专利名称：艾滋病病毒靶细胞cd4+t细胞抵抗和清除hiv-1的特异表达基因群的制作方法
技术领域：
本发明涉及人类基因组的疾病相关基因的表达谱研究和特征基因群的筛选。具体 的讲是在人功能基因组范围内筛选艾滋病相关基因，利用细胞模型和基因芯片技术相结合 的方法建立的艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞抵抗和清除HIV-I的特异表达基因群，属生物 医学领域。
背景技术：
艾滋病(AIDS)是一种由 HIV (human immunodeficiency virus，人类免疫缺陷病 毒)引起的严重威胁人类健康的重大传染病。HIV-I天然的靶细胞CD4+T细胞的活化和增 殖是HIV-I得以大量繁殖和广泛播散的先决条件。1996年Levine等人意外发现，经同时包 被在磁珠上的⑶3、⑶28抗体(“⑶3/⑶28beadS”)刺激后，活化、增殖的⑶4+T细胞，反而 获得了既能抵抗感染又能清除病毒的能力——来自HIV-I感染者的CD4+T细胞活化后，能 逐渐清除已感染的病毒，来自健康成人的CD4+T细胞活化后，能抵抗HIV-I而不被感染。我 们以此特殊效应为基础，同时以高度易感并促进病毒增殖的PHA/IL-2活化细胞为反证，构 建细胞模型并筛选出艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞抵抗和清除HIV-I的特异表达基因群。
发明内容
本发明的目的在于提供艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞抵抗和清除HIV-I的特异表 达基因群。本发明通过采用高通量的人表达谱基因芯片，通过比较未刺激、⑶3/⑶28磁珠刺 激(具备抵抗和清除HIV-I能力)及PHA/IL-2刺激(具备易感和支持HIV-I能力)三种 状态下的CD4+T细胞基因表达差异，筛选在多样本中有共同表达趋势的差异基因，得到一 组艾滋病病毒靶细胞⑶4+T细胞抵抗和清除HIV-I的特异表达基因群，共包含28个基因， 其部分或全部组合作为筛查抗艾滋细胞药物的标志；该基因群在CD4+T细胞抵抗和清除 HIV-I状态时高表达或在⑶4+T细胞易感和支持HIV-I时低表达，基因群中的各基因的名 称、序列号及主要描述见表1。表1抵抗和清除HIV-I的特异表达基因群(共28个基因)基因名称GenBank序列号基因描述
ABCAl NM一005502Homo sapiens ATP-binding cassette，sub-family A (ABC1),
member 1
ALDOC NM_005165Homo sapiens aldolase C, fructose-bisphosphate
ANGPTL4 NM一139314Homo sapiens angiopoietin-like 4, transcript variant 1
ATP6V0A4 NM—020632Homo sapiens ATPase， H+ transporting, lysosomal VO
subunit a4，transcript variant 1 CA2NM一000067Homo sapiens carbonic anhydrase II
CA9NM一001216Homo sapiens carbonic anhydrase IX
CAl2 NM—001218Homo sapiens carbonic anhydrase XII, transcript variant
1
CHD7 AK000368Homo sapiens cDNA FLJ20361 fis, clone HEP16789]
COMP NM—000095Homo sapiens cartilage oligomeric matrix protein
CTTN NM一005231Homo sapiens cortactin, transcript variant 1
CXCL12 NM_199168Homo sapiens chemokine (C-X-Cmotif) ligand 12 (stromal
cell-derived factor 1), transcript variant 1, Homo sapiens cDNA: FLJ22814 fis, clone KAIA3004 Homo sapiens fibronectin 1，transcript variant 1 Homo sapiens growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha
Homo sapiens hydroxysteroid (11-beta) dehydrogenase 1, transcript variant 2 IGFl NM—000618Homo sapiens insulin-like growth factor 1 (somatomedin
C)
17 ITGAX NM—000887Homo sapiens integrin, alpha X (complement component 3
receptor 4 subunit) KLF4 NM_004235Homo sapiens Kruppel-Iike factor 4 (gut)
LAMB3 NM_001017402 Homo sapiens laminin, beta 3， transcript variant 2 LPLNM_000237Homo sapiens lipoprotein lipase
PFKFB3 NM—004566Homo sapiens
6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2, 6-biphosphatase 3 22 PLDl NM—002662Homo sapiens phospholipase Dl,
phosphatidylcholine-specific PRPSl NM_002764Homo sapiens phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1
RBMS3 NM_001003793 Homo sapiens RNA binding motif, single stranded
interacting protein, transcript variant 1 THBS4 NM—003248Homo sapiens thrombospondin 4
TLN2 NM_015059Homo sapiens talin 2
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
12
13
14
15
16
18
19
20
21
23
24
25
26
FLJ22814 AK026467 FNlNM_212482
GADD45A NM 001924
HSDlIBl NM 181755
27 VEGFA
NM 001025366
28 KIAA0828 NM 015328
Homo sapiens vascular endothelial growth factor A
(VEGFA), transcript variant 1
Homo sapiens adenosylhomocysteinase 3 本发明中的特异表达基因群中的基因均参与了造成不同生物学效应的显著功能 (Gene Ontology, GO)和信号转导通路(pathway)，同时在信号转导网络(Signal-Net)和基因的调控网络(GeneRelNet)中处于关键结点或重要地位，因此具有代表意义。
图Ι-a显示易感和支持状态(P)中特异低表达基因。图Ι-b显示抵抗和清除状态(B)中特异高表达基因。
具体实施例方式1.样本的选择和处理3例样本取自云南昆明血液中心，均为健康人外周血浓缩白细胞。采用密度梯度 离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，采用CD4+T Cell Isolation Kit II human试剂 盒(Miltenyi公司)对PBMC进行磁珠阴性分选，获得静息状态的CD4+T细胞。使用6孔 培养板每孔3ml微量培养体系在37°C、5% CO2培养箱中对CD4+T细胞进行体外刺激培养， 培养基为RPMI 1640完全培养液[RPMI 1640+10% FBS+0. lmol/L HEPES (上海生工生物公 司)]。⑶3/⑶28磁珠刺激(B组)按细胞磁珠1 3的比例接种1 X IO6⑶4+T细胞/孔 (Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28，Invitrogen 公司)，每 2 天换半液并传代，维持 细胞密度为1 2X IO6细胞/ml。PHA/IL-2刺激(P组)接种2X106CD4+T细胞/孔，加 入5mg/ml植物血凝素(PHA)和100U/ml白介素_2(IL_2)进行刺激培养，每3天换半液补 充PHA和IL-2。上述细胞刺激6天，连同未刺激(R组)的⑶4+T细胞提取总RNA后作为基 因芯片杂交的样本。2.基因芯片杂交2. 1总RNA提取及纯化采用TRIzol法提取细胞的总RNA，QIAGEN RNeasy Kit纯化总RNA，用 NanodropND-IOOO 分析 RNA 浓度，琼脂糖电泳或 Agilent BioAnalyzer 2100 进行质检。2. 2cDNA第一链和第二链一步法合成1)取2μ g RNA于1. 5ml离心管中，如下配置反应溶液总RNA 2 μ g (最多 6. 5 μ 1)Τ7 Promotor primer 5 μ 1RNase-free Water X μ 1总体积11.5μ12) 65 °C保温10分钟，冰浴5分钟。3)配置如下cDNA合成体系5XFirst Strand Buffer 4μ 10. IM DTT 2 μ 1IOmM dNTP mix 1 μ 1MMLV RT 1 μ 1RNase OUT 0. 5 μ 1总体积8·5μ14)将上述8. 5 μ 1 mix加入变性后冰浴的RNA中。5)用枪头混勻，之后离心。
6)PCR 热盖65°C，40°C反应2小时；65°C灭活15分钟；4°C反应5分钟。2. 3aaUTP 标记 cRNA 合成1)试剂配制NTP 的配制IOOmMATP 250 μ 1IOOmM GTP 250 μ 1IOOmM CTP 250 μ 1IOOmM UTP 187. 5 μ 1RNase free Η20 62. 5 μ 1Total1000 μ 12)如下配置 Transcription mix RNase-free Water 5.7 μ 14X Transcription Buffer 20 μ 1NTP 16 μ 10. IM DTT 6 μ 150% PEG 6. 4 μ 1aa-UTP (25mM) 4 μ 1RNase OUT 0. 5 μ 1Inorganic Pyrophosphatase 0. 6 μ 1T7RNA Polymerase 0. 8 μ 1总体积60 μ 13)加入 60 μ 1 Transcription mix 并混勻。4斤0 仪中热盖601，401反应2小时。2. 4cRNA纯化与浓度测定采用QIAGEN RNeasy Mini kit纯化cRNA，用分光光度计分析RNA浓度。按下面 的计算公式确定调整cRNA的含量调整cRNA 含量=RNAm- (total RNAi) (y)RNAm = IVT 后测得 cRNA 量(μ g)total RNAi =开始总 RNA 的量(μ g)y =在IVT过程中加入的双链cDNA产物占全部cDNA产物的百分数。2. 5cRNA样品荧光标记1)取上述cRNA4 μ g并浓缩至6. 6 μ 1。2)力口 10 μ 1 DMSO 混勻。3)力口 3. 4 μ 1 的 0. 3Μ 碳酸氢钠(NaHC03) (ρΗ9· 0)并混勻。4)将上述20 μ IcRNA混合物加入到荧光染料(Cy3)中，并混勻。25°C保温1小时。5.力卩 9 μ 1 的 4Μ Hydroxylamine 混勻后 25°C保温 15min。2. 6荧光标记cRNA样品纯化采用 QIAGEN RNeasy Mini kit 纯化 cRNA。2. 7荧光分子浓度及掺入率计算
Cy3_ 浓度(pmol/μ 1) = A552/0. 15Cy3-掺入率(pmol/ yg)= Cy3-浓度 /cRNA 浓度(μ g/ μ 1)2. 8cRNA 样品片段化和芯片杂交(4x44K microarrays)1)按下表配制片段化混合液，然后在60°C温浴30min进行片段化。Cy3cRNA 875ngIOXBlocking Agent 11 μ 125X Fragmentation Buffer 2. 2 μ 1Nuclease-free water X μ 1总体积 55 μ 12)力口入 55μ1 2XGEx Hybridization Buffer。3)取100 μ 1上芯片，65°C 17小时，IOrpm滚动杂交。2. 9芯片洗涤1)取出芯片于洗液1中洗涤1分钟。2)再将芯片放入洗液2中洗涤1分钟(37°C )。2. 10芯片扫描Agilent扫描仪中扫描，分辨率为5 μ m，扫描仪自动以100%和10% PMT各扫描一 次，两次结果Agilent软件可自动合并。3.数据分析3. 1差异基因筛选利用多重比较检验(RVM)的F检验进行3组样本的差异基因筛选，按照Pvalue < 0.01, FDR < 0. 01筛选，得到差异表达基因。3. 2基因表达趋势分析通过筛选得到3组样本的差异基因后，按照样本的逻辑顺序(P-R-B)，基于基因在 每个样本下的表达值，对差异基因进行基因表达趋势的聚类，根据聚类结果将每种处理状 态下特有的基因归类，筛选得到差异基因的表达趋势。3. 3特征表达基因群的确认对在P和B中呈现特异表达和极端表达趋势的基因(见图Ι-a和图l_b)，进行功 能(Gene Ontology, GO)和信号转导通路(pathway)的显著性分析，寻找具有显著功能并 参与显著性信号转到通路的基因；同时在信号转导网络(Signal-Net)和基因的调控网络 (GeneRelNet)中寻找处于关键结点或重要地位的基因，将上述数据整合，最终筛选出具有 最高、代表意义的基因从而构建出特征性的特异表达基因群(如表1所示)。本发明的特异表达基因群，有望基于其中单个、多个或全部基因建立基因芯片、分 子杂交和RT-PCR的方法检测样本中这些基因的mRNA表达水平，根据这些基因的表达水平 诊断艾滋病及筛选抗艾滋细胞药物。
权利要求
一组艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞抵抗和清除HIV 1的特异表达基因群，其特征在于该特异表达基因群包含28个基因，其部分或全部组合作为筛查抗艾滋细胞药物的标志；该群基因在CD4+T细胞抵抗和清除HIV 1状态时高表达或在CD4+T细胞易感和支持HIV 1时低表达；28个基因的名称分别为ABCA1、ALDOC、ANGPTL4、ATP6V0A4、CA2、CA9、CA12、CHD7、COMP、CTTN、CXCL12、FLJ22814、FN1、GADD45A、HSD11B1、IGF1、ITGAX、KLF4、LAMB3、LPL、PFKFB3、PLD1、PRPS1、RBMS3、THBS4、TLN2、VEGFA及KIAA0828。
2.权利要求1所述的艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞抵抗和清除HIV-I的特异表达基因 群，其特征在于28个基因由SEQ ID NO :1_28所示的核苷酸序列组成。
全文摘要
本发明涉及艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞抵抗和清除HIV-1的特异表达基因群，属生物医学领域。本发明通过采用高通量的人表达谱基因芯片，比较未刺激、CD3/CD28磁珠刺激及PHA/IL-2刺激三种状态的CD4+T细胞基因表达差异，筛选得到艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞抵抗和清除HIV-1的包含28个基因的特异表达基因群，由SEQ IDNO1-28所示的核苷酸序列组成。本特异表达基因群中的基因均参与了造成不同生物学效应的显著功能(Gene Ontology，GO)和信号转导通路(pathway)，同时在信号转导网络(Signal-Net)和基因的调控网络(GeneRelNet)中处于关键结点或重要地位，且有望基于其中单个、多个或全部基因建立基因芯片、分子杂交和RT-PCR的方法检测样本中这些基因的mRNA表达水平，根据这些基因的表达水平诊断艾滋病及筛选抗艾滋细胞药物。
文档编号C12Q1/68GK101979568SQ20101029324
公开日2011年2月23日 申请日期2010年9月27日 优先权日2010年9月27日
发明者张华堂, 徐雯雯, 郭彦, 陈玲, 韩妙君 申请人:中国科学院昆明动物研究所