专利名称：杀死不想要的靶细胞的方法
技术领域：
本发明涉及从一个细胞群体中有选择性地清除靶细胞的方法，该方法通过将此细胞群体暴露于两种或多种免疫毒素的组合中而得以实现。
所谓的自体干细胞移植物包括来自癌症患者血液或骨髓的分离细胞，分离的细胞经过预处理，再回输进病人的血液中，细胞是从该病人的血液中收获的。很快或经过一段较长的时间之后，病人就包含有足够数量的未成熟前体血液和免疫细胞以重建无功能性骨髓的功能。
用抗体净化自体造血移植物在本领域中是已知的，此时移植物代表的是未筛选的骨髓样品。这样的净化方法由Myklebust,A T.,Godal,A.,Juell,S.和Fodstad,φ.等发表，“从人骨髓细胞中清除乳腺癌细胞的两种基于抗体的方法的比较”。《癌症研究》(USA)1994,54/1(209-214),以及Myklebust,A.T.,Godal,A.,Pharo,A.,Jerll,S.和Fodstad,φ。“用免疫毒素从人骨髓中清除小细胞肺癌细胞”，《癌症研究》(USA)1993,53(16),3784-88。在两篇文章中都用到免疫毒素，即抗体连接到一种毒素上。原则是在将细胞悬浮液重新注射给病人之前杀灭收获的骨髓细胞中的恶变细胞。
近年来正是在改进的方法中此原则事实上正好相反。人们试图用所谓的干细胞移植充满自信地从血液或骨髓中筛选一个正常的细胞亚群，当此细胞重注入病人之后，它们能恢复正常骨髓的功能。这些“干细胞”由血细胞和免疫细胞的最不成熟的前体以及更进一步分化细胞的混合物组成。收获这些细胞可通过所谓的外周血的单采血液成分术(apharesis)来实现，此过程要一到几天，或通过本领域中技术人员知道的不同的技术从血或骨髓中免疫吸收/筛选CD34+细胞(未成熟先祖细胞)。
Stray,K.M.等，“用亲和素、生物素、免疫吸收从骨髓或外周血中清除癌细胞”见P.G.Adrian,G.Samuel和A.w-w.Diana(编)，《骨髓净化和处理方法进展》97～103页，Orlando:Willelis Inc.,1994，描述了从外因血中净化骨髓细胞或单采血液成分术产物。此过程是为了清除病人体内的淋巴瘤以及病人体内的乳腺癌。此方法包括在纯化B细胞或乳腺癌细胞之前用一个所谓的亲和柱对CD34+细胞进行富集。此处的净化是间接进行的，细胞悬液起初与结合乳腺癌细胞的初级抗体共孵育，细胞悬液经过清洗，再一次和结合初级抗体的抗体共孵育。此鼠抗体是生物素标记的，即连接到一个分子上，该分子与亲和素结合力很强。当此细胞悬液最终装柱，柱中是结合了亲和素的小珠，通过初级的生物素标记抗体和二级的抗体亲和素反应造成的细胞间结合，则肿瘤细胞就将被捕获。用此系统净化的结果至多可以使恶变细胞下降3.2个对数值(3.2log)。此原理非常费时而且麻烦，因为细胞悬液在此柱之前必须经过几步处理，包括与抗体共孵育及两次清洗。这样，很难避免对干细胞的损害，柱子对干细胞也可能有非特异性的捕获，导致对恢复正常的骨髓功能来说至关重要的细胞的不幸丢失。
Tyer,C.L.等，“用免疫磁学技术可以从外周血先祖细胞中有效清除乳腺癌细胞”。国际血液治疗和移植工程学会第一次会议摘要，Orlando FL,1993，描述了一种免疫磁学方法类似于上述Myklebust等的发表物中所用的方法。然则此方法是用于外周血细胞。其原理也完全不同于应用免疫毒素，模型试验中恶变细胞净化效率在3.3到4.8个对数单位中间变动。摘要中没有提到此间接系统—用初级抗体孵育，接着洗涤，又与连接有结合初级抗体的抗体的小珠共孵育—的任何其他用途，但这是一个值得进一步推敲的设想。此过程包含额外的可能是对正常细胞有害的处理，而且有时间要求。其效率有限而且摘要中未提及任何关于清除CD34+细胞种群的内容，但在此方法中CD34+细胞种群将是一个主要问题，因为筛选CD34+细胞是费时费力的。这样，在多数情况下免疫磁学原理是用于CD34+细胞本身筛选，在本例中随后有一或两个免疫磁学步骤用于净化之目的。因此，如果一个方法需要持续长的过程，费用又高，则会有相当大的风险导致细胞破坏和细胞丢失。
对分离用于移植的干细胞而言，主要目标之一是，将要用于再注入病人的细胞需按以下方法进行选择性分离，分离的途径即是要保证移植物中不含有任何恶变细胞。现有技术最近表明这样制备的干细胞在所控测的例数中相当多的时候出人意外地包含有恶变细胞。迄今为止，选择性地除去或杀死这些移植物中的恶变细胞，这样的尝试还非常有限。这要部分归因于本领域的技术人员没有看到其必要性，也因为期望现实中已知的方法不是特异性的，如此也就能够杀灭或除去脆弱的干细胞。而且，病人提供骨髓或活化的外周血不是简单的和不受限制的，这样一个净化干细胞移植物的方法必须在很短的时间内完成，而且不能复杂化，为的是避免对正常细胞can的丢失和破坏。这样，如上所述，用干细胞移植物的原因由部分是移植物应该完全没有癌细胞，部分是骨髓功能的重建要比用未筛选骨髓进行移植者快。结论是绝对有必要发明一种方法，它可以使易损坏的正常干细胞保持完整，且在实际中可以和干细胞分离程序联合实施。
本发明的目标因而是提供一种方法以净化干细胞移植物，且不包含上述的缺点。
这些目标在以所包括的权利要求为特征的本发明中都达到了。
本发明涉及从实体瘤病例收获的干细胞群体的净化，该方法中细胞群体暴露于两种或多种连接到细菌毒素的抗体的组合物中。所用的抗体都指向靶细胞相关抗原。
下边将用一个例子更详细地描述本发明，即净化从外周血中收获的干细胞移植物，除去其中的乳腺癌细胞。
收获细胞的已知技术包括从血或骨髓中免疫吸收/筛选外周血干细胞(PBSC)或CD-34+细胞。然而，尚未知无害和足够有效的技术以清除这些细胞群中的肿瘤细胞。显然甚至在这些未成熟细胞中也有恶变细胞，按照以前的知识这些恶变细胞不应有CD34受体。重要的是，本发明如下的叙述将会令人惊奇地将癌细胞也清除掉而不对正常前体产生毒性。
在从外周血中收获干细胞移植体之前，必须用本领域中已知的方法以化学治疗或生长素处理而从骨髓中活化干细胞。干细胞的收获可以按照一种或多种方法进行，根据需要什么种类的细胞而定。外周血干细胞用一种方法收集。其执行可安排病人在接受高剂量的化疗和全身放疗之后给予G-CSF(10μg/kg/d)在第10天和11天耐受白细胞提取。血流率可用CS-300加血细胞分离器固定在例如70ml/min(BaxterHealthcare Corporation,Fenwal Division,Deerfield,IL,USA)。此过程中处理到一个二腔中心静脉导管中的平均血容可以是10升左右，持续21/2小时。可以收集50ml PBSC，用磷酸钠缓冲液(PBS)、1％人血清白蛋白(HSA)在一个Processor 2991管中洗涤以除去血小板。用在本发明中，细胞浓度(2～4×1010/单采血液成分)可调至1×108/ml以用免疫毒素进行阴性筛选(净化)。
如果需要CD-34+细胞，可用ISOLEX 50或ISOLEX 300(Baxter)进行阳性筛选来获得。在此方法中，来自单采血液成分术或骨髓的产物，约4×1010～6×1010个细胞，可以混和在一起，与抗-CD34+-单克隆抗体9C5共孵育，条件是在温和震荡器上于4℃作用30min，抗体的量是0.5μg/1×106细胞。经处理的细胞用含1％HSA的PBS在CobeProcessor上洗涤以除去未结合抗体。DYNAL珠M-450被加到CD34+部分，比例是0.5个小珠对1个有核细胞，4℃作用30分钟。从非靶细胞磁力分离玫瑰花形聚集物，可用含1％HSA的PBS洗2～3次以除去未结合细胞。然后，为使CD34+细胞从Dynal小珠上释放，可加进例如ChymoCell-R(木瓜凝乳蛋白酶)达终浓度200 pKat/ml室温作用15分钟。这样，CD34+细胞可通过用含5％柠檬酸钠的PBS洗涤而收集。其他筛选干细胞/早期前体细胞的程序也是已知的。
多个抗体与乳腺癌细胞系及肿瘤物质的结合曲线已经其他作者调查出来，部分得到我们验证。那些和很大比率乳腺癌细胞相结合却不和血及骨髓中重要的未成熟正常细胞结合的抗体，和假单胞外毒素A(PE)相连，其杀死培养的乳腺癌细胞的能力。主要在集落产生分析中得到了检验。基于那些抗体的结合曲线，本发明人生产了所有5种不同的免疫毒素1．MOC31-PE此结合物与所有乳腺癌细胞中一个很高百分比的部分相结合，在模型试验中非常有效，在实际作用浓度下对正常的造血先祖细胞只有边缘毒性。
2．NrLu10-PE结合如上的抗原，也结合其他的表位。活性稍稍低于MOC31-PE。
3．BM7-PE结合主要发现于乳腺癌细胞中的粘蛋白抗原的蛋白部分。此抗原存在于很高百分比的乳腺癌细胞中，但不是全部都有。此免疫毒素对癌细胞显示高特异性，但不像前两个免疫毒素一样有效。
4．BM2-PE结合BM7-PE相同抗原的含糖表位。此免疫毒素显示与BM7-PE大抵相同的效应，对正常细胞毒性很低。
5．MLuCl-PE结合一个完全不同的抗原，即Lewisy-抗原。此免疫毒素较前一个活性轻微降低，对正常细胞也显示中等毒性。
根据1,2,5所说的免疫毒素在模型试验中已分别或联合试用以清除规则骨髓样品中的癌细胞(MyKlebust等，癌症研究，1994)。正如前边提到的，用干细胞移植物有一个很大的优点就是只需要一个较短的时间间隔就可以重新获得正常的骨髓功能(那更安全的程序)。然而，不管期望的是什么，这些移植物已被癌细胞所污染，有必要应用能杀死移植物中所有癌细胞而又不严重影响正常细胞的免疫毒素。
寻找比MLuCl-PE对乳腺癌更特异的更适宜于乳腺癌清除的免疫毒素的工作开始了。
本研究中令人惊讶地发现联合应用MOC31-PE和BM7-PE的效果超过单独应用这两种免疫毒素的总和。如下面的表1所示。对抗体和细胞系两者之间结合的进一步研究显示联合使用导致了比单一抗体更强的结合。
MOC31结合大多数乳腺癌细胞，包括那些分化程度较低者。BM7识别相当一部分乳腺癌细胞都表达的一种粘蛋白抗原，也包括表达于那些分化程度更高的细胞上者。MrLu 10和BM 2分别结合被MOC31和BM7识别的抗原，记住这一点就会明白它们不大可能在联合使用MOC31和BM7免疫毒素时有所贡献。MLuCl-PE在理论上的意义在于它结合的抗原不同于上边所述的免疫毒素。然则，MLuCl-PE对正常细胞有毒，模型试验未显示在联合应用中包括它有任何明显的好处。
在下边的例子中，叙述的是净化外周干细胞移植物(单采血液成分术之产物)。另外，发明者用MOC31-PE和BM7-PE组合物进行了数个试验，在试验中于免疫磁学法阳性筛选CD34+细胞之前将癌细胞加到收获的外周干细胞中。一个这样试验的结果示于表2。用两种不同细胞系，显示出仅仅用阳性筛选CD34+(没有其他任何形式的清除)则从初始收获的细胞群中除去高达3.8个Log的癌细胞。在其他试验中CD34筛选的“净化”效率变化于2～3log，这些在文献中亦有提及。当免疫毒素处理用于已经经过了阳性筛选的CD34细胞群体时，则对两个细胞系的整体净化效率都超过4.7log(表2)。此处超过4.7log意味着所有可检测到的癌细胞皆已除去。在其他试验中我们经分离分析发现，经1小时免疫毒素处理的CD34+群体/中可减少成熟肿瘤细胞和正常的先祖细胞。在这些试验中我们观察到，肿瘤细胞被杀死或在处理之后很快死去，而未净化的对照群体中肿瘤细胞生长产生集落，和/或以细胞粘附型培养物的形式繁殖。正常干细胞不受此处理的影响，所以在三个不同的检测系统中正常先祖细胞的存活仅仅发生无关紧要的降低。表3显示了一个类似试验，CD34+细胞与免疫毒素37℃共孵育2小时，显示出干细胞基本上可经免疫毒素处理而存活。
表1包含PE免疫毒素杀灭PM1乳腺癌细胞的效果
表2 单独及与抗-乳腺癌MOC31和BM7免疫毒素联合使用的趋向性免疫磁珠筛选的净化效果，在模型试验中用1％的PM1和T-47D乳腺癌细胞与外周血干细胞混合。
表3IT对从活化外周血中筛选的CD34+细胞的集落存活的效应。约×105CD34+细胞与免疫毒素于37℃共孵育2小时，在CFU-GM和CFU-GEMM(5×103/盘)培养物中选种，而后如举例的“材料与方法”中所述进行分析
a．从所观察到的集落数目计算得到，把平皿接种的效率考虑在内，放入这种处理所杀死的细胞数目。b．独立试验结果的均数，每个试验重复三次。c．MOC31-PE和BM7-PE免疫毒素的作用浓度均为1μg/ml。
很奇怪的是，用两种抗体杀死恶变细胞都没有对从外周血和骨髓中收获的正常干细胞造成任何损坏，依据本发明，这两种抗体针对的是上皮细胞表达的抗原，每种抗体都和假单胞外毒素A细菌外毒素相联合。本领域的人知道细胞可以被细菌外毒素杀死，而且将毒素连接到针对靶细胞表达表位的抗体则杀灭效应会增强。然而，还知道的是如果未成熟细胞暴露于一种或几种免疫毒素则极有可能的是这种处理将杀灭该细胞群体中的正常干细胞。更进一步，这些正常干细胞对伴随机械损伤和温度改变的体内处理敏感。本发明中的细胞群体，例如从外周血中收获的一干细胞移植物，暴露于两种抗体的组合物，两种抗体均结合于PE。由于其中的一种免疫毒素的活性非常强，很奇怪显示的结果是用结合到一种细菌毒素的两种抗体的组合物其净化效果看起来好像比单独使用两种免疫毒素的效应的总和还要强。此协作效应显示于表4，本发明用连接到假单胞外毒素A的抗体BM7和MOC31杀灭PM1人乳腺癌细胞揭示出这一点。所指的免疫毒素都是针对肿瘤相关抗原的单克隆抗体，都连接到细菌毒素假单胞外毒素A。其中一个抗体识别被GA733-2基因编码的上皮抗原，该抗原表达于大多数癌细胞，因此可用于包含癌的所有病例(例如乳腺癌，直肠癌，前列腺癌，卵巢癌，肿瘤和胰腺癌)。另一个抗体针对粘蛋白，一种类型的癌与另一类型的癌其粘液蛋白有轻微区别。一般情况下其抗原可被描述成基因MUC-1,MUC-2和MUC-3编码的蛋白。上边提及的单克隆抗体的例子是MOC31和BM7。
抗体和毒素的连接可用已知的不同方法进行。
筛选组合物中偶联细菌外毒素的两或多种抗体是按下述方法进行的。即抗体结合针对的是大多数靶细胞表达的表位，而正常细胞不表达这些表位。现有技术的问题是恶变细胞和正常血细胞均在细胞表面表达公共抗原。本发明包含的例子中用到两种单克隆抗体MOC31和BM7。这些抗体的形成都是针对外周血中发现的恶变的上皮细胞的。其抗原(整个蛋白)是由基因GA733-2编码的。然而，此抗原有数个表位，重要的是指向表达最丰富最充分的表位。
BM7抗体是针对MUC1基因表达抗原的一个表位的抗体之一。有数个基因编码类似的抗原，例如(MUC2,MUC3)。
细菌毒素假单胞菌外毒素A对正常干细胞和恶变细胞有相对中等的毒性效应。然而，当该毒素连接到针对表达于靶细胞的抗原的抗体时则对这些细胞的毒性效应是很显著的。表5显示的是本发明中免疫毒素的混合物，即使孵育时间短至60分钟，也可杀死T-47D细胞，MCF7细胞和PM1细胞，比现有技术中的其他方法的效率高得多。这样这两种免疫毒素的联合使用就给出了如人们所期望的同时又令人惊奇的结果，由于其选择效率，简单性以及对正常先祖细胞仅有边缘毒性。
或许有人指出已知有由假单胞外毒素A连接到三种不同抗体而组成数种免疫毒素的应用，见MyKlebust等1993和1994。其中一种抗体(MOC31)和本发明的用法相类似，目的是净化未筛选的骨髓细胞。然而，所用的其他抗体似乎不是最理想的，在其他抗体中因为有一种是指向与MOC31相同的抗原，而且另一种(MLuCl)与正常细胞交叉反应，因而连接到这种抗体的免疫毒素很容易对最不成熟的干细胞产生毒性。本发明净化干细胞制备物过程中我们制备了另一种单克隆抗体，它增强MOC31的效应，而且观察到这两种抗体的组合物用作免疫毒素给出了极为令人惊奇的结果。
由于所发现的免疫毒素有高度特异的活性，看来有可能对罹患不同类型癌症的病人给予该混和物以进行体内治疗。如果肿瘤是局限性的则有可能静脉注射或输入其中一种或其混和物，例如当显示疾病已扩散至骨髓时。进一步还有可能对疾病进一步扩散、已有腹部液体(腹水)或胸膜渗出物的病人单独或联合注射免疫毒素。第三种可能性是治疗肿瘤已扩散到中枢神经系统的病人。在这种情况下免疫毒素可直接注射进肿瘤组织，注射进脑脊液或给脑供血的动脉。
除了MOC31-PE已经被用于小细胞肺癌的薄脑膜肿瘤模型以外，尚未见这些免疫毒素用于体内的情况。BM7-PE在文献中根本没有述及。
体内应用免疫毒素的一个重要问题是，它们的半寿期一般都很短，即肿瘤内的浓度还没有达到足够高时免疫毒素就被破坏和清除出血液。在US PS 5322678中，Morgan等已申请了一个专利，即对免疫毒素的抗体部分进行修饰，以减少体内半寿期短的问题。本发明提出了对毒素部分进行类似修饰，此程序是前所未知、前所未行的。
实施例1从外周血干细胞收获物中用免疫毒素有效清除乳腺癌细胞。介绍以自体造血干细胞辅助的高剂量化学放射治疗用于治疗各种恶性肿瘤患者的使用频率在上升(1,2)。此方法不成功的病例，最普遍的原因是疾病的复发，而非毒力，感染和增强移植作用的缺乏(3)。重要的是，有过硬的证据说明在接受高剂量治疗的病人，重注入含有集落生成的肿瘤细胞的自体移植物会对旧病复发起促进作用，且影响预后(4)。自体移植细胞的基因标记研究已显示，存留在回输骨髓(BM)中的肿瘤细胞对疾病的复发有一定促进作用(5)。此结论被下述结果进一步证实，即在滤泡淋巴瘤的病人有效的BM净化提高了病愈存活(6)。
应用灵敏的免疫细胞化学技术在组织学上正常的骨髓自体移植物中能观察到肿瘤细胞污染，这种情况在经高剂量处理的乳腺癌病人中的发生范围是37％～62％(7)。用造血生长因子和化学治疗预处理，之后用单采血液成分术收集外周血干细胞(PBSC)自体移植物，此方法的应用范围在扩大，由于相信这些产物污染肿瘤细胞的可能性低。然而，近来发现，虽然比之BM收集物PBSC自体移植物中肿瘤细胞包含率的广泛性较低，而在乳腺癌病人的活化PBSC收集物中仍然经常发现恶变细胞(4,7)。另外，近来的发现显示，不论病人以前有或没有在骨髓中发现可检测到的肿瘤细胞，化疗和/或生长因子都将会活化肿瘤细胞进入外周血(7,8)，结果是进一步增加PBSC移植物中肿瘤细胞污染的危险性。
为了避免重输入恶变细胞，有必要体外清除PBSC自体移植物中的乳腺癌细胞。此处我们报告一个实用、快速的净化方法，显示在一个60分钟的孵育过程中，ITs直接加入血液单成分提取物中将选择性地杀死超过5log的肿瘤细胞。
材料和方法细胞系。PM1乳腺癌细胞系由我们实验室建立，它是从一个病情恶化的病人的腹水建成的。MCF7和T-47D细胞系来自美国典型培养物保藏中心(Rockwille,MD)(分别为ATCC HTB 22和ATCC HTB133)。细胞培养的条件是37℃,5％CO2室气，RPMT 1640培养基(RPMI)含10％热灭活胎牛血清(FCS)和抗生素(100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)培养基和补充物购自GIBCO(Paisley,UK)。
人骨髓和外周血先祖细胞。BM细胞来自健康的志愿捐献者。BM单核细胞(MNC)部分获自Lymphoprep试剂盒(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)，试验应用之前用磷酸缓冲液(PBS)洗涤两次。PBSCs来自非-何杰金淋巴瘤病人。为了活化PBSCs，病人经化疗加造血生长因子(G-CSF,Neupogen,Amgen/Hoffman-La Roche,Basel,Switzerland)预处理。化疗之后11到12天。当外周血中CD34+细胞的数目高的时候，就用CS-3000 Plus血细胞分离器收集干细胞(Baxter,Healthcare,Corp.,Fenwal Division,Deerfield,IL)。
毒素，抗体，及免疫毒素的构建。抗-MUC1(9)抗体BM7(IgGl)由S.Kaul(Frauenklinik，海登堡大学，德国)赠送，抗-EGP2(10)抗体MOC-31(IgG2a)由L.de Leij(University of Groningen，荷兰)和MCA Development(Groningen)善意提供。PE来自瑞士血清与疫苗研究所(伯尔尼，瑞士)。每一种抗体都通过一个硫醚键连接到PE，此键的形成如前所述(11)用磺基-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(Sulfo-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate(Pierce,Rockford,IL)。
免疫毒素治疗。IT治疗对集落生成乳腺癌细胞存活的效应测定是将含FCS的RPMI中处在指数生长期的2×106肿瘤细胞与指示浓度的ITs共孵育，于37℃轻微振荡(100rpm，于环形孵化器上(Gallenkamp,Leicestershire,UK))不同长度的一段时间，视每次试验而定。用于集落形成分析筛检之前以含1％FCS的PBS洗涤两次细胞。
在一些试验中，10％的肿瘤细胞与BM单核细胞或PBSCs混合，与ITs共孵育，而后洗涤，并对肿瘤细胞或造血先祖集落形成细胞的存活进行效应评估。
肿瘤和造血先祖细胞的集落分析。用于肿瘤细胞的集落生成软琼脂分析以前已有叙述(12)。三份重复培养物在37℃,5％CO2,5％O2,90％N2中孵育14天，超过50个细胞的集落将在一座Zeiss立体显微镜下计数。
经处理和未经处理的正常先祖细胞的集落形成能力是经CFU-GEMM分析评估的(13)，此分析中每ml 5×104PBSCs分别培养于IMDM培养基(GIBCO)中标准的甲基纤维素培养物内(HCC-4433Methocult,Terry Fox Labs,Vancouver,BC)。19天孵育之后，BFU-E和CFU-GM集落在倒置相差显微镜下计数。每个分析都用三份平行培养物进行，在1ml 35mm的小碟中，于37℃，在5％CO2,100％湿度的空气中。
结果人乳腺癌细胞在软琼脂中的生长。在数个试验中，观察到种下的肿瘤细胞数和形成的肿瘤集落数目之间存在一个线性关系。PM1细胞系的克隆效率的范围是20％到30％(未显示)。在T-47D和MCF7细胞系的试验中，与PEs的线性关系以前报道的(14)分别是27％和22％，试验证实了这一点。这些资料被用来计算通过这种处理获得的乳腺癌细胞衰竭的效率。
单独和混和使用免疫毒素杀灭乳腺癌细胞的功效。在模型试验中每种工厂都使用了三种不同的浓度。如表4所示，在两个较低浓度BM7结合物仅有边缘效应，而在1.0μg/ml时杀灭细胞达到2.5log，看到近3log细胞被杀死，在最高浓度(1μg/ml)功效最低达5logs，在本分析中估计可能是最高效应(14)。两种ITs的混合物，每种都用所指的浓度，在浓度为0.1μg/ml时所有的癌细胞都已被杀死(表4)。结果显示这两种ITs的混合物可以非常有效地杀灭乳腺癌细胞，资料还提示联合使用两种结合物可获得加和效果。用其他两种乳腺癌细胞系检测ITs的功效也获得了类似的结果(未显示)。由于靶细胞上抗原表达有预期的异质性，将IT联合物用于将会进一步发展起来的适合于临床应用的方法，这看来是符合逻辑的。
表4包含假单胞菌外毒素A的免疫毒素在杀灭PM1人乳腺癌细胞中的功效。PM1细胞和免疫毒素共孵育，37℃2h，在软琼脂，集落形成的估计如“材料和方法”中所述。
a.从观察到的集落数计算得到，考虑到涂板效率，最终由处理所杀灭的细胞数目的对数确定下来。b.结果的均数来自独立的软琼脂试验，每试验重复三次。c.各免疫毒素均用指定浓度。
孵育时间的影响。在上述试验中，与ITs的孵育时间用的是120min。在临床情况下，为了实用的原因，用甚至更短的孵育时间将会有好处。为了研究是不是暴露于ITs的时间可以缩短而不影响杀死特定的肿瘤细胞，两种结合物的混和物，每种所用的浓度均为1μg/ml，与三种乳腺癌细胞系孵育不同的时间以检测之。在所有这几种情况下，与ITs作用120分钟者导致了所有肿瘤细胞的根除。重要的是，当孵育时间减少到90min甚至60min时，该处理同样有效(表5)，而且资料显示在所用的IT浓度下最短的孵育时间足以杀死肿瘤细胞培养物中出现的所有的集落形成肿瘤细胞。
表5孵育时间对MOC-31和BM7免疫毒素混和物杀灭乳腺癌细胞功效的影响单独的肿瘤细胞(2×106/ml)或与外周血前体细胞混合(比例1∶10)(总数1×107细胞/ml)与ITs于37℃共孵育指定的时间长度，用软琼脂筛选，作分析如表4。
a.每种IT的应用浓度1μg/ml。b.结果来自用T-47D和PM1细胞进行的两个独立试验，及用MCF7细胞进行的一个试验。
为了检测在高数目的正常造血细胞存在时对乳腺癌细胞的毒性是否会改变，进行了这样的试验，即将肿瘤细胞按1∶10的比例混合于用血液单成分提取法收获的PBPCs中。如表5所示，在正常细胞存在的情况下仅孵育60min之后ITs还是已经杀死了超过5logs的PM1肿瘤细胞。由于对所有三种细胞系结果都一样，资料表明该IT程序在临床情况下应用可能有效。
孵育条件和细胞浓度的影响。为了检验在类似于临床应用的条件下IT程序的功效，试验中PM1肿瘤细胞将以1∶10的比例与PBPCs混合，其中在与ITs共孵育之前直接取自血液单成分提取包中的未洗涤细胞用含ACD的生理盐水(贮存液包，R2220,Baxter Healthcare Corp.,Fenwal Division)重悬。其结果与初始试验中的相比较，后者的细胞经洗涤，是用含10％FCS的RPMI重悬的。发现(表6)两种情况下用ITS处理60min均杀死所有PM1细胞，表明临床应用中ITs可以直接注射进血液单成分提取包中，该条件下的低pH不会影响ITs的细胞毒性。
表6 孵育条件对免疫毒素MOC-31和BM7混和物杀灭PM1乳腺癌细胞与外周血前体细胞混合(比例为1∶10)物的功效的影响，外周血先祖细胞以血细胞单成分提取术分离。从血液单成分提取包得到的细胞被置于3试管中，每管含1×108个细胞。在两个试管中，细胞(体积500～700μl)以含20％ACD和1％人白蛋白的PBS稀释到终体积1ml。其中一只试管用作对照，用作IT孵育(A组)。第三只试管中的细胞经洗涤，用含10％FCS的RPMI重悬至1ml(B组)。在处理组中，细胞与每种含量为1μg/ml的IT在37℃孵育1h，洗涤，以软琼脂分析法筛检，如表1进行计算。未处理的对照培养物的平皿接种效率为20％～30％。<
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在单采血液成分包中细胞总数将会非常高，可以想象到在这样高的细胞浓度下，相对于模型研究条件下该程序的功效可能会下降。然而，在检测此可能性的试验中，当总体细胞浓度从每毫升1×107上升到5×107，而后又上升到1×108，均未观察到功效上的差异(表6)。
ITs对正常造血先祖细胞的毒性。ITs对CFU-GM和BFU-E存活的影响在如上所述的孵育条件下进行了研究。发现(表7)有核PBPCs与IT混合物的孵育甚至达120min也不降低前体细胞的存活，不论是在经洗涤后用含10％FCS的RPMI重悬细胞的情况下测定，还是用未洗涤的细胞重悬于含ACD的生理盐水中。
由于在临床情况下经处理的细胞在回输给病人之前要经过冷冻和解冻，这些过程对先祖细胞的影响也经过了研究。发现冷冻和解冻仅仅轻微减少CFU-GM和BFU-E的数目(表7)。值得注意的是，IT处理本身并不一定减少前体细胞的存活，而且细胞集落平均数的轻微降低也在细胞经低pH条件处理的组中见到。资料显示，在60min的孵育中肿瘤细胞被有效根除的ITs浓度仅对经过了两次这种处理的正常集落形成细胞的存活产生无足轻重的影响。
表7 免疫毒素MOC-31和BM7的混合物对新鲜的人PBPCs中CFU-GM和BFU-E的毒性，新鲜的人PBPCs是经G-CSF活化后收集的。孵育条件和冷冻程序的影响。
对照和处理组同表6。有核PBPCs与每种浓度1μg/ml的ITs于37℃共孵育2h，后用“材料和方法”中所述的分析筛选出来(5×104细胞/碟)。
a．均数±SD的结果来自两次独立试验中的三次重复培养。
讨论循环造血干细胞的自体移植由于其与BM移植相比的优越性，最近已引起了相当大的兴趣(15,16)。于骨髓功能的快速重建之外，PBSCs的应用还被猜测可以除去回输污染了肿瘤细胞的移植物的风险。然而，也已显示肿瘤细胞污染的问题是减少了但并未消灭(4)。还应指出的是高剂量的化疗包括应用集落刺激因子可能会使外周血细胞中的肿瘤细胞复原(7,8)。因此，一种净化单采血液成分术产物的快捷、实用的程序是人们高度期盼的。
已有数种从BM中除去乳腺癌细胞的方法报道，包括化学-免疫分离，免疫磁珠程序，以及免疫毒素的运用(14,17,18,19)。相比之下，仅有极少的净化PBSC制备物的研究被提及(20,21)，但一种用核糖体失活蛋白制备的ITs(22,23)已用于杀灭增添到制备自BM的CD-34+细胞收集物中的淋巴肿瘤细胞(24)。在后一个研究中，在以CD34筛选程序获得的3log非直接纯化作用之外，还获得了2logs的净化功效。本研究的目标是发展一种安全的IT程序以从PBSCs中清除乳腺癌细胞。模型试验中获得的结果显示，与两种均为1μg/ml的结合物共孵育60min，每种结合物均包含抗肿瘤抗体和PE，将有效杀死混合到PBSCs的所有肿瘤细胞，且对正常前体细胞没有毒性。重要的是，该方法容许ITs直接加到血液单成分提取术的产物中，孵育之后细胞经洗涤，离心，可以冷冻。特别是因为其简单性和功效，该方法用于如下用途将是有吸引力的，即联合应用高剂量化疗配合PBSCs的移植处理乳腺癌病人的筛选组时。我们的程序的高选择性功效或许可以表述成下述因素第一，被MOC31抗体识别的抗原已知表达于几乎所有经检测的乳腺癌标本的大部分细胞(10)。而BM7抗体，识别MUC-1基因表达的核心蛋白，也结合于很大一部分乳腺癌细胞(25)。这两种单抗一起，好像在相当的程度上覆盖了在乳腺癌中发现的抗原表达的异质性。第二，我们以前已证实，构建ITs时，用与所用抗体般配的一种毒素是重要的(11)。我们已发现PE结合物包含若干单抗，包括此处应用的那些，是非常有效的(14)。而且，伴PE的ITs通常比等分子浓度的游离PE毒性更强(11,18)，表明了这些ITs的特异性。
净化过程必须是有效和安全的，该方法也必须是实用的，可应用于临床水平。ITs可直接加至单采血液成分包中，在此优点之外，我们的方法包括仅用60min孵育时间即可杀死所有的集落生成肿瘤细胞。而且，此处理对正常的造血先祖细胞没有毒性，且在BM净化试验中甚至高得多的IT浓度也可以很好地耐受(14)。我们也显示经ITs处理的PBSCs的冷冻和解冻不引起额外的毒性，值得一提的是IT过程不包含非特异性的细胞丢失，而在其他方法中则可能要经历细胞丢失，包括用免疫小珠或免疫吸附的方法除去肿瘤细胞。
我们以前计算过，洗涤之后存留在经IT处理BM中的结合物的数量是加入的整体数量的0.75％左右(26)。在临床情况下，对PBSCs的处理，包含大约2×1010个单核细胞，推荐浓度是2μg IT/ml(1×108细胞)，则结果可期望在经产物中有至多3μg的IT。这表示比理论计算中游离毒素的最大耐受剂量要低100～150倍(26)。这样，回输经净化的PBSCs将不会出现任何系统性的毒性。
克服高剂量治疗配合自体造血前体细胞移植物的不是可能更多地依靠系统性处理的功效而非净化移植物的效率(1)。不过，清除可能存在于自体移植物中的肿瘤细胞是符合逻辑的，来自研究其他肿瘤类型的最近证据表明了净化之重要性(16)。在乳腺癌中，我们建议用一种简单，安全和有效的步骤，正如此处所述的这种。实施例2由于乳腺癌细胞对免疫毒素可以显示不同的敏感性，例如BM7和MOC31的净化活性对来自不同病人的乳腺癌细胞可能不同，以前用PM1乳腺癌细胞进行的同样的试验(例1)用另一个细胞系MA11进行了重复。结果发现，与PM1细胞相比对MA11细胞而容免疫毒素处理的效果同样好或者甚至更好(表4)。结果证实了免疫毒素净化处理的高度特异性的活性。
在单独的试验中研究了免疫毒素细胞杀灭活性的动力学，该试验中PM乳腺癌细胞加入到外周血前体细胞中(比例1∶100)。孵育两小时之后，混合的细胞悬浮液被冷冻，随后在细胞选种之前被解冻，乳腺癌细胞和正常前体细胞的生活力通过平行试验估算出来。发现乳腺癌细胞很快发生中毒，且在大约72小时之内所有肿瘤细胞都死了。通过对比，在免疫毒素处理和未处理细胞培养中，未发现在同样的时间长度内正常血液前体的生活力出现差异。实施例3-4
扩散到骨或骨髓，到胸膜腔和腹腔，到大脑和脊髓组织，到尿生殖道的癌细胞，可以被免疫毒素选择性地杀死，方法是将免疫毒素注入肿瘤、注入上述体液，或者有系统地，例如导向诸如血液，骨及骨髓等组织的转移性肿瘤细胞。实施例3MA-11人乳腺癌细胞被注射进免疫缺陷大鼠的左心室。未治疗的对照动物发展了骨髓压迫症状，在细胞注射后34～37天必须被杀死。经静脉注射单一剂量的MOC31-PE(20μg/鼠)治疗的动物出现了延长的无症状存活，其中一些动物存活超过50天。
同一个模型的另一个试验证实了此结果，在此例中一些动物在整个观察时间的110天中均存活。在这些试验中，一组大鼠经由结合于PE的针对EGF-受体的425.3抗体组成的免疫毒素治疗。此组中所有动物均存活。
此模型的第三个试验中，对照大鼠显示索压迫症状，必须在细胞注射之后的40～60天被杀死。此试验中包括三个治疗组，其一用20μg425.3-PE；一组接受两种免疫毒，每种均用10mg。两种免疫毒素单独应用都得到无疾病存活期的有效的延长，MOC31-PE和425.3-PE分别使存活时间延长6％和8％。在组合使用试验中，所有动物无疾病存活。
此模型的第四个试验中，MOC31-PE的效果将与顺铂及阿霉素相对比。此试验中所有MOC31-PE治疗的动物存活超过70天，而阿霉素仅显示边缘效果，而顺铂处理大鼠不比生理盐水处理的对照动物活得长。这些资料令人信服地证明，所用的免疫毒素在杀死乳腺癌转移方面远远优于临床最常应用的两种药物，阿霉素和顺铂。实施例4人乳腺癌细胞系MT-1被用于两种不同的试验中。在第一个试验中，细胞被注入左心室，由于骨髓压迫症状，对照动物在平均19天时间以后就必须杀死。细胞注射一天以后静脉给予425.3-PE处理的动物全部存活。在另一个试验中，MT-1肿瘤细胞被直接注射进鼠胫骨之骨髓腔。所有未治疗的动物由于胫骨瘤的生长都必须在20天之后献出生命，然而在细胞注射一天之后静脉给予20mg 425.3-PE治疗的大鼠所有均存活100天以上。
此外，在MT-1肿瘤细胞直接注射进大鼠胫骨骨髓腔的模型中，于第1天或第7天给予BM7-PE，其效果与425.3-PE的作了对比，后者所用动物组的处理时间与BM7-PE在同一天。而且，在第7天和第14天静脉给予阿霉素(盐酸阿霉素)的效果也进行了研究。发现两种免疫毒素均治愈了80％的鼠，不论其给药是在第1天或第7天。当每种免疫毒素以一半浓度联合使用时所有动物均活存。对比之下，阿霉素的效率明显要低，90天之后仅剩下35％的动物活存。而对照动物在注射细胞20天之后就不得不献身，同前边的试验一样。该资料证实了如前所示的425.3-PE的效果，重要的是，BM7-PE被发现与425.3-PE同样有效。两种试剂在功效方面明显超过阿霉素，后者是治疗乳腺癌最常用的临床药物之一。而且，这两种免疫毒素的联合使用治愈了所有患病的动物。
实施例5在两套试验中检测了重组生产的针对erbB2-基因产物的与重组生成的PE的变异体相连的免疫毒素的功效。在例4所述的模型中，重组免疫毒素的最高浓度有效地延长了动物的生存期限，35％的鼠活存。在一个模型中MT-1乳腺癌细胞被静脉注入免疫缺陷大鼠，重组免疫毒素的治疗也经静脉给予(于第1,2和3天)，结果导致动物生存期限的有效延长。此效应是剂量依赖性的，该免疫毒素的两种不同剂量使动物的生存期限增加，从10,6天(生理盐水处理的对照)到23,4天以及32,8天。在最高剂量，20％的鼠存活。由于即便是最高的免疫毒素剂量也未观察到毒性，故指望最适宜剂量的效应甚至会更好。
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权利要求
1．杀灭一个细胞群体中不想要的靶细胞的方法，其中该细胞群体包括从外周血收集的有核细胞，或从上述有核细胞中筛选的CD-34+细胞，或从骨髓抽吸物收获的CD-34+细胞，或来自骨髓或包含多功能干细胞的血液的其他未成熟/早期先祖细胞，或由正常基质细胞支持的恶变细胞，其特征在于，该细胞群体被暴露于一或多种免疫毒素，其中的每一种免疫毒素是由抗体和细胞毒素偶联物，抗体片段和毒素，或重组生产的抗体，毒素，免疫毒素或其片段组成的。
2．根据权利要求1的方法，其特征在于，该细胞群体暴露于两种或多种免疫毒素。
3．根据权利要求1的方法，其特征在于，该细胞群体暴露于一种免疫毒素，例如MOC31-PE或BM7-PE。
4．根据权利要求1的方法，其特征在于，该细胞群体是从外周血中收获。
5．根据权利要求1的方法，其特征在于，其干细胞/早期先祖细胞是从骨髓中收获的。
6．根据权利要求1-2的方法，其特征在于，其细胞群体是与2-3种物质混和物共孵育，优选地是2种指向靶细胞相关抗原的特异性抗体或其片段，每种抗体偶联于相同或不同的细胞毒素。
7．根据权利要求4的方法，其特征在于，应用了针对上皮细胞抗原的抗体。
8．根据权利要求7的方法，其特征在于，应用了针对主要表达于上皮细胞的表位的抗体。
9．根据上述权利要求之一的方法，其特征在于，在所用的抗体中至少有一种是针对基因GA733-2表达的抗原EGP2上的表位，而且至少有一种是针对基因MUC1,MUC2或MUC3，或其组表达的抗原上的表位。
10．根据上述权利要求之一的方法，其特征在于，所用的抗体是MOC31和一个针对由基因MUC1,MUC2,MUC3或其组合编码的抗原的抗体。
11．根据权利要求6的方法，其特征在于，所用的抗体是MOC31和BM7，或其片段。
12．根据权利要求6的方法，其特征在于，所用的抗体是MOC31和BM2或12H12，或其片段。
13．根据权利要求6的方法，其特征在于，所用的抗体是MOC31和595A6，或其片段。
14．根据上述权利要求之一的方法，其特征在于，免疫毒素所用的毒素部分是天然的或重组假单胞菌外毒素A，或其片段。
15．根据上述权利要求之一的方法，其特征在于，所用的毒素是天然的或重组的相思豆毒素，蓖麻蛋白，gelonin，黑杆菌素或美洲商陆抗病素蛋白，皂草素，ebulin或其片段。
16．根据上述权利要求之一的方法，其特征在于，该细胞群体是从外周血收获的有核细胞，靶细胞是上皮起源的恶变细胞。
17．根据上述权利要求之一的方法，其特征在于，该细胞群体包含作为一个基本部分的CD-34+细胞，或用其他表面标记例如P-糖蛋白筛选的类似的早期先祖细胞。
18．根据权利要求8的方法，其特征在于，其靶细胞是肿瘤细胞，例如乳腺癌细胞，直肠癌细胞，前列腺癌细胞，卵巢癌细胞，胰腺癌细胞和肺癌细胞。
19．根据权利要求2,3的方法，其特征在于，该细胞群体是在体内暴露于特异性免疫毒素。
20．根据权利要求19的方法，其特征在于，免疫毒素直接注入肿瘤或胸腔和腹腔。
21．根据权利要求19的方法，其特征在于，免疫毒素是全身给药，尤其是在恶变细胞扩散到的如骨和骨髓这样的组织。
22．根据权利要求1中的方法杀死细胞的免疫毒素，其特征在于，它包含一或多种针对呈现于恶变细胞表面的抗原的免疫毒素。
23．根据权利要求22的免疫毒素，其特征在于，抗体选自MOC31和BM7,595,BM2,12H12或它们的组合，毒素是假单胞菌外毒素A。
24．应用根据权利要求22的混和物生产癌症治疗剂。
25．执行根据权利要求1的方法的试剂盒，其特征在于，它包括药学上可接受的制剂中的一或多种免疫毒素制品。
全文摘要
描述了一种方法,从一个细胞群体中杀死不想要的靶细胞,该群体包括:从外周血中获取的有核细胞,或CD－3文档编号A61K39/00GK1218411SQ97194599
公开日1999年6月2日 申请日期1997年3月12日 优先权日1996年3月13日
发明者奥伊斯坦·福德斯塔德, G·克瓦尔黑姆, S·朱尔, 王孟瑜, O·恩格布雷藤 申请人:奥伊斯坦·福德斯塔德