治疗方法

文档序号:840874阅读:549来源:国知局
专利名称:治疗方法
技术领域
本发明涉及通过口粘膜大剂量投用干扰素刺激哺乳动物体内针对病理学条件的宿主防御机制的方法。具体地说,本发明可应用于自身免疫病、肿瘤疾病、神经性变性疾病、寄生虫病和病毒病的治疗方法。
本发明的背景技术α干扰素广泛用于治疗包括多毛细胞白血病、慢性骨髓性白血病、低级淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤在内的各种血液学恶性疾病,和包括肾细胞癌、黑色素瘤、癌样肿瘤及与爱滋病相关的卡波西氏肉瘤在内的实体瘤(Gtutterman,J.U.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,199491:1198-1205)。通常在借助胃肠外给药注射大剂量(往往是数百万单位)的α干扰素(IFN-α)才能看到抗肿瘤作用。β干扰素(IFN-β)临床上已被批准用于治疗复发-缓解性多发硬化症及慢性乙型和丙型病毒性肝炎。
α干扰素和β干扰素都是Ⅰ型干扰素。Ⅰ型干扰素是一大类天然存在的细胞因子,包括16个以上IFN-α子类、加上IFN-β和IFN-ω。Ⅰ型干扰素结合到单细胞表面受体上,刺激一系列复杂的信号转导过程,最终导致抗病毒、抗增殖和其他免疫调节作用、细胞因子诱导作用,以及Ⅰ类和Ⅱ类HLA调节作用(Pestka等人,RevBiochem.,1987 56:727)。Ⅰ型IFN的各个亚型在活性上是不同的。借助扫描大量的IFN-α等位基因亚型已识别每个位置上最常观察到的氨基酸,并已合成出具有共同序列的Ⅰ型合成干扰素(Alton等人,“干扰素系统的物生学”,E.de Maeyer and H.Schellekens eds.Elsevier(1983)1991-128)。这种共有干扰素可从市场购得(Infergen,Amgen,Ine.),并且最近已证明它具有比IFN-α2a或IFN-α2b高的活性(w/w);而且已有人提出共有IFN将在临床上优于各种天然亚型的IFN(Blatt等人,J.Interferon and Cyfokine Rsearch,1996 16:489-499)。
尽管有大量的给药途径(包括静脉注射、皮下注射、肌肉注射、局部注射和损伤部位内注射)通常用于Ⅰ型干扰素给药,但因为干扰素是一种可被蛋白水解酶失活的蛋白质,并且在胃肠道内大多不能以其天然形式被吸收,所以一般不使用口服给药途径。确实有许多研究未能在口服给药后在血液中检测到干扰素(Canttll and Pyhala,J.Gen.Virol.,1973 20:99-104;Wills等人,H.IFN Res.,1984 4:399-409;Gilson at al,J.IFN Res.,1985 5:403-408)。
普遍认为,为了获得最大治疗效果应使用可能的高剂量的干扰素。虽然重组物的可用性意味着非常高的剂量水平是可行的,但在实践中业已发现,干扰素用药的副作用严重地限制了可以使用的干扰素剂量和持续治疗时间。这些副作用包括严重的不适和抑郁,在某些病例中甚至导致自杀。Hoofnagle近年在New England Journal ofMedicine上总结了这些问题(Hoofnagle,J.H.,and Lau,D.,New Eng J.Medicine,1996 334:1470-1471)。对患有乙肝炎e抗原阳性的慢性乙型肝炎病人所作的α干扰素治疗效果的meta分析显示有25%至40%的缓解率,其中包括用每天5百万单位(IU)或每周3次每次1千万IU治疗3至6个月的典型的慢性乙型肝炎病人。但这些结果都末达到治愈的目的,因为经聚合酶链反应试验显示,大多数病人仍为肝炎表面抗原阳性,并且带有病毒DNA。此外,这样高剂量的干扰素很难忍受,有10%至40%的病人因不能耐受的副作用要求降低剂量。但是每天1百万IU的可忍受剂量,缓解率只有17%(Perrillo等人,NewEng J.Medicine,1990,323:295-301)。在患有慢性丙型肝炎的病人中,长期维持的改善与HCV RNA有关,这种情况只发生在10-20%的采用每周3次3百万单位的剂量治疗了6个月的病人中(Hoofnagleand lau,文献出处同上)。在患肿瘤的病人中,通常只有使用最高耐受剂量的α干扰素才能看到有意义的反应率。因此对于多发性骨髓瘤病人,在每天用2-3千万国际单位治疗的病人中反应率为50%,用3百万IU台疗的病人反应率只有10-20%。但只有极少数病人能够较长时期忍受大剂量治疗(Alre等人,Ear.J.Hematol.,1998,41:123-130)。因此,在此领域中显然需要一种能够在不诱发严重副作用的情况下完成大剂量干扰素给药的办法。
迄今已有许多关于在治疗各种病毒性疾病特别是在治疗流感中作为鼻喷雾剂或口服液体配方给药的小剂量干扰素的效力的轶事性报道。但在大多数报道中,所使用的干扰素制剂都是比较粗制的。用较高剂量鼻内干扰素治疗鼻病毒感染的安慰剂对照试验显示治疗是有效的,但副作用的发病率相当高(Hayden等人,J.Infect Dis.,1983,148:914-921)。同样,虽然有许多包括随机双盲临床试验的研究(Douglas等人,New Engl.J.Med.,1986,314:65-80;Hayden等人,New Engl.J.Med.,1986,314:71-75)已经证明通过鼻饲给药投用高剂量重组干扰素α2在抗鼻病毒感染中的效力,但这些研究并没有提供有关全身作用的证据。
最近有一系列专利说明书描述了使用低剂量口服给药的异种来源的干扰素治疗家畜的感染性鼻气管炎(“运输热”),和猫白血病,以及治疗其他一些病症,以增强疫苗的效力、改善食物利用的效率、以及预防牛泰勒氏梨浆虫病。分别参阅美国专利No.4,462,985、澳大利亚专利No.608519、澳大利专利No.583332和美国专利No.5,215,741。另外,美国专利No.5,017,371公开了按这种方式使用干扰素治疗恶性肿瘤化疗或放疗后的副作用。在这些说明书中,所使用的干扰素都是按Cantell的方法制备的、加在磷酸盐缓冲盐水中以每磅体重0.01至5IU的剂量给药的人α干扰素。虽然这些说明书中都提出经口咽粘膜并优选以适合与口粘膜长时间接触的方式完成如此低剂量的干扰素的给药对于治疗包括肿瘤在内的各种病理条件可能是有效的,但除了运输热、猫白血病、犬细小病毒感染和泰勒氏梨浆虫以外的病理条件的实验证据大都是轶事性的。具体地说,还没有提出在任何动物模型中对人类肿瘤进行这种治疗的适当的对照试验。
已经有人对近年来有关通过口或口咽粘膜给药的非常低剂量干扰素的效果的研究结果进行了综述(Bocci,Clin.Pharmacokinet..1991,21:411-417;Critic.Reu.Therap.Drug Carrier Systems.1992,9:91-133;Cummins and Georgiades,Archiuum.Immun.Therap.Exp.,1993,41:169-172)。已有人提出这种类型的治疗对于治疗HIV感染是特别有用的,并且至少可以改善爱滋病患者的生存质量(Kaiser等人,AIDS,1992,6:563-569;Koech等人,Mol.Biol.Ther.,1990,2:91-95)。然而,其他一些报告指出这些治疗并没有提供临床益处。也已有人报告了使用包含低剂量干扰素的含片治疗乙型肝炎的阶段Ⅰ的研究结果(Zeilinska等人,Archiv.Immunol.Therap.Exp.,1993.41:241-252)。
相反,Brigham和Women's Hospital的国际专利申请No.WO95/27499指出在充分认定的动物模型中,如果在诱导抗原之前以胃管法投用β干扰素,至少可部分地抑制如Ⅰ型糖尿病、多发性硬化症及自身免疫性关节炎等自身免疫病的发展。借助这种途经或腹腔内途径与胃内“旁观者”抗原结合给药的β干扰素在诱导耐受性方面甚至更有效。这意味着β干扰素在提高口服耐受性的诱导作用中是有效的,而不是在诱导体液或细胞对外源性抗原的反应方面有效。
在澳大利亚临时专利申请No.PN9765中,揭示了借助口粘膜途径向口咽腔内给药的低剂量干扰素在防止小鼠遭受高转移性肿瘤细胞的攻击方面是有效的。这些结果异乎寻常的特征,连同目前几乎没有物质对这些颇具侵害性的肿瘤呈现活性这一事实,都表明在治疗癌症时向口咽腔内投用干扰素是有用的。在治疗向腹腔内注射脑心肌炎病毒(EMCV)(该病毒通常引起以牵连中枢神经系统和脑炎为特征的迅速恶化的致死性疾病)的小鼠时,经口粘膜给药的低剂量干扰素也是有效的。虽然这个系统是非常严格的抗病毒活性试验,但经口粘膜的干扰素给药途径与腹膜内给药差不多同样有效。
本发明概述本发明提供一种通过口粘膜完成干扰素给药刺激哺乳动物宿主防御机制的方法,其中给药剂量高于胃肠道外给药时引发病理学反应的剂量,即通常在人体内有高于大约20×106IU的均质干扰素-α。对于另一种类型的干扰素,诱发病理反应的剂量可能不同于均质干扰素α在人体内诱发这种反应的剂量。
一个方面,本发明可看作是一种通过口粘膜接触给哺乳动物投用免疫刺激量的干扰素刺激哺乳动物体内免疫反应的方法,其中所述剂量超过胃肠道外给药时同种干扰素诱发病理反应的剂量。
换言之,本发明提供一种借助经口粘膜完成干扰素给药的提高干扰素治疗指数的方法。
口粘膜给药可能涉及以单一剂量完成干扰素有效剂量的给药,或者在足以引发相当于单一剂量的免疫刺激作用的时间里以多次较小剂量完成有效剂量的给药。类似地,可以在足以诱发相当于单一剂量的作用的时间里完成干扰素剂量的连续给药。
在其应用方面,本发明借助口粘膜接触将有效剂量的干扰素提供给哺乳动物治疗自身免疫病、分枝杆菌病和神经性变性疾病、肿瘤条件及病毒感染方法,其中所述剂量超过胃肠道外给药时同种干扰素诱发病理反应的剂量。具体地说,本发明提供治疗关节炎、Ⅰ型糖尿病、狼疮和多发性硬化症等自身免疫病、麻风和结核病等分枝杆菌病、海绵状脑炎和Crelltzfeldt-Jakob病等神经性变性疾病、症疾等寄生虫病、以及宫颈癌、生殖器疮疹、乙型和丙型肝炎、HIV、HPV、HSV-1和HSV-2等病毒病的方法。
本发明还提供治疗多发性骨髓瘤、多毛细胞白血病、慢性骨髓性白血病、低级淋巴病、皮肤T细胞淋巴瘤、癌样肿瘤、宫颈癌、包括卡波西氏肉瘤在内的肉瘤、肾肿瘤、包括肾细胞癌、肝细胞癌、鼻咽癌、血癌、结肠直肠癌、成胶质细胞瘤、乳头状瘤、肺癌、结肠癌和恶性黑色素瘤在内的各种癌症、以及包括恶性脑肿瘤在内的脑肿瘤的方法。在一个实施方案中,该方法通常可应用于治疗非病毒病源学的肿瘤。
在另一个实施方案中,本发明提供适合口粘膜给药的药物组合物,该组合物包括治疗有效剂量的至少一种干扰素和医药上可接受的载体,其中所述剂量超过胃肠道外给药时引发病理反应的剂量。可以作为溶液、片剂、锭剂、凝胶、糖浆、软膏或控释口粘膜释放系统提供该组合物。非必选的是该组合物可以包含缓冲剂、稳定剂、增稠剂、吸收促进剂和增粘剂等。
在一个实施方案中,药物组合物是以含有大约20×106IU到大约1000×106IU干扰素、优选大约20×106IU到大约500×106IU、最优选大约50×106IU到大约500×106IU的单位剂量形式提供的。
该方法可以作为单独的治疗方法或作为放疗、化疗的辅助疗法来实践,或者用诸如白介素-2、-12或-15之类的细胞因子或干扰素诱导剂来实践。
该方法优选采用选自α-、β-、γ-、ω-和共有干扰素的Ⅰ型或Ⅱ型干扰素来完成,最优选采用重组IFN-α。
本发明的详细叙述现在将仅仅参照下面的定义和实施例详细介绍本发明。文中提及的全部专利和出版物均特意并入,以供参考。定义本文使用的术语“干扰素”指的是Ⅰ型或Ⅱ扰素,包括通常以α、β、γ和ω命名的干扰素以及它们的混合物(包括共有序列)。干扰素可以通过各种商业渠道购买,并且已被批准用于治疗许多主治病症。干扰素可以来自天然资源,但优选的是重组产品。就本发明的目的而言,术语“干扰素”还包括具有干扰素活性的多肽或其片段,以及在诸如美国专利第5,582,824、5,593,667和5,594,107号中公开的为了在不影响其生物活性性质的前提下提高稳定性而引入序列修饰的干扰素的嵌合或突变形式。
本语“高剂量”意思是高于借助诸如静脉或腹腔内之类的胃肠道外途径给药时通常可忍受的同种干扰素的最大剂量。正象目前预计的那样,对于70 kg重的成人,干扰素的高剂量是高于大约20×106IU的均质α干扰素。优选的剂量是高于大约30×106IU。在本发明特别优选的形式中,总剂量从大约50×106IU到大约1000×106IU,更优选从大约50×106IU到500×106IU。本文所说的“高剂量”通常被看作是经口粘膜给药时的治疗有效剂量,该剂量如果经胃肠道外给药将诱发病理反应,这种反应可由不可接受的副作用或毒性代用标志的出现来证实。高剂量的定义必然是灵活的,因为它可以依据病人的个体敏感性、身高、体重和年令、待治疗病症的性质及严重程度、所用的具体干扰素以及给药的特殊载体而有所变化。用特定的干扰素为病人治疗的医生将能迅速地确定适合待治疗的病人的高剂量范围。
干扰素可以非必选地与干扰素合成与释放的诱导剂同时给药。诱导剂可以与干扰素一起给药,也可以分开给药。例如,干扰素的诱导剂包括诸如polyI:C之类的多核苷酸;优先使用低分子量可口服给药的干扰素诱导剂。适当的诱导剂在技术上是已知的,例如双二乙氨乙基芴酮Tilorone(美国专利No.3,592,819;Albrecht等人,J.Med.Chem.,1974,17:1150-1156)和喹诺酮衍生物Imiguimcd(Savage等人,Brit.J.Cancer,1996 74:1482-1486)。
本发明的方法和组合物可以非必选地与一种或多种适合具体病症的其它治疗结合使用,而且医生或兽医将能够迅速地选择在该环境下适当的这类其它治疗。
在一个实施方案中,本发明提供一种治疗哺乳动物肿瘤病的方法,该方法包括上述干扰素的给药步骤。肿瘤病症包括转移性的癌。
尽管本发明的方法可以在没有采用其他药剂进行同时治疗的情况下使用,但预期本发明的这个实施方案在下述情况下将是特别有用的(a)作为按标准方法进行外科手术、化学治疗或放射治疗后的辅助治疗;
(b)用于治疗对干扰素敏感的肿瘤,单独利用或与常规的化疗或放疗结合使用本发明的方法;以及(c)用于治疗抗干扰素的肿瘤,单独利用、最优选的是与常规的化疗或放疗结合使用本发明的方法。
上述方法的目的是诱导和/或维持缓解疾病。“与其他治疗结合”意思是在进行放疗或其他化学治疗之前、期间和/或之后完成干扰素给药。最适宜的方法将取决于下文讨论的各种因素。
具体地说,预期本发明的方法将优先与至少一种选自下列一组方法的治疗结合使用,这组方法包括采用细胞生长抑制药物、一种或多种具有抗肿瘤活性又具有不同于干扰素作用机理的细胞因子、抗血管生成剂以及增强干扰素活性的药剂进行的化疗。优选的第二种细胞因子是白介素-1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素12(IL-12)或白介素15(IL-15);优选的血管生成抑制剂是AGM-1470;增强干扰素作用的处理优选体温升高或精氨酸丁酯。
优选的准备与干扰素结合给药的细胞生长抑制药物包括但不只限于环磷酰胺、顺式铂氨、卡铂、卡美斯汀(BCNU;N,N-双(2-氯基乙)-N-亚硝基脉)、氨甲喋呤、亚德里亚霉素、α-二氟甲基乌氨酸和5-氟尿喀啶。
对这种方法敏感的肿瘤条件包括但不只限于对高剂量IFN-α胃肠道外给药有反应的癌,例如血液恶性瘤、多发性骨髓瘤、多毛细胞白血病,或慢性骨髓性白血病、低级淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤;实体瘤,例如肾细胞癌和黑色素癌;类癌肿瘤;或与爱滋病有关的卡波西氏肉瘤,特别是非病毒病原性恶性肿瘤。病毒性病症可以是急性或暴发性感染,如鼻病毒、流感、水痘疮疹、带状疮疹、登革热;或病毒性脑炎,包括但不只限于麻诊病毒脑炎、Marray Valley脑炎、日本乙型脑炎、森林脑炎和Herpes脑炎;出血热,例如感染Ebola病毒、Marburg病毒、Lassa热、Hanta病毒以及由动物传播给人的其他病毒(如马麻疹病毒感染)。其中许多病症目前还没有治疗办法和/或可利用的疫苗,而且支持疗法可能是不适当的。另外,病毒病症可能是慢性感染的结果,例如乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎或其他类型病毒性肝炎,以及CMV、HIV、HPV以及HPVⅠ型和Ⅱ型感染。乙型肝炎和丙型肝炎目前都用干扰素经胃肠道外给药治疗;对于已发展成爱滋病的HIV感染的长期干扰素治疗正在临床试用之中。
在第二个实施方案中,待治疗的疾病是疟疾,而且Ⅰ型和Ⅱ型干扰素再次给药。疟疾的病原生物体可以是三日疟原虫、恶性疟原虫、卵形疟原虫。特别期待的是本发明的方法将阻止疟疾向脑型疟疾发展。
在第三个实施方案中,本发明提供治疗自身免疫机能紊乱(例如复-缓解型或慢性进行性的HIV、类风湿性关节类及多发性硬化症)或免疫缺陷(如爱滋病)的方法,其中包括上述的干扰素给药步骤。
另外,本发明的方法和剂量形式可以与其他疗法结合使用。例如,对于疱疹病毒感染,可以使用Acyclovir(阿若洛韦)或Ganciclovir(更昔洛)。对于HIV感染,可以使用叠氮胸苷(阿西夫定)或一种或多种其他HIV反转录酶抑制剂,和/或HIV蛋白酶抑制剂。
在本发明的药物组合物制剂中,可以使用各种适合IFN的载体和赋形剂,对于本领域的技术人员这些是显而易见的。在RemingtonThe Science and Practice of Phanrmacy(19th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1995)及其以前的版本中阐述了有代表性的配制技术。在美国专利No.4,496,537中介绍的那样,IFN配方可包括诸如甘氨酸或丙氨酸之类稳定性增强剂,和/或的一种或多种载体(如载体蛋白质)。例如,为了治疗人的疾病,可以将药品级人血清白蛋白非必选地与作为稀释剂的磷酸盐缓冲盐水一起使用。在IFN的赋形剂是人血清蛋白的场合,人血清蛋白可以得自人血清,也可以是重组源的。在使用血清蛋白时,血清蛋白通常是均质源的。
可以借助任何使IFN与受体的口粘膜腔接触的方法完成IFN的给药。因此,应当明确地理解,本发明不限于任何具体类型的的配方。本说明书描述深入口粘膜腔完成IFN给药;这可以用液体、固体、或气溶胶、以及滴鼻或喷雾来实现。因此,本发明包括但不限于液体、喷雾剂、糖浆、锭剂、含片和喷雾剂配方。熟悉此项技术的人将承认对于气溶胶或喷雾剂配方,制剂的粒度可能很重要的,并将知道适当的粒度调整方法。
一个方面,干扰素以单次量给药。另一方面,干扰素以多次低剂量分布在一段时间内给药,以使总效应相当于较高的单次量给药。实现这种给药方式的一种途径是提供一种附着在或植入到口粘膜腔中能持续或受控释放干扰素的装置,而且该装置是为了在一段时间内释放相当于较高的单次量的量的干扰素而设计的。
适合口粘膜使用的有代表性的干扰素配方包括下述配方(所有的百分比均为重量百分比)片剂右旋糖BP 45%;白明胶BP 30%;小麦淀粉BP11%;羧甲纤维素钠BP5%;卵白蛋白BPC4%;亮氨酸3%;丙二醇BP 2%;和50×106IUIFN-α2。该片剂可以原样使用并允许在嘴里缓慢地溶解,也可以溶解在水中并在需要时含在嘴中保持与口粘膜接触。
干扰素软膏可以象在美国专利No.4,615,184中介绍的那样由甘油45%、羧甲纤维素钠2%、柠檬酸盐缓冲液(PH4.5)25%、加至100%的蒸馏水和50×106IU IFN-α2来制备。干扰素软膏可粘附在口颊粘膜上。
同样,将所需剂量的干扰素加到市售的嗽口液或止咳糖浆配方中就可以制备嗽液或糖浆。
在上文提到的特定剂量范围内,任何个体病例的最佳治疗剂量取决于所涉及病症的性质、疾病的阶段、以前的治疗情况、其他正在继续的治疗、哺乳动物的一般健康状况、治疗对象对干扰素的敏感性等因素,所以,该剂量任凭医生或兽医考虑所有这些情况后所作的决断。疗程长短将随被治疗的病情而异,例如,治疗缓慢生长的癌(如前列腺癌)可能涉及与快速生长的癌(如肝细胞癌)不同的疗程。类似地,急性感染(如由Ebola病毒引起的感染)可能涉及与慢性感染(例如肝炎)不同的疗程。
文中揭示的有效剂量是经胃肠道外给药时在哺乳动物体内可以产生病理反应的剂量,而且在经口粘膜给药时既有效又无毒或低毒。病理反应可以是急性的、慢性的或累积性的,并可以通过血液化学的变化(例如白细胞减少、骨髓机能减退)或其他组织学参数得到证实。文中所用的术语“病理反应”包括诸如发烧、不适、类似流感的症状之类不良的副作用;诸如静脉炎之类的血管反应;以及注射部位的局部炎性反应。从个体对干扰素敏感性的差异上看,这些反应在病人群体中将有相当大的变化。
对于许多病人,口粘膜给药剂量超过按已批准的胃肠道外给药方法准备耐受的已知剂量是完全可能的。在一个实施方案中、总剂量可以在一段时间内以多次低剂量完成给药,甚至或可以从附着到或植入到口粘膜上的控释装置连续地或以脉动方式给药。干扰素和干扰素配方小鼠IFN-α/β小鼠干扰素-α/β(Mu IFN-α/β)是由新域病病毒(NDV)诱导的C243-3细胞的培养基制备的并按以前介绍的方法提纯(Tovey等人,Proc.Soc.Exp.Biol.and Med.,1974,146:809-815)。在象前面的介绍(Tovey等人,Proc.Soc.Exp.Biol.and Med.,1974,146:809-815)那样,在受疱疹口腔炎病毒(VSV)攻击的小鼠929细胞上检测时,这项研究中使用的制剂具有4×106国际单位(IU)/ml的滴度和5×107IU/mg蛋白质的比活性。对照美国国立卫生研究所(NIH)的鼠性IFN-α/β国际基准制剂(G-002-9004-5411)对该制剂进行标准化处理。
人体干扰素-α-1-8象以前介绍的那样(Meister等人,J.Gen.Virol.,1986,67:1633-1643),制备和纯化重组的人体干扰素-α1-8(HuIFN-α1-8;BDBBlot no.CGP 35269-1,Ciba Geigy,Basel,Switzerland)。象以前介绍的那样(Tovey等人,Nature,1977 267:455-457),这项研究所用的制剂在受VSV攻击的均质的人体WISH细胞上具有70×106IU/ml的滴度,而且在异质的鼠L929细胞上有1×106IU/ml的滴度。对照NIH人体IFN-α国际基准制剂(G-023-901-527)和NIH鼠IFN-α/β标准(G-002-9004-5411)两者完成该制剂的标准化。该IFN制剂的比活性为2×108IU/mg蛋白质。
重组的鼠干扰素-α重组的鼠干扰素-α购自Life Technologies公司。这项研究所用的制剂(批号HKK404)在受VSV攻击的鼠L929细胞上检测(Tovey等人,Proc.Soc.Exp.Biol.Mled.,1974,146:406-415)时具有6×106IU/ml的滴度和6×108IU/mg蛋白质的比活性。
重组的鼠干扰素-β重组的鼠干扰素-β购自R&D Systems公司。这项研究所用的制剂(批号1976-01S)在受VSV攻击的鼠L929细胞上检测(Tovey等人,Proc.Soc.Exp.Biol.Mled.,1974,146:406-415)时具有3.2×104IU/ml的滴度和8×106IU/mg蛋白质的比活性。
重组的鼠干扰素-γ重组的鼠干扰素-γ购自R&D Sysyems公司。这项研究所用的制剂(2580-03SA)在受VSV攻击的鼠L929细胞上检测(Tovey等人,Proc.Soc.Exp.Biol.Mled.,1974,146:406-415)时具有2×105IU/ml的滴度和1×107IU/mg蛋白质的比活性。
所有的干扰素制剂在同一试验中同时滴定,并对照美国国立卫生研究所(NIH)的鼠干扰素α/β国际基准制剂(G-002-9004-5411)进行标准化处理。
小鼠干扰素α/β和重组小鼠干扰素两者均在给药前用FerimmuneTM赋形剂重新配制。赋形剂干扰素制剂将用包含牛血清蛋白质(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)或下述的专有赋形剂进行稀释。将牛血清血蛋白馏份V(RIA级,无疫球蛋白;药品批号A7888;Sigma,VSA)以100μg/ml的最终浓度溶解在PBS(pH7.4)中并借助过滤(0.2μ,Millex-GV,Millipore,USA)除菌。
在本文所述的实验中,用专有赋形剂稀释干扰素制剂。所用的赋形剂是以片剂形式(Ferimmune harma,Pacific)供应的下述赋形剂
**在无水基础上计算的***推导自右旋糖(葡萄糖)BP(无水的) 44.46%葡萄糖BP(作为葡聚糖40注射剂) 0.03%将一片溶解于1.5ml磷酸盐缓冲盐水中,以16,000g离心15分钟,然后无菌过滤(0.2μ,Millex-GV,Millipore,USA),并在使用前在4℃下贮存。每天使用前制备赋形剂。干扰素递送系统初步的实验结果表明用P20 Eppendorf微量移液管将5μl结晶紫施加到正常成年小鼠的每个鼻孔中,这将导致染料几乎立即分布到口咽腔的整个表面上。在施加染料后约30分钟,口咽腔的着染仍很明显。采用同样方式施加带125I-标记的重组干扰素α1-8,获得基本上相似的结果。所以,这种给药方法被用在所有的后续实验中。
就本说明书中介绍的动物实验目的而言,人们将会清楚地理解,有关IFN给药途径的表述“口粘膜”或“口咽”或“鼻内/口”或“鼻内加口”或“in/or”都是指深入鼻腔的IFN制剂给药,以使它迅速分布到口粘膜腔内,即受体动物的口和咽部内,以便与该腔的粘膜衬接触。EMCV(脑心肌炎病毒)分比比号095001截止日期1997年12月制备使用以前描述的方法(Gresser I.Bourali C,Thomas MT,Falcoff E.重复接种干扰素制剂对感染脑心肌炎病毒的小鼠的影响,Pro Soc Exp.Biol Med.,1968年2月,127:491-6)在小鼠L929的细胞上增殖EMCV毒株JH。
特征这项研究所用的病毒原液在小鼠L929细胞上的滴度为5×108.62TCID50。
贮存在-70℃贮存EMCV原液。在病毒滴定的第1天断电,被迫暂时转移到温度近似相同的备用库。材料始终保持冻结状态。在病毒滴定的第8天,将-70℃的冰箱温度升至-60℃。即将使用前制备稀释的EMCV,并存放在冰上或动物室冰箱内备用。Friend红白血病细胞E.Affabris,Rome博士获得了Friend红白血病细胞(FLC)的抗IFN-α/β克隆3C18,并且作了详细介绍(Virology,1982,120:441-452)。借助活体内继代移种法保留这些细胞。简单地说,借助腹膜内注射(ip)给DBA/2小鼠接种大约100LD50的3C18细胞,一周后从小鼠腹腔中收获肿瘤细胞并计数,然后再次用100LD50的3C18细胞给其他小鼠接种。用这种方法重复继代移种60至100次。业已发现,在第60至第100次活体内继代移种所用的3C18细胞对肝和脾脏具有高转移性(Gresser等人,Int.J.Cancer,1987,39:789-792)。在有IFN-α/β存在的条件下活体外培养活体内继代移种的细胞证实了抗干扰素性的表型(Belardell等人,Int.J.Caner,1982 30:813-820)。L1210R6克隆&EL4可移植的肿瘤L1210淋巴瘤细胞的抗干扰素-α/β克隆L1210R6是在我们的实验室分离的(Gresser等人,1974,干扰素和细胞分裂,Ⅸ.抗干扰素的L1210细胞特征和来源,J.Nat.Cancer Inst.,52:553-559)。
EL4可移植性肿瘤最初来源于接种化学致瘤剂1-2二甲基苯并蒽的小鼠(Gorer,P.A.,1950,Br.J.Cancer,4:372-381)。
借助用无特异病原体的DBA/2小鼠进行一系列活体内继代移种保留L1210淋巴瘤细胞。
借助用无特异病原体的C57BL/6小鼠进行活体内继代移种维持EL4肿瘤。B16黑色素瘤B16黑色素瘤是源于C57BL/6小鼠自发来源的可移植性肿瘤(Fidler I.J.and Kriple,M.L.,1977,Science 197:893-897)。B16黑色素瘤是一种迅速生长的、高度退行发育的,主要向肺转移的黑色素生成的肿瘤。一般认为B16黑色素瘤迅速生长的,有高度攻击性的人类肿瘤核型。
B16黑色素瘤细胞在无特异病原体的C57BL/6小鼠体内靠-系列继代移种维持的。动物在这项研究中所用的小鼠是从无特异病原体的群体(IFFACREDO,France)获得的。这些小鼠按照EEC标准圈养在无特异病原体的动物试验室内(位于Institut Federatif CNRS,Villejuif)。干扰素的生物检定按照常规方法检定干扰素。简单地说,样品(20μl)用80μl包含2%热灭活的胎牛血清(FCS)(Gibco,France)的Eagle氏极限基本培养基MEM(Gibco,France)稀释,并且用多道移液管(Finnpipette,Labsystem,50-300ml)添加到微量滴定板(Falcon,批号3072)的每个孔中。将WISH或L929细胞(2×104细胞/孔)添加到包含2%FCS的100μl MEN中并在含5%CO2的空气气氛(Forma 3029 CO2孵箱)中在37℃下孵化过夜。然后用装有10倍物镜的OlympusIM GLDW倒置显然微镜检查细胞的毒性征象。然后,从1∶10稀释开始以包含2%FCS的总体积为200μl的Eagle氏MEM对未呈现可检出毒性的样品进行连续的加倍稀释,其方法是用多道移液管将100μl稀释材料归入每孔包含100μl新鲜的含2%FCS的Eagle氏MEM的微板上。同时还制备NIH人IFN-α的参考标准(G-023-901-527)或NIH Mu IFN-α/β的参考标准(G-002-9004-5411)的适当的连续加倍稀释液。然后,在适当的环境中用100ml包含2%FCS的Eagle氏MEM将WISH或L929细胞(2×104细胞/孔)添加到每块板上,并在含有5%CO2的空气环境中在37℃下保温过夜。然后检查细胞单层的毒性征象并且没有任何显著的毒性,将培养物抽吸出来并用200μl含有2%FCS和100 TCID50的VSV(WISH细胞为2×10-4VSV23,或L929细胞为10-5VSV23)的Eagle氏MEM替代。然后,将这些板在包含5%CO2的空气气氛中在37℃下保温过夜。然后,用OlympusIM VLWD倒置显微镜检查细胞单层有无特异病毒的细胞病变作用。干扰素的滴度是由给出50%抗特异病毒细胞病变效应的稀释度的倒数确定的,并且以国际参考单位/毫升(IU/ml)表示。实施例1用EMCV(脑心肌炎病毒)致死性攻击反高剂量干扰素对存活率的影响用注射了致死量的EMCV的雄性和雌性小鼠试验经口粘膜途径完成1,000、10,000、100,000IU的IFN-α给药效果。试验不同类型的IFN-α,并且将口粘膜途径给药的效果与经腹腔(ip)途径给药的效果进行比较。除了在致死性攻击后监测存活率外,还使用各种临床化学和血液学参数监测IFN疗法的毒性。
在病毒感染后开始经口粘膜途径用105IU的IFN-α给小鼠进行治疗,每天一次治疗4天,结果所有的动物都得到完全保护。经IFN治疗的动物全部存活,而且在未经治疗的感染病毒的对照组动物到第7天全部死亡的条件下,在感染致死剂量的EMCV(100LD50)后存活100天。
按体重计算,经口粘膜途径用105IU治疗小鼠相当于人的剂量为240×106IU,据我们所知,这个剂量远远大于人的实际用药剂量。
因为用105IU的IFN-α经in/or途径治疗小鼠产生比用104IU IFN-α治疗动物可产生更大程度的保护作用,所以用更高剂量的IFN-α可能会获得更大的效果(对抗更大的病毒或肿瘤负荷)。迄今为止,我们尚未在剂量-反应曲线中观察到任何平台指征。
我们的结果还证明,以in/or途径给药的超高剂量的IFN具有高度保护性抗病毒作用,并且以这种途径给药的105IU IFN-α可完全抵御所用剂量的EMCV。尽管事实上按体重计算所用剂量远远高于对人的给药剂量(相当于240×106IU),但并没有观察到临床的、生物化学的或血液学的毒性证据。相反,在临床实践中经胃肠道外给药的IFN最大耐受剂量是在每天20-30×106IU范围内。实施例2高剂量IFN-α对受高转移性肿瘤细胞攻击的小鼠的影响第0天,用105个抗干扰素克隆3C18的Friend红白血病细胞或105个L1210淋巴瘤细胞(抗干扰素的L1210R细胞)静脉内攻击每组10只6周令的DBA/2小鼠。接种后,这些小鼠一部分保留不作治疗,另一部分经in/or途径进行治疗,每天治疗两次,治疗20天,其中一部分用加在10μl赋形剂中的105IU小鼠IFN-α/β,另一部分单独采用10μl赋形剂(对照组)。
50%经in/or途径用IFN治疗的动物存活,而且在接种高转移性Friend红白血病细胞后存活100天以上。30%经in/or途径用IFN台疗的动物存活,并且在用L1210淋巴瘤细胞攻击后存活100天以上。临床观察提示,如果不杀死动物,所有经IFN治疗存活100天的动物具有正常的寿命。对器官的组织学检查表明不存在残留的肿瘤。相反,所有未治疗动物和对照组动物分别在受Friend红白血病细胞攻击后的第13天死亡或在受L1210淋巴瘤细胞攻击后的第14天死亡。
这些结果是特别有意义的,因为这两种肿瘤细胞都是有高度攻击性的,而且所用的攻击剂量相当于LD50的大约20,000倍。此外,Friend白血病和LR10淋巴瘤是完全不同的肿瘤类型,其中Friend白血病细胞携带一种反录病毒即Friend白血病病毒,而L1210淋巴瘤则与任何已知病毒病原学无关。用in/or IFN-α治疗已接种L1210淋巴瘤的动物所得到的结果似乎等于甚或优于在该模型中用IFN-α系统治疗所得到的结果(I.Gresser,来公布的结果)。在我们的澳大利亚临时专利申请No PN 9765中所报导的我们以前的研究中,接种了Friend白血病细胞并用100或1,000IU的IFN-α治疗的小鼠无一存活,而且以10,000 IU的剂量治疗只有10-20%的动物被认为是被治愈的。实施例3高剂量IFN-α对受高转移性B16黑色素瘤细胞或EL4肿瘤细胞攻击的小鼠的影响用105个B16黑色素瘤细胞或105个EL4肿瘤细胞静脉内攻击每组10只6周令的C57B1/6小鼠。接种后,这些小鼠一部分留下不作治疗,另一部分经in/or途径进行治疗,每天治疗两次,治疗20天,其中一部分用加在10μl赋形剂中的105IU小鼠IFN-α/β而另一部分单独采用10μl赋形剂(对照组)。
30%经in/or途径用IFN治疗的动物存活,而且在接种高转移性B16黑色素瘤细胞或EL4肿瘤细胞之后存活100天以上。相反,未经治疗的动物和对照组动物则分别在受B16黑色素瘤细胞攻击后第20天和在受L4肿瘤细胞攻击后第22天死亡。临床观察提示,即使在第20天时停止干扰素治疗,如果不杀死动物,在第100天还活着的所有经过IFN治疗的动物仍将存活下去。对器管的组织学检查表明,在第100天杀死的经干扰素治疗的动物体内没有残留的肿瘤。实施例4口粘膜给药的干扰素对抗疱疹口腔炎病毒的效果用10μl体积100 LD50的疮疹性口腔炎病毒(VSV)(tovey等人,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,1974,146:406-415)鼻内感染来自无特异病原体繁殖群体的数组10只6周令小鼠。病毒感染后几小时一部分小鼠留下不作治疗,另一部分经鼻内/口途径进行治疗,每天1次,治疗4天,其中一部分用加在10μlFerimmune赋形剂中的给定剂量的干扰素α/β进行治疗,而另一部分只用10μl Ferimmune赋形剂(对照组)。
用鼠干扰素α/β治疗成年鼠导致受致死剂量VSV感染的动物存活的百分率显著提高。因此,在未治疗的或只用赋形剂进行对照治疗的受病毒感染的动物在第10天死亡的条件下,30%经10,000 IU干扰素α/β治疗的动物在感染致死量的VSV后的第21天仍存活。临床观察提示,大多数经干扰素治疗在第21天还活着的动物将继续存活。实施例5口粘膜给药的干扰素对细胞的蛋白质表达式的影响已知IFN-α在将蛋白质与其细胞表面受体结合后诱导许多细胞的蛋白质表达式。有人认为这些蛋白质提供有用的IFN作用标志。
我们评价了通过in/or途径给药的IFN对三种IFN诱导的蛋白质(即I类MHC抗原、LY 6A/E抗原和2’-5’-寡腺苷酸合成酶)表达式的影响。
在经腹腔给药仅20 IU MuIFN-α就在外围血液单核细胞和粒细胞上显著增加H-2-Kd抗原表达式的条件下,经in/or途径用高达20,000IU的MuIFN-α治疗DBA/2小鼠(H-2Kd)并不显著地增加外围血液淋巴细胞、单核细胞或粒细胞上的H-2-Kd表达式。单核细胞上的表达式确实略微受到抑制。
同样,通过in/or途径用高达20.000IU的Mu IFN-α治疗小鼠对Ly6A/E抗原的表达式没有显著的影响,而该抗原表达式在经胃肠道外途径用Ⅰ型IFN治疗后在各种淋巴样细胞的表面上被显著增强(Damout等人,J.Immunol.,1986,137:201-210)。通过in/or途径用200或20,000 IU的Mu IFN-α或Hu IFN-α1-8获得相似的结果。
用只有20 IU的Mu IFN-α经腹腔注射治疗Swisss小鼠或DBA/2小鼠,结果是在外围血液单核细胞或脾细胞两者中2'-5'-寡腺苷酸合成酶的活性显著增加。相反,在同一实验中通过in/or途径用高达20,000IU的Mu IFN-α治疗小鼠没有显著地增加2'-5'-寡腺苷酸合成酶活性的表达式。另外,经in/or途径用200或20,000IU的Mu IFN-α或MU IFN-α1-8进行治疗在开始IFN治疗后长达10天的时间里任何时候对2'-5'-寡腺苷酸合成酶的活性都没有显著影响。实施例6口粘膜给药后干扰素的生物利用率为了检验IFN的生物利用率和药物动力学,用125Ⅰ可能标识到最高比放射性的高单次剂量重组IFN-α来治疗药物-血液体积比最有利于这些研究的小鼠。
将70×106IU Hu IFN-α1-8的纯制剂重新溶解在1.4ml的PBS中,并且象Mogensen等人介绍的那样(Int.T.Cancer,1981,28:575-582)采用Hunter和Greenwood介绍的改良氯胺T法(Nature,1962,194:495-496)进行碘处理。
125I标记的HuIFN-α1-8(批号CGP35269-1)在受VSV攻击的人体WISH细胞上检测时呈现2×107IU/ml的生物学活性,而在受VSV攻击的小鼠L929细胞上检测时呈现1×106IU/ml的生物学活性。
6至7周令的雌性Swiss鼠用相当于1×106鼠IU的2×107IU125IHuIFN-α1-8(1.0369×107cpm/小鼠)经iv、ip注射或经in/or途径治疗。在指定的时间点,每组杀死3只鼠,收集血液并确定体积。分离并收集动物的肾、肝、肺、脾和胃/食管,打上印迹,并称重,精确到±0.1μg。利用γ-计数器分别确定每个样品的放射性。然后,借助离心(800g×10分钟,4℃)分离全血,收获血清,记数并在-80℃下冷冻。然后,如上所述利用标准的生物检定法在人体WISH细胞和小鼠L929细胞上检测血清的IFN含量。然后,借助亲和层析法分离存在于血清样品中的放射性物质,并借助SDS-PAGE法进行分析。
在每只鼠静脉注射1.0369×107cpm带125I标记的Hu IFN-α1-8之后5分钟,在动物的外围血液中检测到非常高水平的放射性(>2×106cpm/ml)。在第15分钟和30分钟,存在于全血中的放射性两逐步降低。腹腔注射1.0369×107cpm的125I HU IFN-α1-8之后5分钟,在动物的外围血液中检测到的放射性的水平大约比静脉注射后检测到的低20倍。在注射后第15和30分钟的放射性水平逐步增加。在经in/or途径完成125IIFN-α1-8给药后第5、10或15分钟在动物血液中检测到的放射性水平显著低于在腹腔注射相同剂量带放射标记的IFN之后的给定时刻经定时间检测到的放射性水平。就所有三种给药途径而言,经in/or完成带125I标记的IFN-α1-8给药后,在血清中检测到的放射性水平比在全血中检测到的高。与同样体积的血清相比,每毫升全血中检测到的放射性水平较低反映出在去掉全血中细胞成分之后计数的血清有效体积较大。
采用上述的标准生物检定法检测研究中所有的小鼠血清样品以确定有生物活性的IFN存在,结果表明在所有试验的时间点上,静脉或腹腔注射125I Mu IFN-α1-8的所有动物的血清中都有容易检测的有生物活性的IFN。反之,在经in/or途径完成IFN给药后在任何试验的时间点在所有动物的血清中都没有检测到带生物活性的IFN,尽管在这些动物的血清中有较高水平的放射性存在。
为了确定在经125I Mu IFN-α1-8治疗的动物血清中检测到的放射性物质是否确实代表天然IFN,样品用蛋白质A-G琼脂糖进行免疫沉淀,以便将存在于样品中的免疫球蛋白沉淀出来,用亲和纯化的多克隆抗干扰素-α的抗体处理后再次进行免疫沉淀。然后,对样品进行上述的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。
对静脉或腹腔注射125I MU IFN-α1-8后血清中放射性物质进行的SDS-PAGE分析揭示出一条均匀的迁移带,其中电泳迁移率与未注射125I MU IFN-α1-8的完全一致。估计该物质的表现分子量约为20000道尔顿,它与天然的HuIFN-α1-8的分子量完全相符。完全相符。反之,来自经in/or用125I MuIFN-α1-8治疗的小鼠的血清样品无一包含任何表观分子量与天然IFN的分子量相似的物质,既使在每个凝胶上加入完全相同量的放射性物质。
带放射标记物质的组织分布揭示在静脉注射125I Mu IFN-α1-8后5分钟,动物的肾脏中有非常高水平的放射性,在肝、肺和脾脏中也有高水平的放射性。随后发现存在于这四个器官中的放射性水平在15和30分钟逐渐降低。相反,在15和30分钟时,胃中的放射性水平逐渐增高,达到与静脉注射后30分钟时动物血清中存在的放射性差不多的水平。
借助腹腔注射完成125I Mu IFN-α1-8给药导致在15分钟内受检的所有组织中放射性均达到峰值水平,接下来在第30分钟降低。类似地,经in/or途径完成125I Hu IFN-α1-8给药导致在15分钟后被研究的所有组织中的放射性均达到峰值水平,30分钟时存在的放射性水平有些下降。经in/or途径完成125I Hu IFN-α1-8给药后存在于胃/食管中的放射性水平比在任何其他器官中检测到的水平高一个数量级,而且显著高于借助静脉或腹腔途径完成同样剂量的带放射标记的Hu IFN-α1-8给药后存在于这些组织中的放射性水平。实验例7经鼻内/口给药后干扰素的药物动力学为了准确地测定HuIFN-α1-8的药物动力学,以每只小鼠1.0369×107cpm的剂量用125I HUIFN-α1-8经iv、ip或in/or途径给小鼠治疗,并在24小时期间内的一系列时间点测定在全血和血清中存在的放射性水平。
静脉注射后存在于小鼠血液中的125I标记的Hu IFN-α1-8的药物动力学曲线十分接近对数清除曲线。这个结果与以前利用密切相关的分子(即重组人αA/D(Bg1))进行的小鼠研究(Bohoslawed等人;J.IFN Res.,1986,6:207-213)的结果相符。根据浓度时间曲线下的面积计算出的生物可利用物质的量也与人αA/D的那个量相似。静脉注射125I HU IFN-α1-8后观察双相对程清除曲线(其为通过肾脏清除的物质的特征),结果与实施例6的结果一致。腹腔注射后,带125I标记的IFN-α1-8的药物动力学与以前报导的肌肉注射IFN的结果十分相似。
静脉或腹腔注射带125I标记的IFN-α1-8后,在所有动物的血清中存在很容易检测到的有生物活性的IFN。
1、抗肿瘤活性的讨论因为Friend红白血病细胞(FLC)在静脉注射后对肝和脾脏都表现出很高的恶性程度和转移性,所以Friend红白血病模型构成非常严格的抗肿瘤活性临床前试验。使用该模型得到的结果确实是采用胃肠道外途径注射IFN-α治疗人类肿瘤的基础。因此,在这项研究进行的全部试验中,所有末经治疗的和用对照制剂治疗的动物均在10至11天死亡。如果不作治疗,仅仅注射4或5个FLC细胞就会杀死小鼠。相反,某些经口粘膜途径用鼠IFN-α治疗的动物在接种105个FLC后仍然存货100天以上,并且可以认为它们已被治愈。
的确,根据以前的工作判断,经口粘膜途径给药的IFN-α似乎比经胃肠道外给药的环磷酰胺、5-氟尿嘧啶或氨甲喋呤更为有效,后一途径仅使注射FLC的动物存活时间增加几天(Gresser等人,J.Natl.CanerInst.,1988,80:126-131)。顺式铂氨、长春花新碱、阿霉素、博来霉素或表鬼臼毒吡喃葡糖苷等其他药物则对这种肿瘤无效(Gresser等人,J.Natl.Caner Inst.,1988,80:126-131)。
同样,经口粘膜途径给药的IFN-α在抗FLC方面似乎比全身给药的IL-1β、IL-2和INF-α等其他细胞因子更为有效,这些细胞因子在该模型中只表现出很小的活性。
以前的工作已显示,在该模型中胃肠道外给药的IFN是最有活力的抗肿瘤药物之一,而且即使肿瘤已经转移到肝中才开始IFN台疗也是有效的(Gresser等人;Intl.J.Caner,1987,39:789-792)。目前的结果表明IFN经口粘膜途径给药同样甚至更有效。
在淋巴瘤确诊后开始治疗时,每天IFN-α与单次剂量的环磷酰胺一起注射与单独用其中任何一种药剂治疗的动物相比显著地增加了患淋巴瘤的AKR小鼠的存活期(Gresser等人;Eur.J.Cancer,1978,14:97-99)。在各种临床前动物肿瘤模型中也已报导了成功地用IFN-αZβ和BCNU、顺式铂氨(cis-DDP)、氨甲喋呤、阿霉素和α-二氟甲基乌氨酸进行联合治疗。还报导了采用5-氟尿嘧啶(5-FV)和IFN的联合疗法在治疗转移性结肠癌时是十分有益的(Ernstoff等人;Journal of Clinical Oncology,1989,7:1764-1765)。然而,其他一些已报导的研究则显示当IFN治疗与环磷酰胺(Marguet等人,Int,J.Cancer,1983,31:223-226;Lee等人,Biochern.Pharmacol.,1984 33:4339-3443)、阿霉素(Blackwill等人,Cancer Res.,1984 44:904-908)或5-FU(Marquet等人,1985 109:156-158),即那些已证明与胃肠道外IFN台疗联合使用可发挥有利作用的药物结合反而降低了抗肿瘤活性。使用本文描述的方法可以很容易地试验出IFN与其他化学疗法的组合。
白介素-1(IL-1)与IFN α/B结合的疗法对注射了FLC的小鼠可产生协同抗肿瘤效果(Belardell等人,Im.J.Cancer,1991 49:274-278)。同样的疗法对Eb淋巴瘤地转移性变体(p11-R-Eb)也发挥显著的抗肿瘤效果,而单独使用其中任何一种药剂都没有效果(Gabriele等人,Invasion Metastasis,1993 13:147-162)。在所有受试的细胞因子中,已发现IL-1在与Ⅰ型IFN胃肠道外给药治疗结合时是最有效的。
将血管生成抑制剂AGM-1470[(氯乙酰)-氨基酸(3R-(3α,4α(2R*,3R*),5β,6β))-5-甲氧基-4-(2-甲基-3-(3-甲氧基-2-丁基)环氧乙基-1-氧杂螺(2,5)辛-6-基脂]与IFN-α/β一起给药的联合疗法与单独用其中任何一种药剂的疗法相比显著地增加了抗肿瘤效果(Brem等人,J.Pediatric Surgery,1993 28:1253-1257)。
业已发现,高体温将提高IFN-α/β对Lewis肺癌的抗肿瘤作用(yerushalmi等人,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,1982 169:413-415)。精氨酸丁脂也已表明可增强IFN-α的抗肿瘤作用(Chany and Cerutti,Int,J.Cancer,1982 30:489-493)。对于给定类型和剂量的IFN比较经口粘膜途径给药与系统给药(静脉注射)两者所获得的保护程度,结果表明在某些病例中IFN经胃肠道外给药比口粘膜给药或多或少地更有效一些,而在另一些病例中则不然。
2、抗病毒活性的讨论虽然在经in/or途径完成125IIFN-α1-8、MuIFN-α/β和MuIFN-α给药之后不能在动物的血清中检测到抗病毒活性,但仍可在这些动物中观察到对抗致死量EMCV感染的统计学上有意义的保护作用(表1)。
我们在明确定义的急性病毒感染的临床前模型中所获得的结果提供明确的证据,以支持将高剂量口粘膜IFN治疗用于人全身性病毒急性感染的“原理的验证”,并且表明在这个模型中多种IFN-α子型的天然混合物和单一重组的IFN-α异型(如Mu IFN-α)两者都发挥统计学上有意义的抗病毒活性。天然的Mu IFN-α/β和HuIFN-α1-8经口粘膜给药时似乎是同等有效的。重组MuIFN-β和MuIFN-γ也显示有相似的抗病毒活性。
将经口粘膜途径完成给定类型和剂量的IFN给药时所得到保护程度与全身给药(腹腔注射)后所得到的结果相比较,结果表明在某些病例中IFN经胃肠道外给药在某种程度上比经口粘膜给药更有效,而在其他病例中则不然。
表1用125I-IFN-α单一治疗对注射EMCv的Swiss小鼠存活率的影响
表2用MuIFN-α单一治疗(每天一次治疗4天)对注射FMCV的Swiss小鼠存活率的影响
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3.一般性讨论生物标志试验研究的结果非常清楚地表明三种受试的生物标志(Ⅰ类MHC抗原、Ly6A/E抗原和2'-5'-寡腺苷酸合成酶活性)都没有充分地反映出经口粘膜途径给药的IFN-α所呈现的非常显著的生物活性(例如,抗肿瘤和抗病毒活性)。
继腹腔内(ip)注射少至仅20 IU的IFN-α之后开始的所有试验中观察到三种IFN诱导的全部蛋白质的表达式中都有非常显著的增加,而多达20,000IU的IFN-α经口粘膜途径给药后却没有任何可测量的效果,两者之间的反差是显著的。
虽然我们不能排除在较早的或中间的时间点上有可能观察到对一种或另一种生物标志的影响,但是,这种情况似乎是不可能的,因为IFN影响这些蛋白质的基因代码的转录,因此人们在IFN治疗后只有经过很长的时间才可能看到对这些生物标志的影响。
另外,虽然我们不能排除在用IFN-α经口粘膜途径治疗后观察到对许多其他IFN诱导的蛋白质之一的全身性影响,但这似乎不可能,因为这将意味着差动调节某些IFN诱导的基因的表达式。然而,完全有可能在IFN-α(经口粘膜途径给药后在局部(例如在鼻淋巴细胞中)观察到对IFN生物标志的影响。
与对所研究的生物标志没有可检测的影响相符,即使在用高达20,000IU的IFN-α治疗的动物中也没有观察到对任何在IFN经口粘膜给药治疗期间所监测的血液学或血液化学参数的一致影响。
药物动力学-生物活性研究的结果很清楚地表明采用比以前所用方法敏感一个数量级的检测方法,在外围血液中没有可检出的IFN循环的条件下,单次量的带放射性标记的Hu IFN-α1-8经口粘膜给药后可获得统计学上有意义的抗病毒效果。与这些结果相一致,经口粘膜给药的IFN发挥抗病毒活性的程度似乎遵循经典的剂量-反应关系。
在带125I标记的IFN-α1-8经口粘膜给药之后在动物的全血和血清中都发现容易检测到的带放射性标记的物质。这些结果与以前研究的结果(即在口服大量的未带标记的IFN后在动物的血清中仍未检测出IFN)恰好相反。但是,经口粘膜给药后在全血和血清中检测出的放射性物质是无生物活性的。此外,SDS-PAGE分析的结果表明这种物质是低分子量的,并且很可能反映继IFN在胃和小肠中消化之后对降解产物的吸收作用。在口粘膜给药后带放射性标记的物质的组织分布的分析结果表明胃中的放射性水平明显地高于受检验的任何其他器官。我们的结果十分清楚地表明即使口粘膜给药后带生物活性的IFN不被吸收,这种疗法仍能在体内发挥有统计意义的抗肿瘤活性。
虽然不希望使观察到的有益作用拘泥于任何已提出的机制,但我们的结果意味着经口粘膜给药的IFN借助目前尚不明确的新机制发挥其抗肿瘤作用或抗病毒作用,这种机制不包括外源给药的IFN的直接作用,或对内源性IFN的诱导作用。没有可检水平的循环IFN或没有可检水平的受试的三种生物标志都支持这一观点。似乎这种机制至少可以部分地借助刺激鼻咽腔和口腔周围丰富的淋巴样组织发挥作用。因为我们已证明经口粘膜给药的IFN在效力上至少与全身给药的IFN相差无几,所以我们的试验结果强有力的支持在治疗肿瘤病和病毒性疾病时借助口粘膜途径完成IFN给药。这对于IFN的临床应用可能有重要意义。
本领域技术人员可以明确看出,虽然为了清晰和便于理解已对本发明作了相当详尽的描述,但是不脱离说明书中公开的本发明的精神和范围可以对本文描述的实施方案和方法作出各种修饰和改动。
权利要求
1.刺激哺乳动物体内宿主防御机制的方法,该方法包括通过口粘膜接触给哺乳动物投用刺激量的干扰素,所述剂量大于约20×106IU干扰素。
2.刺激哺乳动物体内免疫反应的方法,该方法包括通过口粘膜接触给哺乳动物投用免疫刺激量的干扰素,所述剂量大于约20×106IU干扰素。
3.根据权利要求1所述的方法,其中干扰素的有效剂量是以单一剂量投用的。
4.根据权利要求1所述的方法,其中干扰素的有效无毒剂量是在足以引发相当于单一剂量的免疫刺激作用的时间里以多次较小剂量投用的。
5.根据权利要求1所述的方法,其中干扰素的免疫刺激剂量是在足以引发相当于单一剂量的免疫刺激作用的时间里连续投用的。
6.治疗肿瘤病理条件的方法,该方法包括通过口粘膜接触给哺乳动物投用有效剂量的干扰素,所述剂量超过胃肠道外给药时同种干扰素的非病理剂量。
7.治疗病毒感染的方法,该方法包括通过口粘膜接触给哺乳动物投用有效剂量的干扰素,所述剂量超过胃肠道外给药时同种干扰素的非病理剂量。
8.根据权利要求1所述的方法,其中干扰素包括Ⅰ型干扰素。
9.根据权利要求8所述的方法,其中干扰素选自IFN-α、IFN-β、IFN-ω、共有IFN,和其混合物。
10.根据权利要求9所述的方法,其中IFN-α包括重组IFN-α。
11.根据权利要求1所述的方法,其中干扰素包括Ⅱ型干扰素。
12.根据权利要求11所述的方法,其中Ⅱ型干扰素包括γ-IFN。
13.根据权利要求6所述的方法,其中肿瘤病理条件是非病毒病原学的。
14.治疗哺乳动物的多发性骨髓炎、多毛细胞白血病、慢性骨髓性白血病、低级淋巴瘤、细胞淋巴瘤、癌样肿瘤、肾肿瘤、肾细胞癌、肝细胞癌、癌、肉瘤、血液恶性肿瘤、结肠直肠癌、成胶质细胞瘤、肺癌、结肠癌、和包括恶性脑肿瘤在内的脑肿瘤的方法,该方法包括通过口粘膜接触给哺乳动物投用有效治疗剂量的干扰素,所述剂量大于大约20×106IU。
15.根据权利要求14所述的方法,其中有效剂量的干扰素是以单一剂量投用的。
16.根据权利要求14所述的方法,其中有效剂量的干扰素是在足以引发相当于单一剂量的治疗反应的时间里以多个较小剂量投用的。
17.根据权利要求14所述的方法,其中干扰素的剂量是在足以引发相当于单一剂量的治疗反应的时间里连续给药的。
18.根据权利要求1所述的方法,其中干扰素的总剂量是从大约20×106IU到大约1000×106IU的干扰素。
19.根据权利要求1所述的方法,其中干扰素的剂量是从大约20×106IU到大约500×106IU的干扰素。
20.根据权利要求1所述的方法,其中干扰素的剂量是从大约50×106IU到大约500×106IU的干扰素。
21.根据权利要求14所述的方法进一步包括与放射治疗或化学治疗结合。
22.根据权利要求14所述的方法进一步包括投用其他细胞因子或干扰素诱导剂。
23.根据权利要求14所述的方法,其中干扰素包括Ⅰ型干扰素。
24.根据权利要求23所述的方法,其中干扰素选自IFN-α、IFN-β、FN-ω、共有IFN,和其混合物。
25.根据权利要求24所述的方法,其中IFN-α包括重组IFN-α。
26.根据权利要求14所述的方法,其中干扰素包括Ⅱ型干扰素。
27.根据权利要求26所述的方法,其中干扰素包括γ-扰素。
28.在制备适于经口粘膜接触刺激哺乳动物的宿主防御机制或免疫反应的药物中干扰素的应用,该药物包含刺激剂量的干扰素,所述剂量大于约20×106IU的干扰素。
29.根据权利要求28所述的应用,其中药物包含有效、无毒、单一剂量的干扰素。
30.根据权利要求28所述的应用,其中药物包含足以引发相当于单一剂量的宿主防御或免疫反应刺激作用的多个较小剂量的干扰素。
31.根据权利要求28至30中任何一项所述的应用,其中该药物在足以引发相当于单一剂量的宿主防御机制或免疫反应刺激作用的时间里提供能刺激宿主防御或免疫反应的无毒剂量的连续给药。
32.根据权利要求28至31中任何一项所述的应用,其中药物适用于治疗或预防肿瘤病理条件,所述剂量超过同种干扰素经胃肠道外给药时的非病理剂量。
33.根据权利要求28至31中任何一项所述的应用,其中药物适用于治疗或预防病毒感染,所述剂量超过同种干扰素经胃肠道外给药时的非病理剂量。
34.根据权利要求28至33中任何一项所述的应用,其中药物包含干扰素和干扰素诱导剂。
35.根据利用要求28至34中任何一项所述的应用,其中单位剂量形式的药物包含大约20×106IU到大约1000×106IU的干扰素。
36.根据权利要求28至35中任何一项所述的应用,其中药物包括另一种用于同时、单独或连续治疗的治疗剂。
37.根据权利要求28至36中任何一项所述的应用,其中治疗剂选自细胞生长抑制剂、抗肿瘤剂、抗血管生成剂,及抗病毒剂。
38.根据权利要求28至37中任何一项所述的应用,其中干扰素是Ⅰ型干扰素。
39.根据权利要求38所述的应用,其中Ⅰ型干扰素选自IFN-α、IFN-β、IFN-ω、共有IFN,和其混合物。
40.根据权利要求39所述的应用,其中Ⅰ型干扰素是IFN-α。
41.根据权利要求28至37中任何一项所述的应用,其中干扰素是Ⅱ型干扰素。
42.根据权利要求41所述的应用,其中Ⅱ型干扰素是γ-IFN。
43.根据权利要求38或41所述的应用,其中干扰素是重组物。
44.适合口粘膜接触刺激哺乳动物的宿主防御机制或免疫反应的干扰素组合物,该组合物包括刺激量的干扰素,所述剂量超过经胃肠道外给药时引发病理学反应的量。
45.根据权利要求44所述的组合物,该组合物包含有效、无毒、单一剂量的干扰素。
46.根据权利要求44所述的组合物,该组合物包含足以引发相当于单一剂量的宿主防御或免疫反应刺激作用的多份较小剂量的干扰素。
47.根据权利要求44至46中任何一项所述的组合物,该组合物在足以引发相当于单一剂量的宿主防御或免疫反应刺激作用的时间里提供刺激宿主防御或免疫反应的无毒剂量的连续给药。
48.根据权利要求44至47中任何一项所述的适合治疗肿瘤病理条件的组合物。
49.根据权利要求44至47中任何一项所述的适合治疗病毒感染的组合物。
50.根据权利要求44至49中任何一项所述的组合物,该组合物包含干扰素和干扰素诱导剂。
51.根据权利要求44至50中任何一项所述的组合物,该组合物以单位剂量形式包含大约20×106IU到大约1000×106IU的干扰素。
52.根据权利要求44至51中任何一项所述的组合物,该组合物包含另一种适合同时、单独或相继治疗的治疗剂。
53.根据权利要求44至52中任何一项所述的组合物,其中治疗剂选自细胞生长抑制剂、抗肿瘤剂、抗血管生成剂和抗病毒剂。
54.根据权利要求44至53中任何一项所述的组合物,其中干扰素是Ⅰ型干扰素。
55.根据权利要求54所述的组合物,其中Ⅰ型干扰素选自IFN-α、IFN-β、IFN-ω、共有IFN,和其混合物。
56.根据权利要求55所述的组合物,其中Ⅰ型干扰素是IFN-α。
57.根据权利要求44至53中任何一项所述的组合物,其中干扰素是Ⅱ型干扰素。
58.根据权利要求57所述的组合物,其中Ⅱ型干扰素是γ-IFN。
59.根据权利要求54或57所述的组合物,其中干扰素是重组物。
60.单位剂量形式的用于口粘膜给药的药物组合物,该组合物包含大约20×106IU到大约1000×106IU的干扰素和医药上可接受的载体。
61.根据权利要求60所述的组合物,该组合物包括大约20×106IU到大约500×106IU的干扰素。
62.根据权利要求61所述的组合物,该组合物包括大约20×106IU到大约500×106IU的干扰素。
全文摘要
适合经口粘膜接触以超过干扰素胃肠道外给药量的干扰素刺激量刺激哺乳动物宿主防御机制或免疫反应的干扰素组合物,采用这类组合物的治疗方法以及在制备这类口粘膜给药的组合物时干扰素的应用。
文档编号A61P43/00GK1218408SQ97194501
公开日1999年6月2日 申请日期1997年5月5日 优先权日1996年5月9日
发明者迈克尔·格拉德·托文 申请人:太平洋制药控股公司
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