氨苄青霉素的培养基中生长的β-内酰胺酶基因。可选择标记不包括一种标记，它赋予的表型必须由非生长相关试验评分，如产生光的能力。如本文所用，菌落根据它们产生光的能力来“筛选”。
如本文所用，“分析物”指任何化合物或物质，它们的效果(如诱导或抑制一个具体的启动子)可用试验动物和本发明的方法评估。这种分析物包括但不限于化学化合物、药物化合物、多肽、肽、多核苷酸和多核苷酸类似物。许多组织(如国立卫生研究院，药物和化学公司)有大的化学或生物化合物的库，这些化合物来自天然或合成过程，或发酵液或提取液。这种化合物/分析物可用于本发明的实践中。
完成发明的方法在详述本发明前，要理解此发明不限于具体制剂或过程参数，这些当然可以变化。也要理解本文所用术语仅为了描述发明的具体实施方案，并不想要限制。
尽管一些与本文所述类似或相同的方法和材料可在本发明的实践中使用，本文所述的是较佳的材料和方法。
发明的概述本发明的组合物和方法促进将光产生性质赋予生物体或选择细胞的能力。此外，本发明的组合物和方法使任何感兴趣的多核苷酸导入靶细胞或生物体，用编码发光蛋白的序列作为可筛选标记以鉴定这种靶细胞或生物体的转化子。用发光蛋白作为筛选细胞转化感兴趣多核苷酸的能力不需要可选择标记，例如，难以转化细胞或生物体。编码发光蛋白的序列可操作地连接于任何感兴趣的异源基因，因此光产生可作为成功转化具有感兴趣异源基因的细胞的报道基因。
本发明的一个方面包括将多核苷酸导入细胞的方法、转化靶细胞的方法。在此方法中提供了细胞群体。细胞群体在促进至少一个细胞亚群吸收多核苷酸的条件下，用感兴趣的多核苷酸处理。感兴趣的多核苷酸包括发光蛋白编码序列。在一个实施方案中，发光蛋白编码序列编码生物发光蛋白，如荧光素酶。可使用许多方法将多核苷酸导入靶细胞中，包括但不限于下列方法脂-介导转移(如用脂质体，包括中性和阳离子脂质)、直接注射(如微注射)、细胞融合、微粒轰击(例如生物射弹方法，如DNA粒子轰击)、共沉淀(如用磷酸钙或乙酸锂)、DEAE-葡聚糖-或聚乙二醇-介导转移和病毒载体-介导转移。然后筛选细胞群体中吸收感兴趣多核苷酸的细胞亚群。这些细胞通过它们表达包括感兴趣多核苷酸的发光蛋白编码序列来鉴定。分离光产生细胞。这些光产生细胞是多核苷酸导入的细胞，即转化细胞。接着分离这种光产生细胞以提供光产生细胞的基本上纯的菌落(即克隆)，例如通过单克隆的稀释或划线。
此外，携带这种编码发光蛋白的序列的生物体，例如随后以多种感染模式体内监控或用于追踪感染和/或发病机理，如在食物工业中。具体来说，赋予生物体这种光产生性质是需要的，该生物体对任何可用的选择方法有抗性。例如，一些普遍存在的病原体(如白色念珠菌和葡萄球菌的一些种)对抗生素或其它一般可选择标记有抗性。其它也需要赋予光产生性质的生物体如衣原体、梅毒密螺旋体、幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)和其它难以操作及以前未适用于药物干扰的生物体。
本发明讲授了质粒和表达盒的使用(如修饰的荧光素酶操纵子和含Tn4001、Tn917等的转座子盒)以促进感兴趣生物体的遗传操作，包括但不限于革兰氏阴性菌(包括幽门螺杆菌和其它)；革兰氏阳性菌(包括相关生物如衣原体和梅毒螺旋体)和真核生物如酵母(包括白色念珠菌和其它)。
一方面，本发明涉及含荧光素酶基因的构建物。具体来说，发明包括再改造真核荧光素酶，例如衍生自荧烛(Photinus pyralis)的荧光素酶。再改造这些荧光素酶操纵子包括，例如定点突变来改变(如最优化)密码子使用。编码选择发光蛋白的核酸编码序列可按照本发明的讲授通过本领域已知的方法在靶生物中表达最优化。
作为例子，已知在大部分真核生物中CTG编码氨基酸亮氨酸，而在假丝酵母中CTG编码氨基酸丝氨酸。为了异源基因在假丝酵母中表达，似乎真核荧光素酶中的CTG密码子必须突变成亮氨酸-编码序列(如TTG)。然后再改造的荧光素酶操纵子可插入载体，载体包括一种或多种下列可操作连接于荧光素酶编码序列(1)在靶细胞中活性或高度转录的启动子(如白色念珠菌烯醇酶(ENO1)启动子)；(2)聚腺苷酸化信号(如白色念珠菌肌动蛋白(ACT1)聚腺苷酸化信号)；和(3)感兴趣的异源基因。在一些实施方案中，启动子和/或聚腺苷酸化信号在荧光素酶操纵子侧翼。
另一方面，发明涉及使用无启动子的荧光素酶盒使感兴趣的生物体转化成光产生表型，转化通过转座子的方法将盒整合到那些生物体的基因组中，其中在靶生物中邻近内源启动子发生整合。例如，将无启动子的荧光素酶(如lux)盒插入Tn4001转座子，然后用携带Tn4001荧光素酶构建物的穿梭载体转化感兴趣的细胞。转化后的转座导致荧光素酶盒整合到宿主生物的基因组中并导致生物产生光的能力；其它无启动子的盒整合在活性启动子序列后面产生具有光产生表型的宿主生物。使用这种方法，使得一些不同属的革兰氏阳性菌明亮地发光，或是组成型或是诱导的。
本文所述构建物(如修饰的荧光素酶质粒和转座子构建物)可插入合适的主链中(如穿梭载体)并因此赋予产生编码感兴趣序列的产物的能力(在发光蛋白的情况中，还赋予细胞或动物中产生光的能力)，这种能力是根据感兴趣编码序列(如发光蛋白编码盒)整合到宿主细胞基因组的活性启动子区域后面。一方面，本文所述构建的允许产生发光生物体(如革兰氏阳性菌)和在动物模型中使用这些生物体。
许多发光蛋白序列在本发明实践中有用且，通常最优化在靶生物中表达。
因此，本文提供了导入核酸(如感兴趣的异源基因)到靶细胞的筛选方法而不需可选择标记。这尤其在致病菌株中有用，如假丝酵母或抗性细菌，在其中没有有用的可选择标记。用本文所述构建物转化靶宿主细胞以提供核酸随后整合的机会。所得光产生表型可以是组成型、诱导型或阻抑型，这取决于转座子盒后面的启动子区域的性质，此种表型可用于检测成功的转化。
然后，这种转化细胞可用于，例如在体外和动物模型中筛选候选效应分子。显示产生光的细胞(或菌落)可用于鉴定有效药剂，光产生是由于感染诱导的启动子的活性。例如，显示产生光的细胞用于感染实验动物和对照动物。实验动物然后用感兴趣的药剂处理。监控实验动物和对照的光产生和鉴定有效试剂，例如鉴定消除产生光的能力。
本发明的优点包括但不限于(i)转化多种生物体，包括革兰氏阳性菌、抗生素抗性生物体、白色念珠菌等；(ii)在那些转化的生物体中获得高水平的发光蛋白表达，例如允许在体外和体内更敏感地检测产生的光；(iii)盒整合到宿主染色体中从而编码发光蛋白的序列变成可操作连接于宿主细胞启动子，例如允许鉴定参与发病机理的启动子；和在生理温度下(如37℃-42℃)从这些生物体中产生稳定的光。
本发明方法和构建物的具体方面在下面讨论。
1.发光蛋白本发明的实践通常使用编码发光蛋白的核苷酸序列。当使用本文所述发光报道蛋白时，可准确且非侵染性地评估表达，如前所述(参见，例如Contag，P.R.等.，(1998)Nature Med.4245-7；Contag，C.H.，等.，(1997)PhotochemPhotobiol.66523-31；Contag，C.H.，等.，(1995)Mol Microbiol.18593-603)和本文所述。
发明的一个方面中，发光蛋白是荧光素酶。生物发光提供了用于研究细菌感染的有效的报道系统(如美国专利号5,650,135)。荧光素酶是应用于不同酶家族成员的术语，当提供底物(如萤光素、长链醛或colentrazine)、能源(如ATP或FMNH2)和氧时，这些酶共享光产生性质。荧光素酶可广义分类为真核荧光素酶(由luc基因编码)和原核荧光素酶(由lux基因编码)。真核荧光素酶(“luc”)通常由单基因编码(参见如de Wet，J.R.等.，(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.827870-7873；de Wet，J.R.等.，(1987)，Mol.Cell.Biol.7725-737)。
细菌荧光素酶(“lux”)通常由两个亚基(α和β)组成，两个亚基在lux操纵子上由两个不同基因(luxA和luxB)编码。操纵子上其它三种基因(luxC、luxD和luxE)编码醛底物生物合成所需的酶。细菌lux存在于一些生物发光革兰氏阴性菌(如发光光杆状菌中，且野生型操纵子排列为CDABE。
此外，另一细菌基因，从费氏弧菌(Vibrio fischeri)菌株Y-1中分离的luxY编码黄色荧光蛋白(YFP)，当通过荧光素酶作用时，底物发出λmax为545nm的黄光。参见Baldwin，T.O等.，(1990)Biochem 295509-5515。
本发明的另一个方面中，发光蛋白是荧光蛋白，例如蓝色、青色、绿色、黄色和红色荧光蛋白。
一些发光蛋白编码序列可商业购买，包括但不限于下列。Clontech(PaloAlto，CA)提供荧光素酶的编码序列和多种荧光蛋白，包括蓝色、青色、绿色、黄色和红色荧光蛋白。增强的绿色荧光蛋白(EGFP)变体在哺乳动物系统中很好地表达，并往往显示比野生型GFP更亮的荧光。增强的荧光蛋白包括增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、增强的青色荧光蛋白(ECFP)和增强的黄色荧光蛋白(EYFP)。此外，Clontech提供不稳定的增强的荧光蛋白(dEFP)变体，dEFP变体以迅速转换率为特征。dEFP变体的较短半衰期使它们在动力学研究和作为定量报道基因上有用。DsRed编码序列可从Clontech获得(http//www.clontech.com/techinfo/vectors/vectorsD/text/pDsRed.txt)。Ds Red是表达研究中有用的红色荧光蛋白。此外，Fradkov，A.F.等描述了来自Discosoma珊瑚的一种新荧光蛋白和其突变体，突变体有独特的远红外荧光(FEBS Lett.479(3)，127-130(2000))(mRNA序列，GENBANK登记号AF272711，蛋白序列GENBANK登记号AAG16224)。Promega(Madison，WI)也提供萤火虫荧光素酶的编码序列(例如，如pGL3载体中所包含的)。另外，许多荧光蛋白的编码序列可从GENBANK获得，例如登记号AY015995、AF322221、AF080431、AF292560、AF292559、AF292558、AF292557、AF139645、U47298、U47297、AY015988、AY015994和AF292556。
此外，可使用更多的光产生系统，例如当评估细胞中表达时可用。这种系统包括但不限于发光β-半乳糖苷酶遗传报道系统(Clontech)。
1A.Lux-编码盒发明的一方面中，提供的基因盒包括编码结构和底物-编码lux基因-产物的鑫核苷酸。支持本发明进行的实验证明重排lux基因和在一个或多个lux基因前插入转录和/或翻译控制序列赋予所得荧光素酶提高光产生能力，重排lux基因例如从野生型CABDE到ABCDE，序列在表达所需的靶生物基础上选择。例如，当在转化革兰氏阳性菌中使用时，革兰氏阳性SD序列插入编码序列的上游。当用于转化其它生物体时，可使用适当的转录和/或翻译增强序列(如真核细胞中的Kozak序列，革兰氏阴性生物的革兰氏阴性SD序列)。在一些生物体中，例如真核生物，各lux基因可置于单独启动子转录控制下。luxABCDE盒不仅表达荧光素酶，也表达合成lux荧光素酶底物-醛必需的生物合成酶。因此，当使用这种盒时，氧是生物发光唯一的外部要求。
发明的另一方面中，luxY可加入包括发光蛋白编码序列的盒。例如，将luxY基因加入luxABCDE基因盒导致生物发光期间发出光的波长范围变宽，生物发光接近可视光谱的红外端。般定较长波长的光与较短波长的光相比更容易渗透活组织，因此本发明luxABCDE基因盒的选择实施方案另外包括luxY编码序列，作为提高应用敏感性的方法，使用生物发光作为报道基因方式。
一方面，提供了luxAB基因盒。当用于转化革兰氏阳性生物时，luxAB盒通常包含革兰氏阳性核糖体结合位点(也称为“SD”序列)，结合位点可操作连接各编码luxA和luxB的多核苷酸的上游。当用于转化其它生物体时，可使用适当的转录和/或翻译增强序列(如启动子序列、真核生物中的Kozak序列、用于革兰氏阴性生物的革兰氏阴性SD序列)。当提供外源醛底物时，携带luxAB盒的宿主生物显示现出生物发光。luxAB盒赋予的荧光素酶活性水平比以前已知的构建物中发现的更高，尤其是当它在革兰氏阳性菌如葡萄球菌(Staphylococcus)或链球菌(Streptococcus)中表达时。
lux编码基因的编码序列可最优化用于靶生物中的表达。例如，定的lux基因的多肽产物的序列，可选择适当密码子来编码多肽，其中在靶生物中优选密码子使用的基础上选择这种密码子。
还描述了修饰的lux编码序列，如Xenogen公司2001年3月15日出版的WO01/18195。
在另外的实施方案中，可提供产生两种或多种发光多肽的序列作为单独转座子盒中第一个感兴趣序列，发光多肽在两个或多个波长产生发射光；转座子盒可依次或在单载体主链或在多载体主链中提供。这种构建物可用于产生，例如本发明的单个携带多转座子盒的微生物，其中转座子盒可各自编码在不同波长发光的发光多肽。
1B.Luc-编码盒本发明也包括可在靶细胞中表达真核荧光素酶的基因盒。如上所提到的，已鉴定多种真核荧光素酶并可商业购买，例如质粒pGL2(Promega，Madison，WI)包含荧烛(Photinus pyralis)荧光素酶。
已鉴定的多种荧光素酶编码基因包括但不限于下列B.A.Sherf和K.V.Wood，美国专利号5,670,356，1997年9月23日出版；Kazami.J.等.，美国专利号5,604,123，1997年2月18日出版；S.Zenno等，美国专利号5,618,722；K.V.Wood，美国专利号5,650,289，1997年7月22日出版；K.V.Wood，美国专利号5,641,641，1997年6月24日出版；N.Kajiyama和E.Nakano，美国专利号5,229,285，1993年7月20日出版；M.J.Cormier和W.W.Lorenz，美国专利号5,292,658，1994年3月8日出版；M.J.Cormier和W.W.Lorenz，美国专利号5,418,155，1995年5月23日出版；de Wet，J.R.等，Molec.Cell.Biol.7725-737，1987；Tatsumi，H.N.，等，Biochim.Biophys.Acta 1131161-165，1992；Wood，K.V.，等，Science244700-702，1989。另一组生物发光蛋白包括水母蛋白家族的发光蛋白(Prasher，D.C.，等，Biochem.261326-1332(1987))。荧光素酶以及水母蛋白质样分子需要能源如ATP、NAD(P)H等，和底物如萤光素或coelentrazine和氧。
野生型萤火虫荧光素酶通常最大发射在约550nm。也研究了许多有不同最大发射的变体。例如，Kajiyama和Nakano(Protein Eng.4(6)691-693，1991；美国专利号5,330,906，1994年7月19日出版)讲授了五种不同萤火虫荧光素酶，它们通过改变Luciola cruciata荧光素酶编码序列的单个氨基酸来产生。变体的发射峰为558nm、595nm、607nm、609nm和612nm。发射峰为约540nm的黄色-绿色荧光素酶可从Promega，Madison，WI在pGL3名下购得。发射峰为约610nm的红色荧光素酶描述于，例如Contag等.(1998)Nat.Med.4245-247和Kajiyama等.(1991)Prot.Eng.4691-693中。衍生自米氏肾海鳃(Renilla muelleri)的荧光素酶编码序列也已描述(mRNA，GENBANK登记号AY015988，蛋白质登记号AAG54094)。
本文所述构建物和方法中，真核荧光素酶被优先修饰，以致密码子使用反映在靶细胞中更常使用的那些密码子。可获得密码子修饰，例如通过用密码子使用数据库，在万维网http//222.kazusa.or.jp/codon/获得。例如，在假丝酵母中密码子CTG作为丝氨酸残基表达，而在许多其它真核生物(包括P.pyralis)中，CTG作为亮氨酸残基表达。因此，CTG密码子在P.pyralis中优先修饰成TTG(或其它任何在假丝酵母中作为亮氨酸表达的密码子)。
位点特异地突变荧光素酶操纵子的一个较佳方法是用PCR。PCR的一般过程讲授于MacPherson等.，《PCR一种实践方法》(PCRA PRACTICAL APPROACH)，(IRLPress at Oxford University Press，(1991))。各应用反应的PCR条件可根据经验确定。一些参数影响反应的成功。这些参数是退火温度和时间、延伸时间、Mg2+和ATP浓度、pH、和引物、模板及脱氧核糖核酸的相对浓度。示范引物(如寡核苷酸引物)描述于下面的实施例中。扩增后，可通过琼脂糖凝胶电泳接着用溴化乙锭染色和紫外照射目视来检测所得片段。位点特异突变也描述于下面的实施例中，且图1显示用于定点突变P.pyralis的寡核苷酸对。优选的是变化不影响所得蛋白质的氨基酸序列。
另一个获得修饰荧光素酶的方法是随机突变以随机改变氨基酸，接着筛选显示有效发光的克隆。可进行随机突变，例如通过产生寡核苷酸以随机改变靶DNA序列。
2.载体编码发光蛋白的序列可然后用来构建载体，以在用于靶细胞的转化。一些这种构建物描述于实施例中。用于本发明的载体一般可分成两组，无启动子的构建物和含启动子的构建物。
在一些实施方案中，构建物是无启动子的(如以下详述的转座子穿梭载体)。然而在其它实施方案中，构建物包括可操作连接于荧光素酶序列的启动子序列。优选的是启动子在靶细胞中有活性。在靶生物中有功能的启动子可通过检查与靶生物相关的先有技术来鉴定(如下面假丝酵母的例子)。类似地，更多转录和/或翻译控制元件从靶生物中优选获得。
当需要整合到靶生物的基因组时，与发光蛋白关联的无启动子的构建物对转化载体是有用的。在此情况下，发光蛋白的表达和随后的光产生取决于发光蛋白编码序列整合到内源活性启动子附近。含这种无启动子的发光蛋白编码序列的载体构建物可以是线状或环状的。它们可包括在基因组特异位置靶整合的序列，这种整合可由位点特异性整合介导(如环状载体中同源序列的单交换，或发生双交换的同源重组基本上置换一个基因组片断)。另外，线状或环状多核苷酸可导入，随机整合到基因组中。这种无启动子的构建物可包括另外的元件，包括但不限于下面所述的那些。
在另一个实施方案中，本发明使用的载体构建物中发光蛋白编码序列在所选启动子(即含构建物的启动子)的转录控制下。如上述无启动子的构建物，含构建物的启动子可以是线状或环状，且它们可包含指导整合到一个或多个位点的元件，或这种载体可导入靶细胞且利用随机整合以获得转化子。
因此，本文所述的发光蛋白编码序列可插入无启动子的载体或含启动子的载体，载体进一步包括一个或多个下列各项(1)一个或多个聚腺苷酸化信号、(2)一个或多个整合靶序列、(3)一个或多个复制起点、(4)一个或多个转录终止元件和(5)一个或多个感兴趣的编码序列。感兴趣的编码序列通常包括它们自身的转录和/或翻译控制元件。例如，如果使用无启动子的发光蛋白构建物且在靶生物中有功能的启动子可操作连接于感兴趣的编码序列，载体可进一步包括转录终止序列以防止发光蛋白编码序列的通读转录受转录控制元件影响，转录控制元件与感兴趣的编码序列相联。在另一个示范实施方案中，例如当转化革兰氏阳性菌时，感兴趣的无启动子编码序列可与无启动子发光蛋白编码序列串联，其中感兴趣的编码序列包括可操作连接的革兰氏阳性SD序列以基本上产生提供多顺反子信息的序列。
本发明的另一方面中，无启动子的构建物包括一个转座或可动遗传因子。
2A.转座或可动遗传元件一方面，本发明的实践使用转座或可动遗传元件。具体的转座或可动元件在靶生物的基础上选择。示范靶生物和相关转座或可动元件包括但不限于下列各项细菌(如革兰氏阳性、革兰氏阴性)、酵母(如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ty元件，Boeke，Garfinkel等.(1985)Cell 40(3)491-500)、植物(如玉米)和昆虫(如果蝇中的mariner)。为用于本发明，修饰转座子或可动遗传元件包括无启动子的发光蛋白构建物或含启动子的发光蛋白构建物。可修饰转座子或可动遗传元件以进一步包括其它元件，如另外的感兴趣的多核苷酸序列。通常，所有加入转座子的组分或可动遗传元件包括在功能转座子或可动遗传元件的边界间，如反向重复，当转座子或可动遗传元件重定位时，加入的组分与转座子或可动遗传元件一起移动。
用于本发明的一个示范转座子是Tn4001，这是一种I类复合型转座子，最初分离自金黄色葡萄球菌(GeneBank登记号M18086，序列的1-1，324个碱基对；参见Byrne，M.E.，Rouch，D.A.和Skurray，R.A.(1989)Gene 81361-367)。此元件能以高度的随机性插入革兰氏阳性生物的细菌染色体中。为支持本发明而进行的实验表明，转座子也在革兰氏阴性宿主细胞中有功能。
Tn4001转座子的组分包括(1)IS256插入序列的两个相同拷贝，作为定义插入序列的反向重复(IR’s)存在和(2)一个位于反向重复内的转座酶基因，反向重复定义插入。一般，当提到转座子时，认为反向重复是功能转座子单位的边界。如下所讨论的，此基本结构可进一步修饰并置于多种载体主链中。
例如，其它感兴趣的序列可插在反向重复(如5’-IR-发光蛋白编码序列--感兴趣的序列-IR 3’)之间，以及发光蛋白编码序列间。在一个实施方案中，其它感兴趣的序列缺乏一个相关的启动子区域。在此情况中，转录增强序列可加在各蛋白编码序列间(即用于产生多顺反子信息)。在另外的实施方案中，靶生物中有功能的启动子可操作连接于感兴趣的序列。
当使用包括发光蛋白编码序列的无启动子构建物时，发光蛋白编码序列和另外感兴趣的序列优先导入Tn4001转座子，这样插入序列的转录方向与转座酶编码序列的方向相反，所以不在转座酶启动子的影响之下。因此序列不转录，除非且直到插入序列的整合发生在活性或可活化启动子区域后面。作为推论，这意味着在DNA中感兴趣序列的可读框的编码序列与转座酶是在相反方向。另外，倘若转座酶序列位于感兴趣序列下游，转座酶序列可以和感兴趣序列相同的方向存在，这是为了避免内源转座酶启动子的通读和在整合前表达发光蛋白基因产物。
当无启动子的构建物用于本发明的实践时，发光蛋白序列通常在转座元件内不含启动子时使用。即无启动子的序列通常存在于转座子中，转座子可介导发光蛋白的转录。在一个较佳实施方案中，发光蛋白序列插入5’反向重复序列的3’端附近或非常接近处，如5’-IR-发光蛋白序列-IR-3’。此外，序列以与转座酶序列相反的方向插入，这样即使转录转座酶序列，在感兴趣序列(如发光多肽编码序列)整合到感兴趣的生物基因组前没有感兴趣序列的转录，基因组在活性宿主启动子区域附近。
转座子盒通常克隆到穿梭载体中以容易操作和分离大量载体DNA。一些这种穿梭载体普遍可用，如pAUL-A(Chakraborty等.(1992)J Bacteriol 174568-574)；pE194(Sozhamannan，s.，等.(1990)J Bacteriol 1724543-4548；此载体的图谱参见http//phage.atcc.org/vectors/gifs/68359.gif；全长序列参见ftp//ftp.atcc.org/pub/vector-seqs/pE194.html)；pMK4(Sullivan，M.，等.，(1984)Gene 2921-26)、pDL289(Buckley，N.，等.，(1995)J Bacteriol1775028-5034)、pSK+BLUESCRIPT(Stratagene，La Jolla，CA)；和pSUM系列分枝杆菌穿梭载体(Ainsa，J.A.，等.，(1996)Gene 17623-26)。在转座子或可动遗传元件待导入宿主(即靶)细胞的基础上，可选择类似的载体主链用于任何给定转座子或可动遗传元件。
对于TN4001，这种载体主链可包括(1)革兰氏阴性复制起点(可以是条件性的，如温度-敏感)、(2)革兰氏阳性复制起点(可以是条件性的，如温度-敏感)、(3)多接头区域和(4)转录终止区域。
实施例1描述了本发明示范转座元件的构建，转座子包括无启动子的发光蛋白编码序列。实施例2描述了将转座子导入一些载体中，这些载体对导入转座子到一些不同细菌中有用。实施例3描述了使用一种载体/转座子构建物以获得转化的生物发光菌落。由本发明方法转化的细胞从在固体培养基上高密度平板培养的菌落中分离，用眼检测和手工分离。
本发明的一方面中，载体主链具有转录终止序列，序列在转座子或可动遗传元件一边或两边的侧翼，这是为了防止在盒整合到宿主生物DNA前表达发光多肽。这种区域在本领域中已知。参见如Henkin，T.M.，(1996)Ann Rev Genet 3035-37；MacDonald L.E.，等.(1993)J.Mol.Biol.232-1030-1037；Jeng，S.T.，等.(1997)Can J Microbiol 431147-1156。
复制起点在革兰氏阴性和革兰氏阳性生物中都有功能的较佳实施方案中，革兰氏阴性复制起点的存在允许载体在革兰氏阴性生物中复制，从而在避免革兰氏阳性宿主生物的限制性内切酶系统时有助于操作插入序列，以及允许分离大量的载体构建物DNA。在此情况中，可选择标记可包括在载体中以有助于通过革兰氏阴性生物，其中所得DNA用于转化革兰氏阳性生物。可选择标记在宿主生物中用于通过载体以便获得一些DNA。在本发明的这一方面中，可选择标记不用于鉴定转座体(transposant)，筛选靶细胞中表达发光蛋白序列是用来鉴定转座体的筛选。
另外，可使用在革兰氏阳性和革兰氏阴性生物中都有功能的复制起点，如一些链霉菌质粒中的复制起点(如pCK1)。
携带转座子或可动遗传元件的载体中的复制起点可以是连续活性或是条件性的，如来自pE194的温度-敏感起点，如在pAUL-A穿梭载体中所发现的。将条件性复制起点包括在本发明载体构建物中的一个优点是这种元件使载体构建物在感兴趣生物中在容许条件下稳定，而当在限制性条件下生长时因子使宿主生物中的载体被“除去”(如转座发生后温度上升到非容许的水平)。
因此，用载体转化靶生物后，转化子通过它们产生光的能力来鉴定，载体含转座子或可动遗传元件(包括含启动子或无启动子的编码发光蛋白的序列)。通常在转化操作后，平板培养细胞并鉴定含产光细胞的平板区域。然后通过这些区域来提供更纯的转化细胞培养物，细胞表达发光蛋白编码序列。这种操作也可在液体或半固体培养物中进行，使用如微量滴定板。
2B.载体和质粒本明的方法可用于转化多种细胞类型，使用适当表达载体，载体包括选择的表达控制元件。可由本领域普通技术人员根据本说明书和表达载体领域中已知信息来选择用于任何给定细胞类型的适当载体和控制元件。
例如，发光蛋白编码序列可插入载体中，载体包括可操作连接于编码序列的控制元件，这使基因在选择细胞类型中表达。用于哺乳动物细胞表达的示范启动子包括但不限于SV40早期启动子、CMV启动子、HIV-LTR、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子(MMLV-LTR)、FIV-LTR、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)和单纯疱疹病毒启动子。其它非病毒启动子也可用于哺乳动物表达，如衍生自鼠金属硫蛋白基因的启动子。通常，转录终止和聚腺苷酸化序列也存在于翻译终止密码子的3’。优选的是也存在最优化翻译起始的序列，序列位于编码序列的5’。转录终止子/聚腺苷酸化信号的例子包括那些衍生自SV40以及牛生长激素终止子序列，如描述于Sambrook等.，同上。含剪接供体和受体位点的内含子也可设计到构建物中，用于本发明(Chapman等.，Nuc.Acids Res.(1991)193979-3986)。
增强子元件可用来提高哺乳动物载体构建物的表达水平。示范增强子包括但不限于SV40早期基因增强子，如描述于Dijkema等.，EMBO J.(1985)4761、衍生自劳斯肉瘤病毒的长末端重复(LTR)的增强子/启动子，如描述于Gorman等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982b)796777、和衍生自人CMV的元件，如描述于Boshart等.，Cell(1985)41521，如包括在CMV内含子A序列中的元件(Chapman等.，Nuc.Acids Res.(1991)193979-3986)。
合适的原核载体包括，例如质粒，如能在大肠杆菌(例如pBR322、ColE1、pSC101、PACYC184、itVX、pRSET、pBAD(Invitrogen，Carlsbad，CA)等)中复制的质粒。这种质粒由Sambrook披露(参阅《分子克隆实验室手册》(MOLECULARCLONINGA LABORATORY MANUAL)，第二版，Sambrook、Fritsch和Maniatis编，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989))且，许多这类载体可商业购买。杆菌质粒包括pC194、pC221、pT127等，并由Gryczan披露(《杆菌的分子生物学》TheMolecular Biology of the Bacilli)，Academic Press，NY(1982)，pp.307-329)。合适的链霉菌质粒包括pli101(Kendall等.J.Bacteriol.1694177-4183，1987)、链霉菌噬菌体如□C31(Chater等.，《第六届国际放线菌生物学讨论会》，AkademiaiKaido，Budapest，Hungary(1986)，pp.45-54)。假单胞菌质粒由John等(Rev.Infect.Dis.8693-704，1986)和Izaki(Jpn.J.Bacteriol.33729-742，1978)综述。
合适的真核质粒包括，例如BPV、EBV、牛痘、SV40、2微米环形、pcDNA3.1、pcDNA3.1/GS、pYES2/GS、pMT、pIND、pIND(Spl)、pVgRXR(Invitrogen)等或它们的衍生物。这种质粒在本领域中熟知(Botstein等.，Miami Wntr.SyTnp.19265-274，1982；Broach，在《酵母的分子生物学》生命周期和遗传”(TheMolecular Biology of the Yeast SaccharomycesLife Cycle and Inheritance)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，p.445-470，1981；Broach，Cell 28203-204，1982；Dilon等.，J.Clin.Hematol.Oncol.1039-48，1980；Maniatis，《细胞生物学》综合论文集(Cell BiologyA ComprehensiveTreatise)，第3卷，基因序列表达，Academic Press，NY，pp.563-608，1980。
发光蛋白编码序列可克隆到一些商业购买的载体中以产生发光多肽的表达，用作适当宿主系统中的转化标记。这些系统包括但不限于下列各项用于杆状病毒转化的载体，Reilly，P.R.，等.，《杆状病毒表达载体实验室手册》(BACULOVIRUSEXPRESSION VECTORSA LBORATORY MANUAL)(1992)、Beames，等.，Biotechniques11378(1991)，Pharmingen；Clontech，Palo Alto，CA)；用于细菌转化的载体，Ausubel，F.M.等.，《新编分子生物》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)，John Wiley和Sons，Inc.，Media PA，Clontech；用于酵母转化的载体，Rosenberg，S.和Tekamp-Olson，P.，美国专利号RE35,749，1998年3月17日出版，、Shuster，J.R.，美国专利号5,629,203，1997年5月13日出版、Gellissen，G.，等.，Antonie VanLeeuwenhoek，62(1-2)79-93(1992)、Romanos，M.A.，等.，Yeast8(6)423-488(1992)、Goeddel，D.V.，《酶学方法》(Methods in Enzymology)185(1990)、Guthrie，C.，和G.R.Fink，《酶学方法》194(1991)；用于哺乳动物细胞转化的载体，Clontech；Life Technologies/Gibco-BRL，Grand Island，NY、Haynes，J.等.，Nuc.Acid.Res.11687-706(1983)、Lau，Y.F.等.，Mol.Cell.Biol.41469-1475(1984)、Kaufman，R.J.，“在哺乳动物细胞中选择和共扩增异源基因”(Selection and coamplification of heterologous genes in mammalian cells)，《酶学方法》第185卷，pp537-566，Academic Press，Inc.，San Diego CA(1991)；和用于植物细胞转化的载体，植物克隆载体，Clontech Laboratories，Inc.，PaloAlto，CA和Pharmacia LKB Biotechnology，Inc.，Pistcataway，NJ，Hood，E.，等.，J.Bacteriol.1681291-1301(1986)、Nagel，R.，等.，FEMSMicrobiol.Lett.67325(1990)、AN等.，“二元载体”(Binary Vectors)、其它在《植物分子生物学手册》(Plant Molecular Biology Manual)A31-19(1988)，Miki，B.L.A.等.，pp249-265中的载体、另外的载体在《植物DNA感染剂》(Plant DNA Infectious Agents)(Hohn，T.，等.，编)Springer-Verlag，Wien，Austria(1987)、《植物分子生物学基本技术》(Plant MolecularBiologyEssential Techniques)，P.G.Jones和J.M.Sutton，NewYork，J.Wiley，1997、Miglani Gurbachan《植物遗传学和分子生物学词典》(Dictionary of Plant Genetics and Molecular Biology，New York，FoodProducts Press，1998、Henry，R.J.，《植物分子生物学的实践应用》(PracticalApplications of Plant Molecular Biology)，New York，Chapman&Hall，1997中。
包括发光蛋白编码序列的载体也包括有助于单位点重组到靶生物基因组的序列(如与一个或多个靶基因组中的位点同源的单个DNA序列用来促进整合)或有助于同源重组的序列(如两个与靶基因组中基因座同源的序列，其中两个序列在发光蛋白编码序列的侧翼(以及任何有关控制元件和更多感兴趣的序列)。一旦鉴定，可容易地分离靶序列，例如通过设计引物和用PCR扩增序列。然后扩增的产物可插入含发光蛋白编码序列的构建物中，例如需要待整合的侧翼序列。整合载体可以是环状或线状。此外，使用本发明的方法，携带发光蛋白编码序列的载体(和有关控制元件以及更多感兴趣的序列)可导入细胞中并通过转化靶细胞检测随机整合并鉴定转化子。
实施例4描述了用于白色念珠菌的整合基因组靶载体的构建，其中靶载体包括含发光蛋白编码序列的启动子。此外，实施例4描述了用此载体进行的转化实验。实施例4中的结果证明含发光蛋白编码序列的构建物可用作细胞中的报道基因构建物，这些细胞不适于可选择标记。实施例4中所述方法使用来自萤火虫(Photinuspyralis)的荧光素酶基因，该基因被改变使其在白色念珠菌中表达。通过筛选光产生来分离转化的白色念珠菌细胞，没有使用任何营养缺陷型或以药物为基础的选择。
本文所述的高密度筛选不包括选择且提供用于获得转化子的有效方法。成功的转化以约5×10-5到10-6频率发生(5-10个生物发光菌落/20平板；实施例4)。在大大过量的非转化细胞中鉴定转化子(即光产生细胞)是直接且可重复的。本文证明成功的转化已用来自ATCC的一些强毒株重复。在本发明的一个实施方案中，转化混合物在含荧光素酶的非选择培养基上平板培养。生长出一菌苔的细胞。使产生光的菌苔成像(使用例如Xenogen公司IVISTM成像系统(Xenogen公司，Alameda，CA))以鉴定包含和表达发光蛋白编码序列(如荧光素酶基因)的细胞区域。从平板上各明亮区域挑出四到八个小样品并用于接种过夜液体培养物。然后在微量滴定板的孔中用荧光素混合过夜培养物的小等分样品，评估各等分样品的光产生。稀释包括发光蛋白编码序列的过夜培养物并平板培养单菌落以获得单菌落分离物，发光蛋白编码序列含有/表达细胞。
因此这些结果证明含发光蛋白编码序列的构建物可用于高密度筛选以检测转化，此外可在整体动物中观察。
本发明的载体包括发光蛋白编码序列，可制成试剂盒。这种试剂盒的组成可包括但不限于容器、说明书、溶液、缓冲液、一次性使用物和硬件。示范硬件可包括强化的光子计数照相机或冷却的积分照相机。
因此，可使用以光为基础的筛选方法，而不使用常规选择或筛选方法来确定转化细胞中载体的存在。在一个实施方案(即含启动子的构建物)中，发光多肽编码序列置于感兴趣生物中活性启动子的控制下。这种控制元件可以是组成型或条件型的。例如，可操作连接于启动子序列的luxABCDE盒可导入合适载体中，启动子序列在感兴趣的靶生物中有功能。然后转化感兴趣生物并筛选所得生物产生光的能力。在此方法中，光产生用来鉴定感兴趣的转化子。光产生菌落(或菌斑)通常用标准方法(如，稀释平板例如用微量滴定孔，或单菌落划线)克隆(即物理分离)。本发明的一方面提供了包括发光多肽序列的载体，可操作连接于启动子序列，发光多肽序列在感兴趣的靶生物中有功能。使用这种载体提供了转化生物的方法，此类生物没有可用的可选择标记(如药物抗性标记)。
2C.制备发光蛋白构建物的方法本文所述的发光蛋白盒、转座子盒和穿梭载体构建物可用分子生物领域中已知的方法(参见，例如Ausubel，F.M.等.，《新编分子生物学》(CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY)、John Wiley和Sons，Inc.，Media PA，(1995)、或Sambrook等.，)根据本说明书的讲授来装配。通常，装配包括编码发光多肽序列的基因盒。启动子、控制元件和/或其它核苷酸序列也可在合适位点导入构建物中。
获得多核苷酸、合适调节序列和短的随机核苷酸序列的一个较佳方法是PCR。PCR的一般步骤讲授于MacPherson等.，《PCR一种实践方法》(A PRACTICALAPPROACH)，(IRL Press at Oxford University Press，(1991))。各应用反应的PCR条件可根据经验确定。一些参数影响反应的成功。这些参数是退火温度和时间、延伸时间、Mg2+和ATP浓度、pH、和引物、模扳及脱氧核糖核苷酸的相对浓度。示范引物(如寡核苷酸引物)描述于下面的实施例中。扩增后，可通过琼脂糖凝胶电泳接着用溴化乙锭染色和紫外照射目视来检测所得片段。另一种获得多核苷酸的方法是，例如酶消化。所需载体的组成可以任何合适方向和/或构型建立。
2D.将核酸导入靶细胞的方法将核酸导入细胞(或细胞的原生质体，如弱化或去除酵母或植物细胞壁)的方法对本领域技术人员已知，包括但不限于下列各项脂质-介导转移(如用脂质体，包括中性和阳离子脂质)、直接注射(微注射)、细胞融合、微粒轰击(例如生物射弹方法，如DNA粒子轰击)、共沉淀(如用磷酸钙或乙酸锂)、DEAE-葡聚糖-或聚乙二醇-介导转移和病毒载体-介导转移。
转化方法的选择通常取决于细胞类型和可用于该方法的核酸的量。转化后细胞可以促进筛选光产生的密度平板培养。细胞可以一些密度平板培养，例如通过制备一系列转化细胞群体的稀释度。细胞平板培养密度根据细胞类型不同；然而初始筛选一般优选高密度平板培养以提高在用转化方法处理的细胞群体中检测转化细胞的可能性。
本领域的普通技术人员可应用本发明以光为基础的筛选方法，结合本文给出的指导使用任何选择的转化方法。
3.在细胞培养中评估发光多肽序列如上面和实施例中所述的发光蛋白编码序列构建物可用于转化多种宿主细胞和分析成功的转化。合适宿主细胞包括但不限于真核生物(例如酵母，如白色念珠菌和酵母属)；植物细胞；哺乳动物细胞(如BHK、VERO、HT1080、293、RD、COS-7或CHO细胞)；组织特异性细胞；肿瘤细胞；昆虫细胞；原核生物如革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和其它不包括在前面分类的属(如立克次氏体属spp.；罗卡利马氏体属spp.；考克斯氏体属spp.；密螺旋体属spp.，包括引起梅毒的梅毒密螺旋体；枝原体属spp.和衣原体属spp.)。
关于革兰氏阴性宿主细胞，本发明的构建物可用来转化生物体包括但不限于下列各项梭菌属spp.、弧菌属spp.、布鲁氏菌spp.、博德特氏菌属spp.、弯曲杆菌属spp.、假单胞菌属spp.、埃希氏菌属spp.、肠杆菌属spp.、克雷伯氏菌属spp.、沙雷氏菌属spp.、柠檬酸细菌属spp.、变形杆菌属spp.、沙门氏菌属spp.、志贺氏菌属spp.和耶尔森氏菌属spp.。
关于革兰氏阳性宿主细胞，本发明的构建物可用来转化生物体包括但不限于下列各项
革兰氏阳性球菌家族微球菌利(微球菌spp.、口腔球菌属spp.、动性球菌属spp.和葡萄球菌属spp.)、异常球菌科(异常球菌属spp.)成员和其它球菌属的种类包括链球菌属spp(如化脓溶血链球菌spp.、口腔链球菌spp.、肠球菌spp.、乳酸链球菌spp.、厌氧链球菌spp.和其它链球菌种)；明串珠菌属spp.、片球菌属spp.、气球菌属spp.、孪生球菌属spp.、消化球菌属spp.、消化链球菌属spp.、瘤胃球菌属spp.、粪球菌属(Coprococcus)spp.和八叠球菌属的种。
形成内生孢子的革兰氏阳性杆菌和球菌包括芽孢杆菌属spp.、芽孢乳杆菌属spp.、梭菌属spp.、脱硫肠状菌属spp.、芽孢八叠球菌属spp.和颤螺菌属种。
规则、非芽孢的革兰氏阳性杆菌包括乳酸菌属spp.、李斯特氏菌属spp.(包括在食品、饮用水中和食品制剂表面上作为污染物发现的致病种单核细胞增生李斯特氏菌、丹毒丝菌属spp.、索丝菌属(Brochothrix)spp.、肾杆菌属spp.、库特氏菌属spp.和显核菌属的种。
不规则、非芽孢的革兰氏阳性杆菌包括棒状杆菌属(包括棒状杆菌的植物致病种，加德纳氏菌属spp.、隐秘杆菌属spp.、节杆菌属spp.、短杆菌属(Brevibacterium)spp.、短小杆菌属spp.、乳酪杆菌属spp.、微杆菌属(Microbacterium)spp.、金杆菌属(Aureobacterium)spp.、纤维单孢菌属spp.、壤霉菌属(Agromyces)spp.、球网菌属spp.、罗氏菌属spp.、丙酸杆菌属(Propionibacterium)spp.、真杆菌属spp.、醋杆菌属spp.、毛螺菌属spp.、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)spp.、好热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)spp.、放线菌属spp.和双岐杆菌属的种。
分枝杆菌科家族的生物体，即分枝杆菌属spp.。
诺卡氏菌形包括诺卡氏菌属spp.、红球菌属(Rhodococcus)spp.、类诺卡氏菌属spp.、假诺卡氏菌属spp.、厄氏菌属spp.、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)spp.、小多孢菌属(Micropolyspora)spp.、原小单孢菌属spp.和间孢囊菌属的种。
特别感兴趣的生物体包括梭菌属spp.、弧菌属spp.、布鲁氏菌属spp.、博德特氏菌属spp.、弯曲杆菌属spp.、假单胞菌属spp.、埃希氏菌属spp.、肠杆菌属spp.、克雷伯氏菌属spp.、沙雷氏菌属spp.、柠檬酸杆菌属spp.、变形杆菌属spp.、沙门氏菌属spp.、志贺氏菌属spp.和耶尔森氏菌属spp.。
原核细胞和真核细胞的转化方法在本领域已知(如Sambrook等)，包括但不限于磷酸钙沉淀、显微注射或电穿孔。含合适调节元件和多克隆位点的载体可广泛地在市场上购得(如Stratagene，La Jolla，Calif.；Clontech，Palo Alto，Calif.)且可用作主链载体来携带发光蛋白编码序列。
如上所述，本文所述的一些表达盒需要加入外源底物用于产生光(如luc和luxAB表达盒)。在本发明的一个实施方案中，底物是醛。当给予细胞时，醛可作为蒸气应用于培养基周围空气中或者作为液体或固体直接用于培养基。
检测和量化光产生用例如强化的光子计数照相机(HamamatsuPhotonics2400-32型)完成。具体有助于用本发明方法产生筛选的转化子的一个系统是Xenogen公司的IVISTM成像系统(Alameda，CA)。IVISTM成像系统包括一个高度敏感的照相机(如冷却的积分照相机(Roper Scientific LN/CCD 1300-EB/1型；Spectral Instruments 620型冷却的CCD照相机，从SpectralInstruments，Inc.，Tucson，Arizona)购得、一个特别设计的成像室和运行它的软件。此外，LivingImageTM软件分析、建立和存储数据。系统组成的标准说明如表1各项。
表1

多个发光蛋白编码序列可用本文所述构建物和方法掺入单个生物体中。在一个实施方案中，各盒可编码发光多肽，这些多肽在相对彼此不同的特征波长发射光。另外，可使用一些携带发光多肽的盒，多肽在特征波长发射光。盒的组合包括发光蛋白编码序列，有多种这类在不同特征波长发射光的发光多肽的混合物，盒的组合可根据本说明书的讲授来构建。
4.动物中荧光素酶表达载体的评估除了本发明用于转化选择细胞或细胞类型的构建物和方法外，携带包括发光蛋白编码序列的构建物的微生物对在整个动物中非侵袭性成像有用。在整个动物中非侵袭性成像描述于Contag等.共同拥有的美国专利号5,650,135(也参见Contag等.，(1998)Nature Medicine 4(2)245-247；Contag等.，(1996)OSA TopsonBiomedical Optical Spectroscopy and Diagnostics的3220-224；Contag等.，(1997)Photochemistry and Photobiology，66(4)523-531；和Contag等.，(1995)Mol.Microbiol.18593-603)。
在成像方法中，偶联物含生物相容实体(如携带本发明构建物的转化细菌整合到其基因组中)和产光部分(如荧光素酶)。光发射偶联物一般通过多种方法之一给予受试者，可在受试者中定位并成像。由于成像或测量受试者的光子发射可持续至几十分钟，受试者在成像过程中通常但未必固定。
光发射实体的成像包括使用能检测非常低水平光的光检测器-通常是单个光子-和结合光子发射，直到可构建出图像。这种敏感光检测器的例子包括在单个光子被照相机检测前强化单个光子的装置，照相机(例如用液氮冷却)能在检测系统内在的背景噪声上检测单个光子。
一旦产生光子发射图像，它通常表现为叠加在受试者“照相”反射光图像上的伪彩色图像，以提供发射光子来源的参考框架(即根据受试者定位光发射偶联物)。然后分析这种“合成”图像以确定受试者中报道基因的位置和/或表达水平。
4A.动物感染本文所述盒对在动物中评估各种原核和真核细胞有用。例如，所述盒可整合到致病生物(如假丝酵母、革兰氏阳性菌等)的基因组中并随后导入整个动物中。接着动物可用于进行体内感染过程并评估潜在的抗感染药物抑制感染的效率，如新的抗生素。因此，一方面，本文所述表达盒对非侵袭性成像和/或检测哺乳动物受试者(如用携带荧光素酶表达盒的细菌或真菌细胞感染)中的光发射偶联物有用。转化细胞可给予受试者这样它们定位于细胞或组织类型。另外，可给予转化细胞使它们均一地分布在受试者中。
4B.底物给予如上所述，本文所述的一些表达盒需要加入外源底物(如萤光素)用于产生光(如luc和luxAB表达盒)。在本发明的一个实施方案中，底物是醛。底物也可给予整个动物。可根据经验确定各试验动物系构建的适当底物浓度。底物(通常是萤光素)可在给予感兴趣的分析物前、同时、或之后给予。底物的给予途径可如分析物所述的途径。底物给予的优选途径包括但不限于静脉内或局部给予或者通过在空气中提供底物，例如作为一种蒸汽提供。
5.本发明构建物的使用一方面，本发明针对含启动子或不含启动子的发光蛋白编码序列构建物用作各种细胞类型的转化载体。本发明可鉴定本发明构建物成功地导入其中的细胞。本文所述此方法使用光产生作为转化的报道基因，尤其是用于转化的细胞类型没有已知的可选择标记可用，例如抗生素抗性细菌、没有营养缺陷型标记的酵母。本发明的转化方法包括下列步骤。首先制备所需靶细胞的细胞群体，然后用发光蛋白编码序列转化细胞，转化用本领域已知的方法，例如(钙沉淀；聚乙二醇沉淀；乙酸锂/聚乙二醇转化，Braun和Johoson(1997)Science 277(5322)105-9；和电穿孔，De Backer，Maes等.，(1999)Yeast 15(15)1609-18)。鉴定具有吸收发光蛋白编码序列构建物并表达发光蛋白的细胞，例如用成像系统。通常进一步纯化转化细胞以产生转化细胞的基本上纯的培养物，例如通过稀释平板或单菌落划线。
在本发明的一方面中，使用无启动子的发光蛋白编码序列构建物。在此情况中，发光蛋白编码序列的表达通常取决于整合到靶细胞基因组中，最普遍的整合是邻近靶细胞中活性转录控制元件。
在本发明的另一方面中，使用含启动子的发光蛋白编码序列构建物。在此情况中，发光蛋白编码序列可整合到靶细胞的基因组中或在质粒上进行(或其它附加体或染色体外载体)。
本发明的盒在多种应用中有用。例如，它们可结合感兴趣的基因或核酸序列用于测定靶细胞是否转化感兴趣的基因或核酸序列。换句话说，光用作为指示成功的靶细胞转化(如致病生物)的指示器，这是通过例如电穿孔或者噬菌体-介导的转导或接合。这在不能使用可选择标记(如药物抗性)的细胞中特别有用，可选择标记通常用于分析转化。
也可使用转化子来鉴定有效的药剂和确定它们的作用点。分离出成功转化的靶细胞后，靶细胞可然后用于感染多组实验动物，每组含一个或多个感兴趣的基因或核酸序列和/或活性启动子。然后用感兴趣的药剂处理组，监控实验动物和感染、未处理对照动物的光产生。有效抑制转录和/或翻译(直接或间接)或干扰转化细胞发挥正常功能能力的试剂抑制处理的实验动物中的光产生，而在相应感染的未处理对照动物中观察到光产生。另外，也可鉴定提高光产生的化合物。
如本发明讲授的修饰产生光的生物体可用来监控微生物的存在，例如在感染、食品、饮用水中和食品制剂表面上监控。
具体来说，本发明的方法对核酸(如DNA)导入细胞中有用，在这些细胞中选择转化子是困难的，例如致病真核生物(如假丝酵母)和抗生素抗性细菌，包括但不限于医院病原体(如二甲氧基苯青霉素抗性菌株金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和其它抗生素抗性肠球菌)。
下面是产生本发明的具体实施方案的例子。提供这些例子仅用于说明目的，不想以任何方式限制本发明的范围。
材料和方法除非另有说明，细胞、蛋白质和核酸(如DNA)的操作用标准方法进行，方法描述于如Sambrook，等.，和Ausubel，F.M.等.，《新编分子生物》(CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)，John Wiley和Sons，Inc.，Media，PA(1995)。除非另有说明，限制性酶从New England Biolabs获得，修饰酶从Promega或Boehringer Mannheim获得，其它实验室化学品从Sigma ChemicalCompany(St.Louis，MO)获得。
我们努力确保所用数字(如量、温度等)的准确性，但当然应该允许一些实验误差和偏差。
在外源醛存在的情况下体外筛选在不含luxCDE基因的细菌平板或培养物成像前加入外源醛底物。对于平板成像，n-癸醛(癸醛；Sigma Chemical Company)铺在覆盖平板的盖的内表面上，平板含待成像的细菌(“醛蒸汽成像”)，然后平板用强化的CCD照相机(HamamatsuPhotonics 2400-32型)成像，如美国专利5,650,135所述。对于液体培养物成像，加入1μl的1％癸醛溶液(在50％乙醇中)到1ml的适当10倍稀释的培养物中。
制备DNA和克隆除非另有说明，用一种或多种限制性内切酶消化后，DNA样品加热到85℃，15分钟以使限制性酶失活。连接在16℃过夜进行。
转化细菌细胞制备感受态细胞。除非另有说明，细菌细胞转化如下。细菌培养物在LB中生长过夜。用5ml的各培养物接种新鲜的500ml LB。这些培养物在37℃振摇直到O.D(600nm)达到约0.6。然后细胞在冰上冷却30分钟，然后3000xg、4℃离心10分钟收集。细胞重悬浮在50ml冷的0.5M蔗糖(金黄色葡萄球菌)或ddH2O(大肠杆菌)中，随后再离心并再悬浮在5ml冷的0.5M蔗糖(金黄色葡萄球菌)或ddH2O(大肠杆菌)中。在此阶段，细胞在冰上放置30分钟，然后再离心并再悬浮在5ml冷的10％甘油中。冷冻各细胞类型的等分样品并保存在-80℃。
电穿孔。质粒DNA用Qiagen柱纯化、透析、用“Gene Pulser”(BioRad)电穿孔到感受态细胞中。设置是25μF、2.5kV，100ohms电阻用于金黄色葡萄球菌或400ohm电阻用于大肠杆菌和肺炎链球菌(S.pneumoniae)。细胞在37℃1ml的培养基中复原2小时，然后铺在含必需的选择抗生素的合适琼脂上。
样品成像样品成像基本上如Contag，等描述.，美国专利5,650,135，具有较小修改如以下所述。
在支持本发明所进行的实验中(下面详述)，样品产生光的量用强化的光子计数照相机(Hamamatsu Photonics 2400-32型)或冷却的集成照相机量化。关于冷却的积分类型照相机，所用的具体仪器选自三种制造/型号(1)PrincetonInstruments LN/CCD 1340-1300-EB/1型；(2)Roper LN-1300EB型冷却的CCD照相机(购自Roper Scientific，Inc.，Tucson，Arizona)；和(3)Spectral Instruments600型或620型冷却的CCD照相机(购自Spectral Instruments，Inc.，Tucson，Arizona)。优选设备分别是Hamamatsu Photonics照相机编号XEN-3和Princeton Instruments照相机编号XEN-5，两者位于Xenogen公司，Alameda，California。两种照相机类型都使用电荷-偶联装置列(CCD列)来产生与各选择单位区域光子数目成比例的信号。选择单位区域可以小到由单个CCD像素检测，或如果使用重新分级(binning)，由任何选择的像素组检测。信号可任选地通过一个图像处理器，如来自Hamamatsu Photonics的Argus，然后发送给计算机(运行Windows NT的个人计算机(Dell Computer公司；Microsoft公司，Redmond，WA)或运行图像处理软件应用的Macintosh(Apple Computer，Cupertino，CA)，如“LivingImage”(Xenogen公司，Alameda，CA)。软件和/或图像处理器用于获得图像，作为计算机数据档案保存。数据一般采用(x，y，z)值形式，其中x和y代表信息收集的点或区域的空间坐标，z代表点或区域的信号量，以“相对光单位”(RLUs)表示。
为有利于判读，数据通常显示为“伪彩色”图像，其中色谱用于表示具体点的z值(信号量)。此外，伪彩色信号图像通常叠加在反射光或“照相”图像上以提供参考的框架。
将会意识到如果信号在用稳定光-发射标准校准的照相机(购自，如Xenogen公司)上获得较佳，任何照相机的RLU信号值可与任何其它用相同光-发射标准校准的照相机的RLUs比较。此外，校准用于绝对光子通量(单位时间发射自单位区域的光子)光-发射标准后，本领域技术人员可将任何这种照相机的RLU值转换成光子通量值，然后可估计每单位时间样品中转化细胞发射的光子量。
用96-孔微量滴定板量化光输出通过平板稀释溶液到96-孔板的孔中定量溶液中细胞产生光的量，如上所述在Xen-3照相机中成像平板。然后使用LivingImage软件在各图像区域周围叠加定义的边界，显示与来自具体孔的光相应的信号。然后量化来自各个这些区域的信号，信号作为各孔的单一RLU值表示。这些RLUs用于下面详述的一些研究中，包括实施例13、14和15。
实施例1构建革兰氏阳性lux转座子Tn4001 luxABCDE kmRluxABCDE kmR构建如下来自pDL289(Buckley，N.D.等.(1995)J.Bacteriol.1775028-5034)的革兰氏阳性卡那霉素盒用引物KanF2(5’-CTG TAGACT CGA GGA GGG AAA TAA TAA ATG GC；SEQ ID NO1；粗体字母代表XhoI位点)和KanR2(5’-CAG AGT GTC GAC AGT TGC GGA TGT AC；SEQ ID NO2；粗体字母代表SalI位点)PCR扩增。扩增用30个在90℃15秒、50℃30秒和72℃2分钟的加热/冷却循环进行。
所得扩增产物提供了一个无启动子的kmR抗生素抗性基因。扩增产物然后用XhoI/SalI切割并连接到pSK-luxABCDE质粒构建物的SalI位点中(更多关于质粒构建的细节参见共同待批和共同拥有的申请美国序列号09/657,289)，SalI位点直接在luxABCDE盒的下游。
pSK luxABCDE kmR质粒构建物电穿孔到大肠杆菌DH5α细胞中，且转化细胞铺在含25μg/ml卡那霉素的LB平板上。37℃培养过夜后，用光子计数CCD照相机(Hamamatsu Photonics，Shizuoka具，Japan；2400-32型)筛选所得转化株的光产生(参见材料和方法)。大肠杆菌(革兰氏阴性)中卡那霉素和生物发光的表达都由pBluescript II SK+或SK-载体主链中发现的lacZ启动子介导。DNA从生物发光菌落中制备。卡那霉素盒(即编码序列)相对于luxABCDE编码序列的正确方向通过用限制性酶消化具有SalI的DNA和分析所得限制性图式来确定。
为构建含lux和kmR基因的Tn4001盒，luxABCDE kmR盒从pSK luxABCDE kmR构建物中切除，用SpeI/SalI如上制备。片断末段用核苷酸补平以产生平端分子。这些分子连接到质粒pMGC57(Lyon等.(1998)EMBO J.176263-6275)的EcoRV位点中且构建物电穿孔到DH5α细胞中。转化细菌铺在含15μg/ml氯霉素的LB平板上。筛选所得转化子的光产生、氯霉素-抗性(CmR)和卡那霉素-抗性(KanR)。DNA从产光、CmR、KanR菌落中制备。luxABCDEkmR盒的正确方向，即luxA序列5’端定位相对于Tn4001转座子5’端，通过限制性消化(XhoI/NdeI和XhoI/EcoRV)和限制性图式分析以及PCR分析DNA来证实。PCR用引物MGC-CAT-F1(5’-GGT GTC CCTGTT GAT ACC G-3’，SEQ ID NO3)和LuxA-Rev(5’-CCA CAC TCC TCA GAG ATG CG-3’，SEQ ID NO4)在同上详述的条件下进行。用片断大小鉴定正确的方向。
实施例2Tn4001 luxABCDE kmR穿梭载体构建物的构建A.构建pAUL-A Tn4001 luxABCDE kmR穿梭载体含lux和kmR基因的Tn4001盒(命名为IR luxABCDE kmRtnp IR，其中IR代表反向重复，tnp代表编码Tn4001转座酶的基因)插入广范围穿梭载体中，载体具有革兰氏阴性复制起点和革兰氏阳性复制起点(组成型或条件型，如温度敏感)。这种穿梭载体的一个例子是pAUL-A载体(Chakraborty，等.(1992)J.Bacteriol.174568-574)，它含有在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中都有功能的红霉素抗性基因。此载体含革兰氏阴性复制起点和温度敏感pE194革兰氏阳性复制起点。
本发明转座子盒的图示如下。反向重复(IR)一般指示转座因子的末端。相应地，转座子的名称是IR-tnp-IR，其中tnp代表编码转座酶的基因。更多的因子可加入转座子中并类似的表示，如luxABCDE kmR盒的加入图示为IR luxABCDE kmRtnp IR。
IR luxABCDE kmRtnp IR盒用酶EcoRI/XhoI从pMGC57中切除并连接到pAUL-A穿梭载体的EcoRI/SalI位点中以产生穿梭载体构建物pAUL-A Tn4001 luxABCDEkmR。
通过电穿孔用穿梭载体构建物转化大肠杆菌(DH5α)，铺在含浓度为150μg/ml红霉素的LB平板上，37℃培养过夜。筛选所得转化子的光产生、红霉素抗性(EmR)和卡那霉素抗性(KanR)。然后从产光、ErR、KanR菌落中分离质粒DNA。
B.构建pSK Tn4001 luxABCDE kmRpE194穿梭载体除了用pAUL-A作为Tn4001 luxABCDE构建物的传递系统，质粒pSK和pE194可组合使用。
Tn4001盒从pMGC57移入pSK如下Tn4001盒用XhoI/PstI从pMGC57切割并与类似酶切的pSK连接。此连接电穿孔到感受态大肠杆菌DH5α中，转化子在含100μg/ml氨苄青霉素、IPTG、X-gal的LB上选择。通过PCR筛选白色菌落，PCR使用的引物包括来自Tn4001转座酶基因的序列。PCR指示为阳性的菌落是预制备质粒，且这些DNA用XhoI/PstI切割以确定它们含正确大小的片断。
luxABCDE kmR盒然后移入pSK Tn4001这样它位于两个IR序列间。首先，氨苄青霉素盒用酶AhdI/KpnI从pSK luxABCDE kmR去除(为了协助随后克隆lux盒到pSK Tn4001中)。然后luxABCDE kmR盒用BamHI/XhoI从氨苄青霉素缺失的pSK主链中切除。接着pSK Tn4001 DNA用EcoRV切割并与平端luxABCDE kmR盒连接。
连接电穿孔到感受态大肠杆菌DH5α中，转化子在含100μg/ml氨苄青霉素的LB上选择。光转化子斑点在氯霉素或卡那霉素上。阳性克隆的正确方向通过PCR确定，PCR使用引物M13F和LuxA-R。
其次，pSK Tn4001 luxABCDE kmR用SacI线性化且是平端。最后，此DNA与平端ClaI-酶切的pE194连接，得到pSK Tn4001 luxABCDE kmR pE194穿梭载体构建物。
此构建物电穿孔到感受态大肠杆菌DH5α中。转化子在含150μg/ml红霉素的LB上选择。然后所得光克隆斑点在含100μg/ml氨苄青霉素的LB和含50μg/ml卡那霉素或15μg/ml氯霉素的LB上。
C.构建pE194 Tn4001 pSK luxABCDE kmR穿梭载体构建Tn4001 luxABCDE kmR穿梭载体，其中革兰氏阴性起点位于两个IR序列的内部。首先，含质粒pMGC57的革兰氏阴性Tn4001与革兰氏阳性红霉素抗性质粒pE194融合。pMGC57用PstI/BamHI切割且是平端。同时pE194用ClaI切割且是平端。然后连接这两个线性质粒，且此混合物电穿孔到感受态大肠杆菌DH5α中，转化子在含150μg/ml红霉素的LB上选择。
第二，氯霉素抗性盒和革兰氏阴性起点从pMGC57/pE194组合物中去除。从上述一些红霉素抗性菌落中纯化的质粒DNA用KpnI/XhoI切割(氯霉素抗性盒和革兰氏阴性起点的侧翼位置)，且各消化物的部分在琼脂糖凝胶上展开以鉴定正确大小的质粒。然后大小似乎正确的质粒消化的剩余物是平端的并连接。此连接电穿孔到金黄色葡萄球菌N4220中，并铺在含0.3μg/ml红霉素的巧克力琼脂上。
最后，将pSK luxABCDE km质粒导入Tn4001的IR中。质粒DNA从10个pMGC57/pE194 ori cmR金黄色葡萄球菌克隆中纯化，质粒DNA用EcoRV切割且各消化物的部分在琼脂糖凝胶上展开以鉴定正确大小的质粒。然后显示正确大小(约6kb)的质粒消化的剩余物与平端BamHI切割的pSK luxABCDE kmDNA连接。此连接电穿孔到DH5α中，且转化子在含150μg/ml红霉素的LB上选择。然后生物发光菌落以双份斑点在含50μg/ml卡那霉素或100μg/ml氨卡青霉素的LB平板上以确定后一个抗生素盒的活性。由于pSK luxABCDE km以正确方向连接到前一个质粒的概率应为约50％，所以判定这种变体可通过金黄色葡萄球菌中的表型鉴定(只有以正确方向具有lux的质粒转座作用后产生生物发光)。
实施例3高密度筛选生物发光转座体除了使用选择性培养基，生物发光菌落以高密度从铺在固体培养基上的菌落中分离，用眼检测和手工分离。
金黄色葡萄球菌8325-4细胞用pE194 Tn4001 luxABCDE转化，以每平板104到105细胞的密度铺在固体非选择性培养基平板上，37℃生长过夜。用ICCD照相机检测强生物发光的单菌落，用一次性微量移液管头挑出那些菌落；所需菌落的发光表型用照相机确定。菌落用于接种一体积的液体生长培养基，然后在新鲜培养基平板上划线。平板在37℃过夜培养。重复过程直到确定分离到纯菌落，是通过观察到划线平板上单菌落中基本上一致的光强度确定的。
前述示范的方法避免需要抗生素选择作为分离感兴趣生物的方法，这些生物用本发明的转座子盒转化。
实施例4构建用于白色念珠菌的整合基因组靶载体，转化和筛选白色念珠菌，使用转化的菌株A.载体构建为了在白色念珠菌中表达荧光素酶，荧光素酶基因可读框(ORF)中的CTG密码子改变如下。首先，pGL2-Basic中的荧光素酶基因切成两段以促进所有九个CTG密码子突变成TTG密码子。一个片断含四个CTG密码子且另一个含五个CTG密码子。这些分别克隆到pBluescript II KS(+)中。用QuikChangeTM定点突变试剂盒(Stratagene)改变密码子。每个突变步骤后，测序产物以确定掺入所需突变。
简言之，含Photinus pyralis荧光素酶基因的质粒pGL2-Basic(Promega)用XbaI和EcoRI限制性酶切，含四个荧光素酶基因可读框中CTG密码子的540bp片断被克隆到pBluescript II KS(+)(Stratagene)中。含另外五个CTG密码子的第二个751bpEcoRI-EcoRV片断单独克隆到pBluescript II KS(+)中。这九个CTG密码子用QuikChangeTM定点突变试剂盒(Stratagene)突变成TTG。构建互补引物对和定点突变试剂盒一起使用。图1显示用于定点突变荧光素酶的互补寡核苷酸对。这些寡核苷酸用于通过定点突变使沉默突变掺入质粒pGL2-Basic的Photinuspyralis荧光素酶基因中。粗体突出的寡核苷酸是从CTG变成TTG所需的变化。有下划线的核苷的是引物稳定所需的碱基变化。这些变化不影响蛋白质的氨基酸序列。此外，对于引物RR45T和RR45B，两个CTG到TTG的突变足够接近这样两者在一个反应中掺入。
突变所有九个密码子后，含突变的XbaI-EcoRI和EcoRI-EcoRV片断从pBluescript II KS(+)中切除，并克隆回pGL2-Basic中以产生pLucT9。
除了修饰荧光素酶密码子，也制备构建物以来包括启动子和聚腺苷酸化信号，两者均衍生自假丝酵母。为此，pBluescript II KS+用NotI切割，补平末端，磷酸化的AscI接头(5’-AGGCGCGCCT-3’；SEQ ID NO21)连接到平端位点以产生pBS-ASC。含九个TTG密码子的荧光素酶可读框通过PCR从pLucT9扩增，PCR用引物LUCB和LUCP(图2A)，生成的产物含侧翼直接有BamHI和PstI位点的修饰荧光素酶可读框。扩增产物用BamHI和PstI限制性酶切并克隆到pBS-ASC中以产生质粒pBS-L。白色念珠菌肌动蛋白(ACT1)基因的转录终止区域(Delbruck和Ernst(1993)Mol Microbiol 10(4)859-66)用引物ACT-TP和ACT-TH(图2A)通过PCR从CAI4基因组DNA扩增，用PstI和HindIII切割，并连接到pBS-L中以产生pBS-LA。
白色念珠菌烯醇酶基因(ENO1)的启动子(Sundstrom和Aliaga(1992)JBacteriol 174(21)6789-99)用引物ENOA和ENOB(图2A)通过PCR从白色念珠菌菌株CAI4 DNA扩增。选择ENO1启动子是因为它显示有不可调节的组成型表达(Postlethwait和Sundstrom(1995)J Bacteriol 177(7)1772-9)。
扩增的PCR产物用AscI和BamHI切割并克隆到用相同限制性酶切的pBS-LA中以产生pBS-ELA。因此，融合ENO1启动子以通过立即插入荧光素酶起始密码子上游的BamHI位点来改变荧光素酶可读框。PstI位点立即置于荧光素酶基因的终止密码子后。
pBluescript II KS(+)从NotI位点到XhoI位点的多克隆位点用含限制性酶位点NotI、AscI、HindIII、FseI、SbfI和XhoI的合成接头置换(图2A；合成接头A，SEQ ID NO34；合成接头B，SEQ ID NO35；和图2C显示这两种合成接头的互补对)以产生pBS-NX。启动子-荧光素酶-终止子盒用AscI和HindIII从pBS-ELA中切除，并克隆到pBS-NX中以产生pNX-ELA。用引物URAH和URAF(图2A)通过PCR从白色念珠菌-大肠杆菌穿梭质粒pRC2312(Cannon(1992)，同上)扩增URA3基因。扩增的产物用HindIII和FseI切割并连接到pNX-ELA中以产生pNX-ELAU。
对于ura3∷imm434/ura3∷imm434 CAI4菌株中的中间试验，靶载体包含完整白色念珠菌URA3基因，URA3基因使细胞恢复尿嘧啶原养型。在高密度筛选中(见下)，URA3功能的选择不用临床分离菌ATCC 32032、10261和90234进行。
所有质粒分离和酶反应在标准条件下(Ausubel，同上；Sambrook，同上)或根据生产商的说明书进行。所有连接电穿孔到大肠杆菌菌株DH5α(LifeTechnologies，RockvilleMD)中，并在每ml含100μg氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基中生长。PCR用GeneampPCR系统9700自动热循环仪(AppliedBiosystems)进行。反应在薄壁200μl的PCR管中以50μl体积进行，50μl体积中含25μl pmole的各寡核苷酸引物(Operon)、5μl的10×PCR缓冲液(和Taq DNA聚合酶一起提供；Life Technologies)、2mM MgCl2、0.2mM的各脱氧核苷三磷酸(dCTP、dGTP、dTTP和dATP；Amersham)、1U的Taq DNA聚合酶(Life Technologies)和1ng的模板DNA。扩增在下列条件下进行于94℃30秒、50℃30秒、72℃1-2分钟的40个循环(取决于产物的预期大小)和72℃5分钟的最后延伸步骤。在PCR产物的限制前，反应混合物通过旋转柱(PCR纯化试剂盒；Qiagen)。
也选择白色念珠菌靶序列并插入载体中。构建靶载体时，六个含白色念珠菌基因组DNA的粘粒序列从GenBank下载(登记号AL033501、AL033497、AL033503、AL033502、AL033396和AL033391)。从序列数据注解推定的可读框用DNA构建试剂盒2TM(Textco，West Lebanon，NH)绘图。检测不含任何推定可读框的一些约3kb的区域的重复假丝酵母序列(Chibana，Magee，等.，(1998)Genetics 149(4)1739-52)或与其它可能可读框(ORFs)同源的序列。不含任何推定可读框的大区域(~3kb)被分成500bp部分且各部分用于那时所有已知的假丝酵母序列的blast搜索(Altschul，S.F.等.，(1990)J Mol Biol 215(3)403-10；Altschul，S.F.等.，(1997)Nucleic Acis Res.25(17)3389-3402)(Stanford DNA测序和技术中心网址在http//www-sequence.stanfod.edu/group/candida.)与已知基因或重复序列显著同源的区域从考虑中去除。选择粘粒CA41C10(GenBank登记号AL033501)中从核苷酸2356到5858的区域。在此3502bp区域中，第一个和最后一个1000bp从考虑中去除以致不包括任何可存在于邻近可读框的启动子。所选用于载体的5’和3’靶区域的片断是由在假丝酵母基因组中的125bp分离的。所用菌株的基因组靶区域从PCR产物中测序，PCR产物扩增自基因组DNA。公布的粘粒序列中的区域和ATCC 32032相同，除了ATCC 32032在核苷酸4745有腺嘌呤残基而不是鸟嘌呤残基。其它三个菌株在核苷酸3942有鸟嘌呤、在核苷酸4645有胸苷和有核苷酸4007-4131的串联重复。
选择靶区域克隆到靶载体中，靶载体在荧光素酶表达盒和URA3基因的侧翼。具体来说，CA41C10的核苷酸3852到4307用引物TAR5N和TAR5A(图2B)通过PCR从CAI4 DNA中扩增。扩增产物用NotI和AscI切割并克隆到pNX-ELAU中以产生pNX-5ELAU。另一个从核苷酸4436到4789的区域，用引物TAR3F和TAR3S(图2B)通过PCR从CAI4 DNA中扩增。扩增产物用FseI和SbfI切割并克隆到pNX-5ELAU中以产生pGTV-Eno。KpnI位点位于各个这些靶区域外端附近。使用构建物转化白色念珠菌前，构建物用KpnI切割。
pGTV-ENO的构建图示于图3A、3B和3C。
B.转化白色念珠菌菌株靶构建物然后用于转化白色念珠菌，使用Braun和Johnson的方法修饰(Braun和Johnson(1997)Science 277(5322)105-9)(http//www.sacs.ucsf.edu/home/Johnson Lab/burk/burk.html)，该方法用于所有白色念珠菌转化。100ml培养物在添加50mg/ml尿苷(Sigma)的YPD中生长，30℃过夜。过夜细胞培养物用相同的培养基稀释并生长到OD600为1-1.5。细胞以4000rpm 5分钟沉淀并重悬浮于20ml LATE缓冲液(100mM乙酸锂、10mM Tris-HCl(PH7.5)、1mM EDTA)。细胞再次沉淀并重悬浮于1ml LATE缓冲液。混合100μl细胞和10μl的10mg/ml变性、剪切的鲑精DNA(Sigma)及1-10μ KpnI消化的质粒DNA。加入700μl PLATE(在LATE缓冲液中的40％聚乙二醇3350)并用微量移液管温和混合。转化反应在30℃温育3小时并在42℃热激45分钟。沉淀细胞并重悬浮于400μl YPD中，铺在含萤光素的非选择性培养基上。
白色念珠菌CAI4(ura3∷imm434/ura3∷imm434)(Fonzi和Irwin(1993)Genetics 134(3)717-28)由美国明尼苏达大学Judith Berman博士友情提供。白色念珠菌菌株ATCC 32032、10261和90234获得自美国模式培养物保藏所(Manassas，VA)。YPD培养基(Qbiogene，Carlsbad，CA)含2％(w/v)蛋白胨、1％(w/v)酵母膏和2％(w/v)葡萄糖。合成的已知成分(SD)(Qbiogene)培养基含0.17％(w/v)没有氨基酸的酵母氮碱基、0.5％(w/v)硫酸铵、2％(w/v)葡萄糖和0.077％(w/v)没有尿嘧啶的完全补充混合物(CSM-ura)。CSM-ura的配方组成以mg/L给出如下腺嘌呤10；L-精氨酸50；L-天冬氨酸80；L-组氨酸-HCl 20；L-异亮氨酸50；L-亮氨酸100；L-赖氨酸50；L-甲硫氨酸20；L-苯丙氨酸50；L-苏氨酸100；L-色氨酸50；L-酪氨酸50；和缬氨酸140；总共770mg。加入770mg(.77g)此粉末到1L的SD中以产生SD-ura。为在平板上生长，加入琼脂(Difco，BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)至1.5％(w/v)。
C.高密度筛选为了高密度筛选，转化细胞用线性化的pGTV-Eno构建物转化，且转化细胞重悬浮于1ml YPD中，铺在20个140mm补充50μg/ml尿苷的SD-ura平板上，平板含600μg/ml萤光素(Biosynth，Naperville，IL)(以约2.5×105细胞/平板的密度)，30℃生长过夜。铺在此培养基上提供更好的光产生(相对于细胞铺在YPD培养基上)。所用培养基允许未转化和类似的转化细胞生长，因此不提供选择性压力。结果，一菌苔细胞在各平板上生长。
第二天早上平板在IVISTM成像系统上成像5分钟，使用IVISTM成像系统(Xenogen公司)。使用LivingImageTM软件(Xenogen公司，Alameda，CA)来获得和分析图像。在一些情况中，液体培养物和平板用光子计数强化的电荷偶联装置(ICCD)照相机(2400-32型，Hamamatsu Photonics，Bridegewater，NJ)成像。
生物发光的少量转化细胞可在许多未转化细胞的暗背景上检测。在高密度平板培养中，挑出一个生物发光细胞的纯菌落是困难的。因此，细胞在生物发光菌落位置上和周围从平板中挑出，挑出的细胞转移到1.5ml微离心管并在补充50μg/ml尿苷的SD-ura中30℃生长过夜。各管的等分样品置于96孔微量滴定板的孔中，孔中有含600μg/ml萤光素的SD-ura。平板成像5分钟且稀释含生物发光细胞的培养物并铺于补充50μg/ml尿苷的SD-ura平板上用于分离单菌落。所得生物发光细胞重复地通过且稳定没有信号损失。此外，含构建物的假丝酵母包在靶区域整合，其生长速度与亲代细胞相同。
D.DNA印迹法根据Fujimura和Sakuma从临床酵母菌株ATCC 32032、10261和90234的转化子分离基因组DNA(Fujimura和Sakuma(1993)Biotechniques 14(4)538-40)。基因组DNA是DNA印迹的且用跨越基因组靶区域的片断探测。在所有三个转化菌株中，构建物在基因组的正确位置整合。
E.阴道感染使用＞6周令的雌性BALB/c小鼠。为引起假动情期，100μl戊酸雌二醇以2mg/ml溶解于麻油，并在感染前72到96小时和之后每周一次腹膜内注射。50ml白色念珠菌菌株培养物30℃生长过夜。细胞以4,000rpm 10分钟沉淀，重悬浮于25ml磷酸缓冲盐水(PBS)并在10ml PBS中重复两次。细胞然后用血细胞计数器计数并在PBS中稀释到适当感染密度。20μl接种物(包括5×104个细胞)从移液管给予阴道腔内。动物接种后保持倒转位置1分钟(Romani(1991)《新编免疫学》(Current Protocols in Immunology)19.6.1-19.6.16)。在获得第一个图像前，接种物原位放置6小时。
例如，感染小鼠在感染后第1、2、3、5、6、7、9、13、15和21天用假丝酵母的发光菌株成像(成像通过固定小鼠和遵循本文上面所述的步骤进行，所述步骤包括给予底物)。体内的时间数列、整个鼠的图像显示感染的进行性进程，感染通过监控发光的假丝酵母清楚地成像。在第21天，动物安乐死并切除和检测阴道组织。成像此组织且清楚地证明感染剂即发光的假丝酵母的存在。
立即成像前，用异氟醚麻醉小鼠5分钟。除了上述整体成像，当各小鼠睡着时，保持倒转位置并用100μl含16.6mg/ml萤光素和16.6mM ATP的PBS灌洗。移液管头插入阴道腔内并排出灌洗溶液。上下吸出灌洗溶液以冲洗腔壁。灌洗后，取出大部分萤光素溶液并保存在微离心管中，留下约10-20μl剩余在腔中。汇集和成像来自各组3只小鼠的灌洗。在PBS中连续稀释(10x、100x和1000x)铺在含50mg/ml尿苷和15μg/ml氯霉素的YPD上。平板在30℃生长24-48小时并计数。用光学显微镜检测获得自灌洗的细胞的细胞形态，毒性菌丝的表明存在毒性菌丝的假丝酵母细胞。
因此，这些结果证明含荧光素酶的构建物可用作细胞中的报道基因构建物，这些细胞不适于可选择标记。此外，这些结果证明含荧光素酶的构建物可用于高密度筛选以检测转化，另外可在整个动物中观察。使用来自萤火虫Photinuspyralis的荧光素酶基因，该基因被改编使其在白色念珠菌中表达，通过筛选光产生来分离转化的白色念珠菌细胞，没有使用遗传选择(即使用可选择标记)。通常检测转化细胞的方法使用选择，或是用由导入的DNA代替的营养缺陷，或是用药物抗性。对于营养缺陷型突变体的替代，受体细胞必须缺少此基因。对于药物抗性，细胞必须对此药物敏感。然而，白色念珠菌对潮霉素、苯菌灵、放线酮、丝裂霉素C和衣霉素有抗性(Beckerman，Chibana，等.，(2001)Infect Immun 69(1)108-114)。本文所述高密度筛选不包括遗传选择并提供获得转化子的有效方法。成功的转化以约5×10-5到10-6频率发生(5-10个生物发光菌落/5微克酶切割DNA)，且在大大过量的非转化细胞中检测转化子(即发光细胞)是没有问题的。本文所证明成功的转化已用来自ATCC的一些强毒株重复。
所有白色念珠菌感染的现有动物模型包括将死亡作为终点或牺牲动物、收集组织、平板培养匀浆液用于细胞计数和/或用于组织学的切片组织。这种方法一般考虑疾病过程中的单个、晚期时间点且不能在单个动物中追踪感染进程。本发明描述的方法提供可然后在活感染动物中成像的生物发光细胞。它允许检测感染的许多时空方面，这些用其它方法是可能的。
尽管详述了主题发明的较佳实施方案，应理解的是可不偏离发明的精神和范围作出明显的变化，发明的精神和范围如所附权利要求书所限定。
权利要求
1.一种将多核苷酸导入细胞的方法，其特征在于，所述方法包括提供细胞群体；在有利于至少一个细胞吸亚群收多核苷酸的条件下，用多核苷酸处理所述细胞群体，其中所述多核苷酸包括发光蛋白编码序列；筛选所述细胞群体中的产光细胞；分离产生光的细胞，其中能产生光的细胞是多核苷酸导入其中的细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发光蛋白是生物发光或荧光蛋白。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述生物发光蛋白是荧光素酶。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞群体是原核细胞群体。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述原核细胞是抗生素抗性细菌。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述原核细胞是革兰氏阴性或革兰氏阳性菌。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述原核细胞是革兰氏阳性菌。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述革兰氏阳性菌是葡萄球菌属。
9.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞群体是真核细胞群体。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述细胞群体是酵母。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述酵母是白色念球菌。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述真核细胞是哺乳动物细胞。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸包含编码发光蛋白的无启动子多核苷酸序列。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸包含整合载体。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸包含转座或可动遗传元件，其中所述转座或遗传元件包含所述发光蛋白编码序列。
16.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸包含启动子可操作连接子编码发光蛋白的所述序列。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸包含整合载体。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸包含转座或可动遗传元件，其中所述转座或可动遗传元件包含所述启动子可操作连接于所述发光蛋白编码序列。
19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸包含环状质粒。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述载粒进一步包含在所述细胞的复制功能起点。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述核苷酸进一步包含第一个感兴趣的编码序列。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述第一个感兴趣的编码序列可操作连接于所述细胞中的启动子功能。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其特征在于，所述筛选发生在固体培养基的平板上，所述分离包括从包含产光细胞的固体培养基平板的区域中挑取细胞样品，将所述样品接种到液体培养物中，细胞在液体培养物中生长，测定每液体培养物等分样品的光产生，鉴定包含产光细胞的液体培养物，稀释并平板接种液体培养物以获得单一产光细胞，并鉴定衍生自单一产光细胞的单一克隆。
24.一种筛选细胞群体中的转化细胞的方法，其特征在于，所述方法包括提供细胞群体，其中所述细胞不能产光；在有利于至少一个细胞亚群吸收多核苷酸的条件下，用多核苷酸处理所述细胞群体，其中所述多核苷酸包括发光蛋白编码序列；筛选所述处理的细胞群体中的产光细胞，其中所述产光细胞是转化细胞。
全文摘要
本发明提供了将多核苷酸导入靶细胞的方法，其中该方法使用发光蛋白编码序列作为报道基因。本文所述方法的一个重要优点是可有效地转化药物抗性靶细胞或不具有有用的营养缺陷型标记的靶细胞。本发明也包括由本文所述方法产生的转化细胞。还描述了发光蛋白编码序列修饰、各种载体和使用本发明转化细胞的方法。
文档编号G01N33/53GK1596306SQ02808721
公开日2005年3月16日 申请日期2002年3月7日 优先权日2001年3月7日
发明者K·P·弗朗西斯, T·C·多伊尔, K·A·纳沃特卡 申请人:荧合金股份有限公司