专利名称：靶细胞的定向细胞溶解、引起细胞溶解的试剂和组合物以及可用于制备这些试剂的化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及由有功能的超级抗原活化的T细胞所引起的靶细胞失活/细胞溶解。细胞溶解可用于治疗和体外分析。定义超级抗原根据最先的定义(大约1988-1993年)，超级抗原是事先未经细胞内加工而能够与MHC II类抗原结合并且通过与T细胞受体(TCR)的Vβ链可变区(Vβ)结合活化T细胞的细菌或病毒蛋白。此结合导致T细胞的相对大部分/亚群的Vβ家族限定的活化和表达MHC II类的细胞的溶解(超级抗原依赖型的细胞介导的细胞溶解＝SDCC)。一般超级抗原活化的T细胞亚群构成个体T细胞总数的约1-30％。
符合上述定义的众所周知的野生型超级抗原有葡萄球菌肠毒素(SEA、SEB、SEC1、SEC2、SED、SEE和SEH)。进一步的实例有毒性休克综合症毒素1(TSST-1，也是葡萄球菌来源)、剥脱性毒素(ExfoliatingToxin)(Exft)、葡萄球菌致热性外毒素A、B和C(SPE A、B和C)、小鼠乳房肿瘤病毒蛋白(MMTV)、葡萄球菌M蛋白、产气荚膜梭菌(clostridialperfringens)外毒素(CPET)、支原体关节炎超级抗原等。对于超级抗原及其特性的综述，参见Kotzin等1993。
也已将野生型和嵌合超级抗原突变成具有降低的或无MHC II类结合和/或TCRVβ结合(Kappler等WO9314264；Kappler等1993；Blanco等；Abrahmsen等，WO9601650；Antonsson等WO9736932；Antonsson等1997)。此类超级抗原毒性变得更小。在它们完全缺乏与MHC II类或TCRVβ结合的能力时，它们不再是有功能的超级抗原，因为它们随后丧失了其活化T细胞的能力。
通过突变结构上类似的野生型超级抗原构建嵌合的有功能活性的超级抗原(杂合超级抗原)已是可能的(Lamphaer等，1996和Antonsson等WO9736932)。
已发现在野生型超级抗原与能结合细胞表面结构的寻靶部分连接的情况下，活化和随后的细胞溶解可以MHC II类非依赖型方式发生(Dohlsten等WO9201470)。这种新的作用机理已称为超级抗原抗体依赖型的细胞介导的细胞溶解(＝SADCC)。它包括针对靶向部分而不是抗体的类似机理(Abrahmsen等，WO9601650；Antonsson等WO9736932)。
因此，当今的超级抗原概念包括任何未经细胞内加工而能够与细胞表面结构(靶结构)和一种或多种多态性TCR链、特别是Vβ链结合，由此活化表达参与结合的特异性TCR链的T细胞亚群的化合物(优选地多肽结构)。然后这些T细胞变成细胞毒性的T细胞并且介导它们针对带有表面结构的细胞(靶结构，靶细胞)的细胞毒性。如果没有另外说明，本发明上下文中使用的超级抗原(SAG)定义将包括靶向部分与游离超级抗原之间的缀合物，如上面对于SADCC所述的。
对于涉及到的术语超级抗原，如果没有另外说明，仅指有功能的超级抗原。
游离超级抗原(Sag)是未与靶向部分或免疫调节剂结合的野生型、可能经突变或其它修饰的超级抗原。游离超级抗原的MHC II类结合能力是固有的靶向特性。因为游离超级抗原缺乏结合的靶向部分，所以它们将仅产生SDCC。
缀合超级抗原是游离超级抗原与靶向部分或免疫调节剂之间的缀合物。缀合超级抗原产生SDCC和SADCC中的任意一个或二者。
免疫调节剂(IM)是能够调节免疫系统的化合物。在本发明上下文中，单独对待超级抗原，并且当使用免疫调节剂时不包括超级抗原在内。免疫调节剂经常例如对于对应的淋巴细胞受体有固有的靶向能力。除非另有说明，否则免疫调节剂是非结合的形式。
靶向部分(T)是能与细胞表面结构和/或组织结构结合的部分。
缀合物是由彼此共价连接的两个或多个部分Sag、IM、T等组成。
活性成分的可溶形式是指溶于来自身体的液体如血清和血浆中的形式。背景领域-超级抗原的治疗用途已经提出非缀合的野生型和突变的超级抗原用于治疗，其治疗效应可能通过免疫系统在与待治疗疾病有关的表达II类的细胞局部活化或作为系统性活化来实现(Kalland等WO9104053；Terman等WO9110680和WO9324136；Antonsson等WO9736932和Newell等1991)。由于野生型超级抗原的极大毒性，此方法对于癌症治疗来说应该仅适用于所有癌症中很少的一部分。
也提出使用与寻靶部分结合的超级抗原(Dohlsten等WO9201470；Abrahmsen等，WO9601650；Antonsson等WO9736932和Ochi等1993)，所有这三篇公开文献引用作为参考)。
在关于通过IL-2在体内防止超级抗原诱导的T细胞介导的细胞毒性活性的下调的研究方面，已推测同时施用IL-2与非缀合的野生型超级抗原和与抗体结合的野生型超级抗原应该是有利的(Belfrage论文1996年8月/9月；Belfrage等1994；Belfrage等1995；Belfrage等1997a；Belfrage等1997b(野生型超级抗原))。
也已证明细胞膜锚定的CD80在无MHC II类抗原存在的情况下在T细胞的超级抗原活化中有作用(Lando等1993和1996)。
Lando等1996中的图4显示了分析只与抗体结合的超级抗原或与IL-2联合诱导静止人T细胞增殖的能力的实验。在此4天实验中，将结合的超级抗原呈递到亲本CHO细胞和经转染表达II类或C215或II类加C215的CHO细胞上。IL-2的影响不明显。
Kapper等(WO9314634)提出经突变丧失其Vβ或MHC II类结合能力的非缀合的野生型SEB(在疫苗中并且作为中和超级抗原的毒性效应的试剂)。Abrahmsen等(WO9601650)提出用具有修饰的、优选地降低的与II类抗原结合的能力的结合的超级抗原进行癌症治疗。Antonsson等(WO9736932)提出使用具有降低的血清反应性的嵌合超级抗原和超级抗原的治疗(也参见Abrahmsen等)。Abrahmsen等(WO9601650)和Antonsson等(WO9736932)所述的突变涉及在待治疗的哺乳动物中具有更低的系统毒性、降低的免疫原性和/或降低的血清反应性的超级抗原。
已经提出施用编码野生型超级抗原的核酸的治疗(Terman等WO9110680，WO9324136和Dow等WO9636366)。Dow等走得更远并提出编码细胞因子或趋化因子的核酸与编码超级抗原的核酸的共施用。虽未能有实验的支持，WO9636366也提出双顺反子基因构建体形式的构建体，其中一个顺反子含有编码超级抗原的基因并且另一个顺反子含有编码细胞因子或趋化因子的基因。
虽未能有实验的支持，但Pouletty P(Sangstat，EP510949)推测靶向部分如IL-2和野生型超级抗原之间的缀合物对于使表达IL-2受体的细胞失活可能是有用的。背景领域-免疫调节剂与对要使之失活的细胞特异的抗体联合时的治疗用途以前已经提出带有生物反应性调节物，例如趋化因子或细胞因子如白细胞介素2的缀合抗体(Fell等EP439095；Rosenblum等EP396387，Pancook等1996和Becker等1996)。本发明着手解决的问题本发明着手提供对于涉及免疫系统活化的、为了使待治疗哺乳动物中不需要的靶细胞失活的超级抗原治疗的改进。具体地，这些改进涉及1.在第一个治疗周期过程中，例如在肿瘤中，局部延长活化时间；2)阻碍由于活化的T细胞转变成无反应状态的趋势而出现的低反应性；3)促进肿瘤区域中MHC II类非依赖型的T细胞活化；和4)通过超级抗原活化拓宽细胞溶解的治疗窗口。现已发现如果超级抗原(SAG)的施用与可溶形式免疫调节剂的施用结合，超级抗原和免疫调节剂中至少一种是以带有具有针对要使之失活的细胞的靶向特性的部分的缀合物形式，那么这些改进可完全或部分实现。本发明的第一个主要方面使靶细胞失活的方法本发明的第一方面包括治疗和体外分析，并且是一种通过在不是超级抗原(Sag)的免疫调节剂(IM)存在的情况下使两种类型的细胞与超级抗原(SAG)、特别是通过与TCR Vβ结合活化T细胞的超级抗原接触从而在T细胞存在的情况下使不需要的靶细胞失活的方法。在其最广的方面，此方法的特征在于超级抗原与免疫调节剂中的至少一种是以带有具有针对要使之失活的细胞的靶向特性的部分(T)的缀合物形式。在子方面中，此方法特征在于a.超级抗原(SAG)和免疫调节剂以包含超级抗原(Sag)、针对靶细胞的靶向部分(T)和免疫调节剂(IM)的三体缀合物形式(T，IM，Sag-缀合物)使用；b.超级抗原(SAG)以超级抗原(Sag)和针对靶细胞的靶向部分(T)之间的二体缀合物结合免疫调节剂(IM)和针对靶细胞的靶向部分(T’)之间的二体缀合物的形式(T，Sag-缀合物+T’，IM-缀合物)使用；c.超级抗原(SAG)以超级抗原(Sag)和针对靶细胞的靶向部分(T)之间的二体缀合物形式使用并且免疫调节剂(IM)以游离形式，即未与针对靶细胞的靶向部分结合的形式(T，Sag-缀合物+IM)使用；d.超级抗原(SAG)以自由形式(Sag)使用并且免疫调节剂以缀合物形式，即免疫调节剂(IM)与超级抗原(Sag)之间的二体缀合物形式(Sag+T，IM-缀合物)使用；以及e.超级抗原(SAG)与免疫调节剂以超级抗原(Sag)与免疫调节剂(IM)之间的二体缀合物形式(Sag，IM-缀合物)使用；超级抗原和免疫调节剂可靶向相同类型的细胞，例如靶向相同或交叉反应性结构/表位或相同组织内不同类型的细胞。靶向可以针对与一种和相同组织有关的正常细胞或患病细胞。超级抗原和免疫调节剂中一种或二者可用同一种或多种抗体靶向。本发明方法要治疗的疾病。
要治疗的疾病原则上与以前提出的超级抗原治疗的那些疾病相同。参见例如上述标题“背景......”下的内容。例证性实例有癌症、自身免疫疾病、寄生虫感染、病毒感染和其它与在其表面表达对各个疾病特异的MHC II类抗原和/或其它结构的并且与插入符合本发明概念(化学式I)的超级抗原的寻靶部分结合的细胞有关的疾病。另外，通过使用本发明也可抵抗细菌感染。
本
发明内容
中重要的癌症形式有黑素瘤、癌、造血细胞瘤和纤维肉瘤并且包括具体的形式如鳞状细胞癌、乳腺癌、头颈部癌、甲状腺癌、软组织癌、骨肉瘤、睾丸癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、脑癌、血管肉瘤(angiosarcomas)、血管肉瘤(hemangiosarcomas)、肥大细胞瘤、早期肝癌、肺癌、宫颈癌、肾细胞癌、白血病和淋巴瘤。包括的是任何类型的恶性或良性肿瘤以及多药抗性肿瘤、转移的肿瘤、各种形式的化学或病毒(疱疹病毒、SV40、HIV等)诱导的癌症。本发明的第二主要方面本发明的超级抗原缀合物本发明的这方面包括符合化学式(I)(T)x(Sag)y(IM)z的缀合物。T是靶向部分，Sag对应于游离超级抗原并且IM是非超级抗原的免疫调节剂。T，Sag和IM通过在一种和相同缀合物分子或物质内不同或相同的有机接头B连接在一起。符合化学式I的缀合物包括化学缀合物以及重组合成的缀合物(融合蛋白)。x，y和z是一般选自0-10的整数如0-5，并且分别代表T、Sag和IM部分在给定缀合物分子中的数目，其中y＞0并且同时x和z中的一个或二者＞0。化学缀合物一般是含有不同缀合物分子混合物的缀合物物质。因此，在化学缀合物中x，y和z也可能是0-10范围如0-5范围内的非整数。
在化学式I的第一个子方面中，Sag和IM和T存在于缀合物中(x和y和z＞0；T，Sag，IM-缀合物)。x，y和z一般为整数1-3，优选1-2。x，y和z之间的典型关系是x＝y＝z；x＝y＝0.5z；x＝0.5y＝0.5z和x＝0.5y＝z。
在符合化学式I的缀合物的第二个子方面中，靶向部分缺乏(IM，Sag-缀合物，x＝0)。y和z一般是整数1-3。X和y之间优选的关系为x＝y；x＝0.5y；0.5x＝y；x＝1/3y和1/3x＝y。
在两个子方面中，整数或关系主要指这样的融合蛋白，其中靶向部分可能是含有1、2、3或4条多肽链的蛋白并且其中每个缀合分子中有一个T。
根据第二个子方面，缀合物的化学式I缩减为(Sag)y(IM)z化学式II这种缀合物主要适于治疗与表达MHC II类抗原的细胞有关的疾病、特别是表达II类的癌症如造血系统癌症以及一些自身免疫疾病、病毒感染和寄生虫感染，并且适于治疗与免疫调节剂的细胞膜锚定受体有关的疾病，表达例如IL-2受体的T细胞淋巴瘤。A.化学式I中的免疫调节剂IMIM代表不是游离的或结合的超级抗原的免疫调节剂。
免疫调节剂可以是细胞因子或趋化因子。举例说明的细胞因子有粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子α或β(TNFα或TNFβ)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18和IGF。举例说明的趋化因子有C5a、IL-8、单核细胞趋化蛋白1α(MIP1α)或单核细胞趋化蛋白1β(MIP1β)、单核细胞化学吸引剂蛋白1(MIP-1)、单核细胞化学吸引剂蛋白2(MIP-2)、单核细胞化学吸引剂蛋白3(MIP-3)、血小板活化因子(PAFR)、N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基-苯丙氨酸(FMLPR)、白三烯B4(LTB4R)、胃泌素释放肽(GRP)、RANTES、eotaxin、淋巴细胞趋化因子、IP10、I-309、ENA78、GCP-2、NAP-2、MGSA/gro、DC-CK1、Flt3L(异位结构域)、fractalkin、PF-4等。
另一种类型的免疫调节剂是那些源自参与调节激发的免疫反应如共刺激的细胞膜锚定受体/配体对的免疫调节剂(例如淋巴细胞表面结合的受体和相应的细胞结合的配体)。举例说明的实例有选自配对CD40L/CD40、4-BB1/4-BB1L、CD28/B7、CTLA-4/B7等的成员。B7包括变异体如CD80和CD86，其中前者是优选的。优选的形式是可溶的，含有胞外部分(异位结构域)并且没有细胞内和膜锚定的部分。
特别优选的免疫调节剂能够例如通过阻碍超级抗原活化的T-细胞转变成无反应状态在体内增强超级抗原的效应。典型的适当的细胞结合的受体/配体是CD28/B7，包括上述类似物和片段。此组典型的细胞因子有作为CD28/B7信号途径下游主要效应物的IL-2以及IL-2样细胞因子IL-7和IL-15。在T细胞表面结合的受体/配体对中，优选将不与待活化T细胞结合的成员插入根据本发明所述的缀合物中。对于CD40L/CD40、4-BB1/4-BB1L和CD28/B7，这意味着有上述优选的可溶形式的CD40、4-BB1L和B7。本文的实验部分说明在本发明中于优先权日发现为最佳的免疫调节剂变体。
免疫调节剂优选地应该是与要治疗的个体相同的品种来源。天然免疫调节剂如细胞因子和趋化因子通常在哺乳动物中表现高系统毒性和相对短的半衰期。有很多文献是关于如何将免疫调节剂修饰成相对于氧化有增强的稳定性、更长的体内半衰期、更低的毒性和通过重组技术制备时改进的折叠等。例如美国专利US5,229,109(Gram等)描述了由于缺乏与受体的p55α亚单位的结合而对高亲和性IL-2受体(IL-2R)具有下降亲和性的IL-2的低毒性类似物。这些类似物主要通过突变IL-2中33-46位氨基酸(例如Arg38Ala和Phe42Lys或Phe42Ala)的密码子加以制备。Asp20Lys突变体具有对IL-2受体的p75/β链100-500倍降低的亲和性而不影响对p55的结合(Collins等1988)。其它突变如Asp20Ser程度较轻(Berndt等1994)。对鼠IL-2的研究表明人IL-2的Asp84和Asn88也参与p75结合(Zurawski等1993)。这通过模拟人IL-2与其受体间的结合而得到支持(Bamborough等1994)。这些突变亲和性预期的下降是Asp20＞Asn88＞Asp84。
结合Arg38与Phe42中的突变与位置88和20中突变将导致对IL-2R更低的亲和性。另一种有效的并且在优先权日优选的IL-突变是得到具有更低的细胞内化率和更长的免疫调节效应持续时间的IL-2类似物的Thr51Pro(Chang等1996)。
氨基酸位置的编号根据Taniguchi等1983。
Grimm等；Collins等1988；Berndt等1994；Zurawski等1993；Bamborough等1994；Chang等1996和Taniguchi等1983在此引用作为参考。
上述对其正常受体有降低的亲和性的细胞因子和趋化因子类似物在缀合物中的应用将增强它们靶向预定的靶细胞。可以想象与带有天然形式的免疫调节剂的相应缀合物相比，经突变在结合其各自细胞受体时表现降低的细胞内化率并且插入符合化学式I的缀合物的细胞因子和趋化因子将导致更长的超级抗原活性。
因此术语免疫调节剂(IM)包括能兴奋或拮抗免疫调节剂的相应天然形式效应的任何修饰形式，例如任何突变形式。B.化学式I中的超级抗原部分SAG化学式I中的Sag代表在上述标题“背景...”下对游离超级抗原定义的超级抗原，即野生型超级抗原可能例如通过突变而修饰成a.与相应的野生型超级抗原相比，具有降低的与MHC II类抗原结合的能力(参见例如Abrahmsen等(WO9601650))；b.与相应的野生型超级抗原相比，在人血清中具有降低的血清反应性(参见例如Abrahmsen等(WO9601650)和Antonsson等WO9736932和Antonsson等1997)；c.与相应的野生型超级抗原相比，在人类中具有降低的免疫原性(参见例如Antonsson等WO9736932和Antonsson等1997)；d.是两种或多种类似野生型超级抗原之间的嵌合体，其中第一种野生型超级抗原中的一个区域已用第二种类似超级抗原中的相应区域替换。所述区域可以是决定与TCRVβ结合的区域，例如对SEE/SEA和SEA/SEE嵌合体所述的(参见例如Antonsson等WO9736932；Antonsson等1997和Lamphaer等1996)。
发现适当的其它修饰/突变也包括在内从而例如在真核细胞中合成时避免不想要的糖基化。
以前SEA/SEE样超级抗原的典型突变有(编号如Antonsson等1997和Antonsson等WO9736932所用的)a.降低的MHC II类结合Asp227Ala(＝SEAm9)，Phe47Ala和/或Asp70Arg。突变体Phe47Ala/Asp227Ala＝SEAm23。
b.和d.SEA和SEE间的嵌合体，旨在降低人体中的血清反应性，同时维持相应结合的超级抗原的SADCC能力SEE具有以下的替换Gly20Arg，Thr21Asn，Gly24Ser，Lys27Arg。
用于实验部分的突变体是SEA(Asp227Ala)＝SEAm9，SEA(Phe47Ala/Asp227Ala)＝SEAm23和SEA(Phe47Ala/Asn102Q/Asn149Asp/Thr218Val/Asp227Ala)＝SEAm57。以前提出的优选的超级抗原选自1.表现2个MHC II类结合位点的超级抗原(Sag)(例如葡萄球菌肠毒素A和E)，2.与MHC II类的最佳结合需要Zn离子的以其未突变形式的超级抗原(Sag)(例如SEA、SEE和SEH)，3.葡萄球菌肠毒素。
待插入根据本发明所述的缀合物中的Sag分子不必须是有功能的超级抗原，主要问题是最终的缀合物产生上述的SADCC和SDCC中的一个或二者。C.化学式I中的靶向部分T。
T原则上可以是任何能与细胞表面结构、优选地疾病特异性结构结合的结构。T靶向的结构通常不同于(a)Sag结合的多态性TCR链表位和(b)Sag结合的MHC II类表位。寻靶部分可选自白细胞介素(例如白细胞介素2)、激素、抗体包括抗体的抗原结合片段、生长因子等。参见例如Woodworth 1993(在此引用作为参考)。
因此靶向部分可以是含有1、2、3或4条多肽链的蛋白。
在优先权日，优选T细胞是抗体(全长抗体、Fab、F(ab)2、Fv、ScFv(单链抗体)、多个单链抗体(ScFv)n和任何其它结合抗原的抗体片段)，包括上述抗体的任何有功能活性的截短形式。其它变体是单特异性和双特异性的。抗体原则上可以针对任何疾病相关/特异的细胞表面结构，例如与上述任何给定肿瘤形式连接的结构，其中特别强调抗体活性片段(如Fab)。通常抗体可针对结肠和/或胰腺特异性表位如所谓的C242表位(Lindholm等WO9301303)、肺癌特异性表位如5T4抗体的表位(Stern等WO8907947)、淋巴瘤特异性表位如CD19上黑素瘤特异性表位，例如HMW-MAA等。
术语“抗体”包括单克隆以及多克隆变体，其中优选单克隆制剂。
在靶向部分是Fab片段时，通常将使重轻链Fab链连接在一起的半胱氨酸残基优选地用不允许二硫桥形成的氨基酸如丝氨酸替换。也参见Antonsson等WO9736932。
上面所述的也包括T可能针对或多或少的调节或控制疾病发生的健康细胞上的独特结构。D.接头B接头B可按前述(Dohlsten等WO9201470；Abrahmsen等WO9601650和Antonsson等WO9736932)选择；即B优选地应是亲水性的并且表现选自酰胺、硫醚、二硫化物等的一种或多种结构。最重要的接头是通过重组技术得到的那些接头，即结合发生在基因组水平从而得到寡肽接头。通常，接头含有1-30个如1-20个氨基酸残基，优选地选择这些氨基酸残基使得接头总体上为亲水性。因此接头残基优选地选自亲水性氨基酸残基如Gln、Ser、Gly、Glu、Pro、His和Arg。典型的寡肽接头包括三肽GlyGlyPro或所谓的在氨基末端可能用gly-pro修饰的Q接头(Wootton等1989，在此引用作为参考)。E.T、SAG和IM的结合点化学缀合物通常将含有连接位点不同的缀合物分子的混合物。缀合物物质将含有异型以及同型缀合物。
对于重组缀合物(融合蛋白)，得到的缀合物物质在连接位点上将是相同的。对于每个单独的亚单位(T，Sag，IM)，氨基末端优选地通过插入的寡肽桥与另一亚单位的羧基末端融合或者反之亦然。在缀合物含有T，Sag，IM每种各一个时，组合将是T-IM-Sag，IM-T-Sag，Sag-IM-T，Sag-T-IM，T-Sag-IM，IM-Sag-T(B接头结构的存在未显示)。在一个或多个亚单位含有两条或多条多肽链时，可能性的数目增加。对于T为抗体Fab片段时，可能性将是(寡肽接头B未显示)1.Sag-Fab(轻链)-IM 2.Fab(轻链)Fab(重链) Sag-Fab(重链)-IM3.Sag-Fab(轻链) 4.Fab(轻链)-IMFab(重链)-IM Sag-Fab(重链)5.Sag-Fab(轻链) 6.IM-Fab(轻链)IM-Fab(重链) Sag-Fab(重链)7.Fab(轻链)-Sag 8.Fab(轻链)-IM
Fab(重链)-IMFab(重链)-Sag在进一步的变异体中，免疫调节剂和超级抗原可依次在抗体任何链的任何末端融合。
在优先权日，重组缀合物是优选的，其中最优选的是Fab片段作为靶向部分以及使游离超级抗原的氨基末端与抗体重链(CHl)或轻链的第一个恒定区连接并使免疫调节剂与剩下的羧基末端连接(对化学式I-IV有效)。
为了最佳的制备与功能，将融合蛋白重组表达为两条链的产物，其中超级抗原通过可弯曲的3-11个残基的亲水性氨基酸接头在C-末端与抗体Fab片段的CHl-结构域融合。此接头可以具有序列Gly-Gly-Pro或Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro(SEQ IN NO19)或基于SEQ IN NO19的4-9个残基，其中SEQ IN NO19是优选的。免疫调节剂部分通过10-20个残基的亲水性并且中性或带正电的接头(接头Q)在C-末端与轻链融合。优选，接头Q可具有以下序列Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(SEQ ID NO23)、Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(SEQ ID NO20)、Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg(SEQ ID NO21)和Gly-Pro-Thr-Glu-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr(SEQ ID NO22)，其中SEQ IN NO20和21是最优选的(更多细节参见实施例2)。
据信此时氨基末端的类似组合或在VH和VL结构域氨基和羧基末端的结合的组合导致有活性但是效率更低的缀合物。F.不符合化学式I但根据本发明方法中上述组合a-e使用的活性整体。
游离超级抗原(Sag)参见标题“定义”。典型的Sag列于标题“背景”和“B.化学式I中超级抗原部分Sag”。
非结合的免疫调节剂参见标题“定义”。原则上可使用与在标题“A。化学式I中的免疫调节剂IM”下给出的相同的免疫调节剂。细胞因子和趋化因子是优选的，其中强调IL-2和IL-2样细胞因子。
定向免疫调节剂(T，IM-缀合物)这些缀合物符合基本化学式(T’)x(IM’)z化学式III其中T’和IM’通过有机接头B’连接在一起。T’、IM’和B’选自与T、IM和B相同组的化合物/结构。x和z以与化学式I相同的方式定义(y＝0)，其中每个T’和缀合物分子优选一个或两个IM’。T’和IM’之间的结合点如化学式I中所定义。也参见标题“E.结合点......”，其中化学式1-8及对其的注解除了省略Sag外也适用于T，IM缀合物。化学式III的缀合物可根据已知技术即常规化学连接或重组技术(融合蛋白)制备，其中后者是优选的(Fell等EP439095；Rosenblun等EP396387)。特别重要的T，IM-缀合物包括已经修饰如突变而具有上述降低的亲和性和/或降低的内化率的IM’-部分。
定向超级抗原(T，Sag-缀合物)这些缀合物符合基本化学式(T’)x(Sag’)y化学式IV其中T’和SAG’通过有机接头B’连接在一起。T’、Sag’和B’选自与T、IM和B相同组的化合物/结构。x和y以与化学式I相同的方式定义(z＝0)，其中每个T’和缀合物分子优选一个或两个Sag’。T’和Sag’之间的结合点如化学式I中所定义。也参见标题“E.结合点......”，其中化学式1-8及对其的注解除了从化学式省略IM外也适用于T，Sag缀合物。化学式IV的缀合物可根据已知技术即常规化学连接或重组技术(融合蛋白)制备，其中前者是优选的。参见例如Dohlsten等WO9201470；Abrahmsen等WO9601650；和Antonsson等WO9736932。本发明的第三主要方面含有修饰的免疫调节剂的缀合物。
这些新的缀合物符合化学式(T)x(Sag)y(IM)z化学式V其中T和Sag选自与化学式I的T和Sag相同的化合物。IM是经修饰如通过突变而对其细胞膜锚定的受体表现降低的亲和性和/或降低的通过结合其受体的内化率的免疫调节剂(与相应的天然形式相比)。IM优选地是细胞因子或趋化因子。进一步参见标题“A.化学式I中的免疫调节剂IM”。本发明这方面的一个重要免疫调节剂是修饰的IL-2。x，y和z以与化学式I相同的方式定义。
在符合化学式V的缀合物的第一个子方面中，T、Sag和IM总是存在(所有x和y和z＞0)，即T，Sag，IM-缀合物。x，y和z一般是整数1-3，其中优选1-2。x，y和z之间的典型关系为x＝y＝z；x＝y＝0.5z；x＝0.5y＝0.5z和x＝0.5y＝z。
在符合化学式V的缀合物的第二个子方面中，超级抗原部分缺乏(y＝0)，即T，IM-缀合物。x和z一般是整数1-3。x和z之间的优选关系为x＝z；x＝0.5z；0.5x＝z；x＝1/3z和1/3x＝z。
在符合化学式V的缀合物的两个子方面中，给定的整数范围或它们的相互关系主要指这样的融合蛋白，其中靶向部分可能是含有1、2、3、4条多肽链的蛋白并且其中每个缀合分子中有一个T。化学式V的融合蛋白的结合点与符合化学式I的相应融合蛋白相同。也参见标题“E.结合点......”，其中化学式1-8及对其的注解除了对于第二个子方面省略Sag外也适用于T，IM缀合物。上述缀合物的制备。
缀合物的制备原则上可根据两个主要途径进行1.将各个亚单位T、Sag和IM化学连接在一起。每个单独亚单位或其组合可通过重组技术加以制备。
2.如上述任何化学式中定义的直接提供缀合物的重组技术。
实际方法对于普通技术人员是众所周知的并且包括大量变化。
化学连接一般利用通常天然存在于超级抗原、蛋白性免疫调节剂和蛋白性靶向部分的多个位置中的官能团(例如伯氨基、羧基、巯基、碳水化合物基团)。这些技术在本领域中是众所周知的。
本发明超级抗原与免疫调节剂之间的缀合物(融合形式以及非缀合形式)的大规模重组制备的主要宿主细胞是大肠杆菌。此宿主原则上提供两条途径细胞内合成和分泌。后一种变化形式是优选的，因为它提供来自周质和培养基的正确折叠蛋白的纯化。上述并不排除有可能在其它宿主，例如真核细胞如酵母或哺乳动物细胞中制备有活性的缀合物。到目前为止的初步结果已经表明真核细胞如哺乳动物细胞对于插入与CD28相互作用的免疫调节剂如B7及其类似物可能是优选的。本发明的第四方面编码新发明缀合物的基因构建体。
本发明的第四方面是编码上述超级抗原和免疫调节剂、优选地编码上述IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、RANTES、CD80异位结构域、CD86异位结构域、4-BB1L和Flt3L及它们的类似物的重组核酸分子、优选地DNA如cDNA或RNA。在本发明的这一方面，核酸一般应该含有与免疫调节剂和超级抗原要在其中表达的宿主细胞相容的用于免疫调节剂和超级抗原等中的一个或二者的调控序列如翻译调控序列、复制起点、分泌信号序列。编码超级抗原与免疫调节剂的序列部分间的区域可包含编码核糖体进入位点的序列如双顺反子基因构建体。后者将允许包括在缀合物中的每条多肽链的分别表达。在含有IM，Sag，靶向缀合物和适当信号序列的多链缀合物中，双顺反子构建体将促进折叠并且装配成有完全活性的缀合物，其中IM与其中的一条链结合。在其中靶向部分是两条链的抗体分子并且超级抗原(Sag)和免疫调节剂中的至少一个与抗体链的末端融合的情况下，这将是重要的。参见上述。药物组合物、剂量和施用途径。
本发明的第五方面是含有本发明超级抗原(Sag)、靶向部分(T)和免疫调节剂(IM)组合的药物组合物。本发明的此方面的典型特征是超级抗原和免疫调节剂中的至少一个以上述允许靶向待失活细胞的缀合物形式。
所讨论的组合物在本领域中已知，除了现在它们含有本发明的缀合物组合。在具体的组合物中，组合可包括a.包括超级抗原(Sag)、针对靶细胞的靶向部分(T)和免疫调节剂(IM)的三体缀合物(T，IM，Sag-缀合物)；b.两种二体缀合物一种在靶向抗体(T)与超级抗原之间而一种在靶向抗体(T’)与免疫调节剂之间(即T，Sag-缀合物+T’，IM-缀合物)。根据表位的特异性，T和T’可以是不同或相同的；c.一种超级抗原(Sag)和靶向部分(T)之间的二体缀合物以及游离形式的免疫调节剂(IM)(T，Sag-缀合物+IM)；
d.一种免疫调节剂(IM)和靶向部分(T)之间的二体缀合物以及游离形式的超级抗原(Sag)(T，IM-缀合物+Sag)；或者e.以二体缀合物形式的超级抗原(Sag)和免疫调节剂(IM)(Sag，IM缀合物)；进一步参见上述本发明方法的内容。在组合物含有两种活性组分时(上述b-d)，组合物可允许在给药前分开保存这些成分。
这些组合物可以是冻干颗粒状物质、无菌或无菌制备的溶液、片剂、安瓿等形式。可以存在赋形剂如水(优选地通过例如PBS缓冲至生理上可接受的pH值)或其它惰性固体或液体物质。一般而言通过将缀合物(可能结合非结合的活性组分)混合于、溶解于、结合到或以别的方式合并到一种或多种水溶性或水不溶性的水性或非水性赋形剂中(如果必要与适当添加剂和佐剂混合)来制备这些组合物。这些赋形剂和条件必须不能对上述a-e中定义的活性组分的活性有不利影响，这是必不可少的。
通常用于本发明的超级抗原(SAG)将以预先分装的剂量出售和给药，根据现在所有的结果，每剂量含有据信在1pg-50mg范围内的有效量的SAG。确切的剂量将在不同病例间不同，取决于患者的体重和年龄以及对所用SAG特异的抗体的预滴定、给药途径、疾病类型、寻靶部分、超级抗原、连接(-B-)、免疫调节剂等。
决定用于本发明方法的组合的剂量的重要因素是超级抗原和免疫调节剂发挥作用的最佳剂量范围。太低的剂量将导致无效应或低于最佳效应而太高的剂量将产生不能接受的副作用如可能致死的毒性。因此不得不强调上面给出的宽范围试图包括对本发明方法所有变化可能的范围。因此，根据本发明方法所述的每个具体组合具有0.1pg-50mg范围内的剂量子范围。这不排除将来的开发和结果可能导致此范围外的剂量水平。
给药途径将是本领域中常用的那些，即使杀死目标有效量或有治疗活性量的根据本发明所述的超级抗原-免疫调节剂组合与靶细胞接触。对于上述适用症，这最可能意味着肠道外施用如(皮下、静脉内、动脉内、肌内、腹膜内)注射或灌注给哺乳动物如人类。本发明的缀合物组合可局部或系统给药。
术语“杀死目标有效量”是指活化和介导T细胞破坏靶细胞时有效的量。
在优先权日，优选的给药途径与对于根据Dohlsten等WO9201470；Abrahmsen等WO9601650和Antonsson等PCT/97/00537所述的超级抗原缀合物所用的相同。这意味着每天1-5小时(优选地4小时)结合退热剂(扑热息痛)的静脉内灌注。给药在一些天如5-8天内重复，同时认真考虑增强针对缀合物的抗体的风险。最好进行多个治疗周期，每个周期含有一天或多天时间的治疗接着一天或多天时间的停止期，例如分别为5天和2天时间的治疗和休息。
本发明的组合物可作为主要疗法或在优选模式中作为辅助疗法与手术或其它药物结合。实验部分图解
图1.用CD80-C215Fab，CD80-C215Fab-SEAm57或C215Fab-SEA染色后与PE标记的抗小鼠κ链mAb一起培养的CHO-CD28细胞的FACS分析。染色在4℃进行而不进行任何洗涤。纵轴平均通道。
图2.用CD80-C215Fab，CD80-C215Fab-SEAm57或C215Fab-SEA染色后与PE标记的抗小鼠κ链mAb一起培养的Colo205细胞的FACS分析。染色在4℃进行并在每个染色步骤之间进行三次洗涤。纵轴平均通道。横轴效应器(E)对靶细胞(T)的比例。
图3.增殖将T细胞与Colo205细胞和4uM C242Fab-SEA以及不同量CD80-C215Fab一起培养4天后计数掺入的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷。无任何CD80-C215Fab时得到的活性是20039cpm+/-1750。
图4.IL-2的制备将T细胞与Colo205细胞和4uM C242Fab-SEA以及不同量CD80-C215Fab一起培养4天后收集上清液并测定IL-2量。无任何CD80-C215Fab时得到的IL-2量是2849pg/ml。
图5.将T细胞与Colo205细胞和不同量CD80-C215Fab-SEAm57或C215Fab-SEAm23一起培养4天后计数掺入的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷。
图6.IL-2的制备将T细胞与Colo205细胞和不同量CD80-C215Fab-SEAm57或C215Fab-SEAm23一起培养4天后收集上清液并测定IL-2量。
图7.与所示蛋白和照射的(irradiated)、转染的CHO细胞(用于呈递SEA)一起培养7天时人血T细胞的增殖能力。纵轴3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入(cpm)。
图8.同时施用靶向的SEA和IL-2导致体内T细胞增强的活化。针对来自用C215FabSEA(FS)、C215Fab-Q-hIL2(FI)、两个(FS+FI)的组合或C215FabSEA-Q-hIL2(FSI)的1次或3次注射处理的小鼠的脾细胞的SEA-包被的MHC II+类Raji细胞的细胞毒性(表示为百分率)。效应器靶细胞比例为30∶1，并且细胞毒性用标准的4小时51Cr释放分析加以测定。
图9.用C215FabSEA(FS)、C215Fab-Q-hIL2(FI)、C215FabSEA+C215Fab-Q-hIL2(FS+FI)或C215Fab-Q-hIL2(FSI)的三次注射(肿瘤接种后5、6和7天)对C57B1/6小鼠中第5天B16-C215肿瘤的治疗。使用等摩尔量的FabSEA和Fab-Q-hIL2。横轴注射蛋白的量。纵轴以百分率表示的肿瘤减少。
图10.C215Fab-SEA(FS)、C215Fab-Q-IL2(FI)或C215Fab-Q-IL2治疗后CD25+T细胞增加的肿瘤浸润。浸润到带有确定的B16-GA733肺癌的小鼠肺中的CD25阳性细胞通过免疫组织化学法评估。纵轴染色面积的百分比。横轴1＝PBS；2＝第一次注射；3＝第二次注射；4＝第三次注射；5＝第四次注射。
图11.每日一次(37mg/注射)四次注射C215FabSEA-Q-hIL2(FSI)(37mg/天)后干扰素γ的持续水平。最后一次注射后4小时收集血液并用重组鼠干扰素γ(Pharmingen)作为标准通过ELISA测试测定干扰素γ的含量(纵轴中)。相似实验用等摩尔量(30mg/注射)的C215FabSEA(FS)进行。
图12.针对来自用PBS或C215FabSEAD227A-Q-hIL2(＝FSm9-Il2)的1、4或6次注射处理的小鼠的脾细胞的SEA-包被的MHC II+类Raji细胞的细胞毒性(纵轴中表示为百分率)。细胞毒性用标准的4小时51Cr释放分析加以测定。PBS用作阴性对照。
图13.用C215FabSEAD227A(＝FSm9)或C215FabSEAD227A-Q-hIL2(＝FSm9-Il2)的8次注射处理后C57B1/6小鼠中第3天B16-C215肿瘤的治疗。连续8天每天进行治疗。在21天杀死动物，并且计数肺部的转移。纵轴以百分率表示的肿瘤减少。
图14.用C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A(＝FSm9-IL2(F42A))，C215FabSEAD227A-Q-hIL2(＝FSm9-Il2)或C215FabSEAD227A(＝FSm9-IL2)的8次注射处理后Vb3 TCR转基因小鼠中第3天B16-C215肿瘤的治疗。连续8天每天进行治疗。在21天杀死动物，并且计数肺部的转移。纵轴以百分率表示的肿瘤减少。
图15.用C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A(F42A)，C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42KF42K(＝FSm9-Il2)或C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A/D20S(＝F42A/D20S)的8次注射处理后Vb3 TCR转基因小鼠中第3天B16-C215肿瘤的治疗。连续8天每天进行治疗。在21天杀死动物，并且计数肺部的转移。纵轴以百分率表示的肿瘤减少。实施例1 CD80-C215FAB融合蛋白用于用SAG靶向的FAB进行肿瘤治疗的共刺激的生物学活性。
概述已经构建CD80-C215Fab和CD80-C215Fab-SEAm57融合蛋白从而含有人CD80的胞外结构域。融合蛋白在哺乳动物细胞中合成，并且用CHO细胞转染子测定对CD28的结合且用Colo205细胞测试对C215抗原的结合。两种融合蛋白结合CD28和C215抗原，后一结合与C215Fab-SEA相比下降100倍。既然CD80与L-链的N-末端部分连接，那么CD80部分干扰C215Fab结合是可能的。两种融合蛋白共刺激SAG活化的人T细胞，表明可溶性CD80保持了其生物学功能。材料和方法重组DNA技术和酶质粒DNA制备与其它操作基本上按照Sambrook等(Sambrook等1989)进行。大肠杆菌HB101(Boyer等1969)用作宿主菌株。限制性内切核酸酶和DNA聚合酶I的Klenow片段获自BoehringerMannheim或New England Biolabs，并且按照供应商说明使用。Taq聚合物获自Perkin Elmer。用GeneAmp RNA PCR试剂盒(Perkin Elmer)从总RNA中制备cDNA。寡核苷酸在Gene Assembler(Pharmacia Biotech AB)或ABI 392 DNA/RNA合成仪(Applied Biosystems)上合成，并且通过反相层析在FPLC系统(Pharmacia Biotech)上加以纯化。测序根据双脱氧链终止原理(Sanger等1977)用Applied BiosystemsTaq染料双脱氧终止循环测序试剂盒进行并且将产物在DNA测序仪ABI 392(AppliedBiosystems)上分离和测定。在每升含有2 X YT和15g琼脂基质并补加70mg/L卡那霉素或100mg/L氨苄青霉素的平板上选择带有不同质粒的细菌。液体培养基为2X YT(每升10g酵母提取物(Difco)，16g胰蛋白胨(Difco)和5g NaCl)。
表ILAKQ5 ATA TAA GCT TCC ACC ATG GGC CAC ACA CGG AGG(SEQ ID NO 1)LAKQ7 ACG CAG ATC TTT AGT TAT CAG GAA AAT GCT CTTGC(SEQ ID NO 2)LAKQ30TCA AAG CTT CTC GAG CGC GCT GTT ATC AGG AAAATG CTC(SEQ ID NO 3)LAKQ37CGC GCG TCA GGC TAA CGA ACT GCC AGG CGC CCCGTC ACA GAG ACG A(SEQ ID NO 4)LAKQ38AGC TTC GTC TCA CGC GCG TTC TTC CTG TGA CGGGGC GCC TGG CAG TTC GTT AGC CTG ACG(SEQ ID NO 5)LAKQ88TGG TAC ACC ACA GAA GAC AGC TTG TAT GTA TG(SEQ ID NO 6)LAKQ89CAT ACA TAC AAG CTG TCT TCT GTG GTG TAC CA(SEQ ID NO 7)LAKQ90CGA ATA AGA AAG ACG TCA CTG TTC AGG AGT TGG(SEQ ID NO 8)LAKQ91CCA ACT CCT GAA CAG TGA CGT CTT TCT TAT TCG(SEO ID NO 9)LAKQ92GAG ATA ATA AAG TTA TTA ACT CAG AAA ACA TG(SEQ ID NO 10)LAKQ93CAT GTT TTC TGA GTT AAT AAC TTT ATT ATC TC(SEQ ID NO 11)LAKQ108 CGC GGA TCC GCG CGG CAC CAG GCC GCT GTT ATCCGG AAA ATG CTC TTG C(SEQ ID NO 12)LAKQ117 CCG GAT AAC AGC GCG CGT CAG CTA ACG AAC TCCAGG CGC CCC GTC ACA GGA AGAA CGC CCG CAG GTCCAA CTG CA(SEQ ID NO 13)LAKQ118 GTT GGA CCT GCG GGC GTT CTT CCT GTG ACG GGGCGC CTG GCA GTT CGT TAG CCT GAC GCG CGC TGT TAT(SEQ ID NO 14)质粒构建按照以前所述(Dohlsten等1994)构建编码含有鼠抗体C215可变区的Fab片段的基因。以前已描述葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因的克隆和诱变得到替换F47A和D227A(Abrahmsen等1995)。用引物LAKQ88-93(使用的所有引物列于表I中)将其它3个突变导入SEA基因中以获得SEA突变体57。将LAKQ5和LAKQ7用于RT-PCR以在上游导入kozak盒，并且从人脾总RNA克隆编码信号肽和人CD80胞外部分的基因。发现核苷酸序列对应于CD80的基因库序列(录入号M27533)。制备在3’末端具有不同克隆位点的两个CD80基因变体在分开的PCR中，使用引物LAKQ30和LAKQ108以分别得到BssHII或MroI位点。通过在相关CD80基因与紧接κ基因前面的DsaI位点之间插入DNA接头LAKQ37/38 BssHII-Esp3I来构建编码通过Q-接头在κ链前融合的CD80的基因融合。通过将编码前面为CD80信号肽的CD80-(Q-接头)-κ的基因融合插入除了CMV启动子和polyA尾外还含有用于转化子选择的新霉素基因的载体中，获得质粒pKGE987。将CD80基因的最后版本用于构建基因融合，其中此基因位于Fd-SEA突变体57基因融合前面将编码Q-接头的DNA片段(LAKQ117/118)插入CD80基因中的MroI位点与C215VH基因中密码子4和5处的PstI位点之间。将此基因融合插入第二个CMV启动子载体中以得到质粒pMB189，从而编码通过三个残基间隔GGP连接在Fd和SEA突变体57后的CD80信号肽和胞外部分。在质粒pKGE961中，Fd基因插入在信号序列(源自另一鼠VH基因)之后。质粒pMB156编码前面为其天然信号肽的天然κ链，并含有新霉素基因。合成用pKGE961和pKGE987或pMb156和pMB189转染仓鼠胚肾293细胞以得到分别产生CD28-C215Fab和CD28-C215Fab-SEAm57的细胞系。为了获得稳定细胞系，选择培养基为补加L-谷氨酰胺(GIBCO BRL no 25030-24)、10％小牛血清和1mg/ml遗传霉素的无苯酚红的DMEM(Pharmacia noMS 0127)。生产培养基是补加L-谷氨酰胺和0.1％HAS(Pharmacia & UpjohnAB，瑞典)的无苯酚红的DMEM。通过在蛋白G Sepharose FF(PharmaciaBiotech AB)上亲和层析，然后通过抗-CD80亲和纯化(固定化的抗人CD80抗体；Camfolio L307.4)或在SP Sepharose FF(Pharmacia Biotech AB)上离子交换层析从过滤(Sartobran 0.65-0.4um)的培养基纯化融合蛋白。
试剂将补加2mM L-谷氨酰胺(GIBCO，Middlesex，英国)、0.01MHEPES(Biological Industries，以色列)、1mM NaHCO3(Biochrom KG，柏林，德国)、0.1mg/ml硫酸庆大霉素(Biological Industries，KibbutzBeit Haemek，以色列)、1mM丙酮酸钠(JRH Biosciences Industries，美国)和10％加热灭活胎牛血清(GIBCO，Middlesex，英国)的RPMII 1640培养基(GIBCO，Middlesex，英国)用作所有细胞培养的完全培养基。
抗体针对人CD57(HNK1)和CD56(HB55)的mAb获自产生mAb的杂交瘤细胞(美国典型培养物保藏中心，Rockville，ND)。用PE标记的抗小鼠κ链的mAb获自Becton Dickinson(San Jose，CA)。
细胞用Pharmacia和Upjohn，Stockholm，瑞典的编码CD28基因的人cDNA转染中国仓鼠卵巢(CHO)K1细胞。常规分析转染子的CD28表达并通过FACS分选在相似抗原表达水平维持转染子。人直肠癌细胞系Colo205获自ATCC。所有细胞系不含支原体。
T淋巴细胞增殖分析按照以前所述(Lando等1996)通过使用CD57、HLA-DR4、CD14和CD56 mAb的负选择淘选从外周血单核细胞(PMB)得到T细胞。所有对T细胞的测试用平底96孔板(Nunc，Roskilde，丹麦)以200μl体积用0.1×106个细胞/孔进行。按照前述(10)使培养物暴露于[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷[3H]TdR(0.5mCi/孔)后研究DNA合成。
流式细胞计量术分析流式细胞计量分析和分选根据标准设置在FACStarPlus流式细胞计量仪(Becton Dickinson，Mountain View，CA)上进行。由于CD80对CD28的低亲和性，用CD80-C215Fab融合蛋白对CHO-CD28细胞的染色通过省略细胞洗涤来进行。
细胞因子分析用IL-2 ELISA试剂盒(huIL-2 Duoset，Genzyme)分析IL-2的产量。结果CD80-Fab融合蛋白的描述Fab部分具有鼠IgG1/k的同种型，尽管它含有IgG2A/k单克隆抗体C215的可变区(Dohlsten等1995)。三肽序列GGP在CH1结构域中形成链间二硫键的链内半胱氨酸之后。在CD80-C215Fab-SEAm57三体融合蛋白中，它作用为Fd和具有5个替换的葡萄球菌肠毒素A之间的间隔(SEA；Betley等1988)。导入替换F47A和D227A以降低对MHC II类的亲和性(Abrahmsen等1995)，并且导入替换N102Q、N149Q和T218V以避免在真核细胞中合成时偶然的糖基化。借助X-衍射结构选择后面的这些替换(Soundstrom等1996)。将最终的五突变体命名为SEA突变体57。两种融合蛋白均含有人CD80的胞外结构域(限定为末端FPDN)。使用天然CD80信号肽，并且正如通过纯化CD80-C215Fab的氨基酸测序测定的，发现成熟蛋白起始VIHV。18个氨基酸的间隔连接CD80与CD80-C215Fab中的κ链或CD80-C215Fab-SEAm57三体融合蛋白中的Fab片段的Fd部分。这些间隔象Q-接头(Wooton等1996)并分别具有序列SARQANELPGAPSQEERA(SEQ ID NO 15)和SARQANELPGAPSQEERP(SEQ ID NO 16)。Facs分析CD80-C215Fab融合蛋白与CD28阳性细胞和C215阳性细胞的结合CD28阳性细胞CHO-CD28细胞用CD80-C215Fab，CD80-C215Fab-SEAm57或C215Fab-SEA染色后与PE标记的抗小鼠κ链mAb一起培养。染色在4℃进行而不进行任何洗涤。
CD80-C215Fab和三体融合蛋白以剂量依赖型方式与CHO细胞上表达的CD28结合。正如所预期的，用对照融合蛋白C215Fab-SEA未观察到染色。
CD215阳性细胞融合蛋白对C215抗原的结合针对Colo205细胞来评估。Colo205细胞用CD80-C215Fab，CD80-C215Fab-SEAm57或C215Fab-SEA染色后与PE标记的抗小鼠κ链mAb一起培养。染色在4℃进行并在每个染色步骤之间进行三次洗涤。
结果(图1-2)CD80-C215Fab和CD80-C215Fab-SEAm57均以剂量依赖型方式结合C215抗原阳性的Colo205细胞。此结合比C215Fab-SEA低50-100倍。这表明CD80在融合蛋白N-末端部分的导入可能干扰C215Fab部分与C215抗原的结合。二体融合超级抗原活化的T细胞的共刺激。
为了测定融合蛋白的生物学活性，对它们进行超级抗原活化的T细胞的共刺激测试。
增殖将T细胞与Colo205细胞和4uM C242Fab-SEA以及不同量CD80-C215Fab一起培养4天后计数掺入的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷以测定增殖。无任何CD80-C215Fab时得到的活性是20039cpm+/-1750。
IL-2的制备将T细胞与Colo205细胞和4uM C242Fab-SEA以及不同量CD80-C215Fab一起培养4天后收集上清液并测定IL-2量。无任何CD80-C215Fab时得到的IL-2量是2849pg/ml。
结果(图3-4)正如在增殖和IL-2合成时观察到的，CD80-C215Fab以剂量依赖型方式共刺激C215Fab-SEA诱导的T细胞活化。三体融合超级抗原活化的T细胞的共刺激。
为了测试三体融合蛋白的生物学活性，将纯化的T细胞与Colo205细胞上呈递的C215Fab-SEAm23(m23是用于三体融合蛋白影响MHC II类结合的相同突变体，即Phe47Ala/Asp227Ala)或CD80-C215Fab-SEAm57一起培养。增殖4天后计数掺入的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷。IL-2的制备4天后收集上清液并测定IL-2量。
结果(图5-6)当呈递于Colo205细胞上时，三体融合蛋白诱导T细胞活化和IL-2合成。用C215Fab-SEAm23时未见到这样的活性，表明CD80共刺激对活化的重要性。由于三体融合蛋白更低的结合亲和性(比C215Fab-SEA低50-100倍，参见FACS数据)，实际与细胞结合的C215Fab-SEAm23的量很可能实际上比三体融合蛋白更高。实施例2靶向的IL-2增强和延长了FabSEA对T细胞活化和肿瘤治疗中的作用材料与方法IL-表达质粒的构建用从已用超级抗原SEA刺激24小时的人外周血单核细胞(PMB)分离的mRNA通过RT-PCR克隆IL-2 cDNA。用Dynal，Oslo的mRNA Direct试剂盒根据制造商说明从5×106个细胞分离mRNA。通过加热到95℃洗脱退火到oligo(dT)26-包被的磁珠上的mRNA。随后利用RT和Taq聚合酶的DNA聚合酶活性通过RT-PCR得到PCR产物。将洗脱的mRNA的1/10与PCR引物IL2-1和IL2-2混合并进行标准PCR反应(30个循环)。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，从凝胶中切下此条带并用Prep-a-gene试剂盒(Bio-Rad)加以纯化。用EcoRI和BamHI酶切后将片段克隆入EcoRI/BamHI酶切的pBluescript KS II中。对插入进行测序并且证实与以前报道的IL-2 cDNA(Taniguchi等1983)一致。然而，作为PCR反应，DNA片段编码Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg-(SEQ ID NO23)，“Gly-Pro-Q-接头”已加到编码成熟人IL-2片段的5’。将Q-hIL2作为RsrII-NheI片段克隆入来自保藏中心的质粒(用RsrII-XbaI切割)中。得到的质粒pMS306介导C215FabSEA-Q-hIL2分泌到大肠杆菌的外周质中。按如下进一步优化这些部分间的接头。用定点诱变将编码Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO19)的接头编码区(替代原来的Gly-Gly-Pro)导入超级抗原与Fab部分的编码区之间。相似地，用接头Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(SEQ ID NO20)、Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg(SEQ ID NO21)和Gly-Pro-Thr-Glu-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr(SEQ IDNO22)。替代IL-2与Fab部分之间原来的Q-接头。对于二体融合蛋白组合，也分别比较IL-2与重链或轻链融合的构建体。
引物IL2-15′-GCG GAT CCC GGT CCG CGT CAG GCT AAC GAA CTG CCAGGA GCT CCG TCT CAG GAA GAG CGT GCA CCT AC TTCAAG TTC TAC AAA G-3′(SEQ ID NO 17)IL2-25′-CCG AAT TCG CTA GCT TAT CAA GTT AGT GTT GAG ATGAT-3′(SEQ ID NO 18)融合蛋白在发酵罐中的表达用带有卡那霉素抗性基因和lacUV5启动子的质粒在大肠杆菌菌株UL 635(xyl-7，ara-14，T4R，deltaompT)中表达融合蛋白。将来自冷冻原种的细菌于25℃在摇瓶中培养约21小时，摇瓶中含有(g/l)(NH4)2SO4，2.5；KH2PO4，4.45；K2HPO4，11.85；柠檬酸钠，0.5；MgSO4·7H2O，1；葡萄糖一水化物，11；0.11mM卡那霉素和1ml/l微量元素溶液(Forsberg等，1989)，但是不含Na2MoO4·2H2O。将细胞培养至OD6001-2并且使用450ml培养物培养基接种发酵罐(Chemap，瑞士)至终体积5升。发酵罐培养基含有(g/l)(NH4)2SO4，2.5；KH2PO4，9；K2NPO4，6；柠檬酸钠，0.5；葡萄糖一水化物，22；MgSO4·7H2O，1；0.11mM卡那霉素；1ml adecanol(Asahi Denka Kogyo K.K，日本)和1ml/l微量元素溶液。通过用25％氨水滴定将pH保持在7.0，温度为25℃并且以5l/分钟用大气通气。通过在间歇期将搅拌从300增加到1000rpm并且在进料间歇期调节60％(w/v)葡萄糖进料而将溶解的O2分压控制在30％。通过加入0.1mM异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷IPTG在OD60050时诱导产物形成。发酵后，通过在4℃以8000xg离心去除细胞。澄清的培养基或者直接分析和纯化或者于-20℃保存。
融合蛋白的纯化通过在30分钟内用0.19％聚乙烯亚胺和0.2M NaCl沉淀来去除澄清培养基中存在的DNA(Atkinson和Jack，1973)。如上所述离心后，收集上清液并且将NaCl浓度调节到0.5M。将此溶液上样到以含有0.05％ Tween 80的10mM磷酸钠、150m NaCl(PBST’pH7.4)平衡的蛋白G Sepharose柱(Pharmacia Biotech AB，Uppsala，瑞典)上。然后用5倍柱体积的PBST洗柱并用pH3.2的0.1M乙酸、0.02％ Tween 80洗脱结合的蛋白。用pH8.0的1M Tris-HCl将样品pH调节至5.0并上样到以50mM乙酸胺、0.02％ Tween 80平衡的SP Sepharose HP柱(Pharmacia Biotech)上。然后用2倍柱体积的平衡缓冲液洗柱并用超过10倍柱体积的50到500mM的乙酸胺梯度洗脱融合蛋白。对于C215Fab-IL2融合蛋白，使用6.0的pH而对于C215Fab-SEA-IL2三体融合蛋白，在分离过程中pH为5.7。将融合蛋白通过0.22um滤膜过滤并保存于-70℃。如果稀释度太大，就用Centricon(Amicon)根据制造商说明将洗脱物浓缩至0.5-1mg/ml。
细胞毒性分析按照前述(Dohlstein等1990)进行MHC II类依赖型和非依赖型细胞毒性分析。简言之，对于MHC II类依赖型分析，将51Cr-标记的Raji细胞(每孔200μl终体积内2500个细胞)与通过在低水平重组hIL-2存在的情况下培养人PBM而产生的SEA依赖型效应细胞系混合。效应细胞∶靶细胞比例是30∶1。对于MHC II类非依赖型分析，将51Cr-标记的C215+colo细胞(2500)与SEA依赖型效应细胞以45∶1的E∶T比例一起培养。培养4小时后通过闪烁计数测定释放到培养基中的51Cr。
对纯化人T细胞的体外共刺激分析基本上按照Lando等(1993)所述纯化天然的人T细胞。简言之，通过Ficoll梯度离心，然后通过明胶柱分离，并且最后通过在含有HNK1和HLA-DR mAB的培养皿上淘选的负选择从人血PBM纯化天然的人T细胞。基本上按照Lando等(1996)所述的用天然的人T细胞进行增殖分析。简言之，将天然的人T细胞(每孔100,000个细胞)在含有添加剂的200μl总体积RPMI-1640中与照射的CHO转染子(每孔10,000个细胞)混合(Lando等1993)。对于含有IL-2的融合蛋白的实验，将细胞在1nM所示物质存在的情况下培养7天。在实验的最后一天，用3H-胸腺嘧啶脱氧核苷对细胞进行脉冲标记以测定向分裂细胞DNA中的掺入。
B16-C25肿瘤的治疗基本上按照前述的(Dohlsten等1994；Hansson等1997)进行治疗。在0天将75000-150000个同系B16-F10黑素瘤细胞静脉注射入C57B1/6小鼠尾静脉内。这些B16细胞表达由C215 mAb识别的人GA-733抗原。在21天时终止实验，此时取出肺并且计数扩散的肺部肿瘤。
免疫组织化学基本上按照前述的(Dohlsten等1995)在带有18天B16-C25肿瘤的动物肺上进行。最后一次注射后4小时提取样品。人工测定染色的区域。
免疫药理学基本上按照前述的(Rosendahl等1996)进行。最后一次注射后48小时从已每日一次接受1或3次注射的C57 B1/6小鼠取出脾脏并在前述的标准51Cr分析中用Raji细胞作为靶细胞测定SEA依赖型细胞毒性。E∶T比例为100∶1。结果和讨论含有IL2的融合蛋白的合成和纯化编码C215FabSEA-Q-hIL2三体融合蛋白的大肠杆菌表达载体得到构建。此载体编码位于从LacUV5启动子转录的双顺反子mRNA上的三体融合蛋白的两个亚单位。这两个亚单位中的每一个前面是指导其转送到大肠杆菌周质间隙的信号肽。第一个亚单位是C215Fab的VH，其后是Gly-Gly-Pro-接头(VH-CHl-Gly-Gly-Pro-SEA)。另一个亚单位是C215Fab的VK，其后是通过Gly-Pro-Q-接头与人IL2连接的C242Fab的CK(Vk-Ck-Gly-Pro-Q-hIL2)。Gly-Pro-Q-接头序列(SEQ ID NO23)是OmpR大肠杆菌蛋白(Wotton等1989)中发现的天然接头的略微修饰的版本。更完整的信息参见材料和方法。也制备了C215Fab-Q-hIL2融合蛋白。除了去除了蛋白的Gly-Gly-Pro-SEA部分之外，它与C215FabSEA-Q-hIL2相同。因此表达载体中相应的DNA序列缺失。用标准方法通过PCR介导的定点诱变产生C215FabSEA-Q-hIL2的突变衍生物以合成大量蛋白如C215FabSEAD227A-Q-hIL2和C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A。在三体融合蛋白的后一变体中，亚单位间的半胱氨酸用两个丝氨酸残基替换。
将编码含有IL2的蛋白的质粒转化入大肠杆菌生产菌株UL635中，并且然后进行发酵。用蛋白G亲和层析从培养基中纯化融合蛋白。用离子交换层析去除融合蛋白的降解变体。如通过SDS-PAGE(材料和方法)测定的，获得的产物是至少90％全长的融合蛋白。用融合蛋白的最佳设计，在培养基中获高达130mg/ml的融合蛋白并且一般从1升培养基中获得70mg三体融合蛋白。
含有IL2的Fab融合蛋白的功能鉴定含有IL2的融合蛋白如C215FabSEA-Q-hIL2和C215Fab-Q-hIL2融合蛋白诱导IL-2依赖型鼠细胞系CTLL-2增殖的能力在摩尔基础上基本上与重组人IL2类似(数据未显示)。此外，发现C215FabSEA-Q-hIL2和C215FabSEA的抗原结合能力和SEA活性在众多分析中是难以区分的，表明将IL2导入分子没有不利影响。这些分析包括在4小时51Cr释放分析中SEA反应性T细胞效应细胞系诱导MHC II类非依赖型杀死C215+人结肠癌细胞系colo205的能力。同样SEA反应性效应T细胞的MHC II类依赖型杀死MHC II类+Raji(大鼠淋巴瘤)细胞以相似效率进行(数据未显示)。通过FSCS分析到更直接的未损伤C215抗原和MHC II类结合的证据。发现C215FabSEA和C215FabSEA-Q-hIL2与Raji细胞结合的剂量依赖型在摩尔基础上相似(数据未显示)。同样，发现C215FabSEA-Q-hIL2和C215Fab-Q-hIL2与colo205细胞的剂量依赖型结合与对C215FabSEA观察到的相似(数据未显示)，表明在含有IL2的融合蛋白中抗原结合没有受到损伤。
FabSEA诱导的IL2依赖型增殖静止人T细胞需要信号1和信号2激发最佳T细胞增殖和活化(Schwartz，1990)。如果呈递到细胞上，超级抗原可传递信号1。预期作为B7/CD28信号转导主要下游效应器的IL-2产生信号2。
在此我们使用从人血纯化的静止T细胞表明C215FabSEA-Q-hIL2三体融合蛋白或C215FabSEA联合C215Fab-Q-hIL2或重组人IL-2的确在体外诱导T细胞增殖(图7)。
将静止人T细胞在IL2(以C215Fab-Q-hIL2、C215FabSEA-Q-hIL2或重组人IL-2的形式)存在的情况下与靶向的SEA(C215FabSEA或C215FabSEA-Q-hIL2)一起培养。将SEA呈递于用C251抗原(通过Fab部分)、结合SEA的MHC II类/Dr转染的照射的CHO细胞上。未转染的CHO细胞用作对照。T细胞与CH0转染子和目的物质一起培养7天后通过3H-胸腺嘧啶脱氧核苷向DNA中的掺入测定增殖。
当呈递于用Fab所针对的人C251抗原(CHO-C215)转染的CHO细胞上时，C215FabSEA-Q-hIL2诱导人T细胞的增殖(图7)。同样，当将蛋白呈递于CHO-Dr(人MHC II类)上时也诱导增殖，而在未转染的CHO细胞(CHO)存在时或无CHO细胞(R10)存在时未观察到增殖。当呈递于CHO细胞上时C215FabSEA或C215Fab-Q-hIL2本身不诱导任何明显的增殖，表明SEA和IL2二者对增殖的诱导的确是必须的。因为C215FabSEA和C215Fab-Q-hIL2或C215FabSEA和重组人IL2的组合诱导与C215FabSEA-Q-hIL2诱导的数量上相似的效应，这一点得到证实。这也表明在此分析中IL2是必须的，但是与SEA不同，它不需要不是细胞结合的。
C215FabSEA-Q-hIL2以及C215FabSEA和C215Fab-Q-hIL2的组合导致体内增强和持续的T细胞活化和改善的肿瘤浸润正如通过诱导SEA依赖型杀死靶细胞的能力测定的，C215Fab-Q-hIL2+C215FabSEA和C215FabSEA-Q-hIL2均是比C215FabSEA更有力的T细胞活化诱导剂。简言之，小鼠每日施用所示蛋白，共接受1或3次注射。最后一次注射2天后，从处理的小鼠取出脾并在标准4小时51Cr释放分析中测定对SEA包被的Raji细胞的细胞毒性活性。
C215FabSEA-Q-hIL2和C215FabSEA/C215Fab-Q-hIL2不仅诱导增强的而且诱导持续的T细胞活化。在第四次注射C215FabSEA后彻底浸入的血清细胞因子如INFγ的水平即使在第四次注射C215FabSEA-Q-hIL2后仍维持在很高水平(数据未显示)。一般地，INFγ和INFα的水平比C215FabSEA的情况高得多(高达10倍)。
用C215FabSEA和C215Fab-Q-hIL2联合处理对确定的B16-C215肿瘤的改进治疗在鼠B16黑素瘤模型中研究IL2增强FabSag肿瘤治疗的效应(图9)。在所示实施例中，在0天用150,000个转染了C215 mAb所针对的人肿瘤抗原GA-733的B16细胞(下面的B16-C215)接种8-12周龄的C57 B1/6雌性小鼠。所示物质在5、6和7天注射。每个数据点相当于7只动物。在第21天杀死动物，并且计数有黑色素形成的B16肿瘤建群的肺。与未处理的对照相比，在多个实验中显示C215FabSEA和C215Fab-Q-hIL2的组合比C215FabSEA诱导更好的治疗(图9)。在所示的实验中，C215FabSEA和C215Fab-Q-hIL2的组合治疗比C215FabSEA-Q-hIL2三体融合蛋白给出更好的治疗效果。
随后的免疫组织化学研究揭示只有C215FabSEA或C215FabSEA和C215Fab-Q-hIL2的组合得到相似数目的B16-C215肿瘤浸润的CD4和CD8T细胞。然而，有趣的是CD25(IL2Ra)阳性细胞的数目(T细胞活化的良好标记)在第三和第四次注射C215FabSEA/C215Fab-Q-hIL2之间显著增加(图10)。相反，在C215FabSEA情况下则减少，表明开始无反应力。因此在组合治疗时浸润T细胞的质量看来比只有C215FabSEA时更高，这可能有助于解释改善的治疗效应。同样，第四次注射FabSEA后T细胞活化之后产生的血清细胞因子如干扰素γ显著下降(图11)。然而，用FabSEA-Q-hIL2三体融合蛋白，即使在第四次注射后干扰素仍维持在高水平。此观察结果提供了另外的提示，即在构建体中包含IL2可阻碍FabSEA诱导的T细胞无反应状态。
用C215FabSEAD227A-Q-hIL2对B16-C215肿瘤的改进治疗超级抗原在人类中比小鼠中的毒性更大，部分因为在人类中对MHC II类的亲和性高得多(Hansson等1997)。因此预期FabSEA蛋白的系统毒性是用于人类治疗的主要限制因素。与系统免疫活化(SEA-MHC II类依赖型)相对增加肿瘤中局部活化(Fab依赖型)的一种方法将是增加SEA对MHC II类的亲和性。根据SEA的晶体结构，我们制备了对MHC II类的亲和性减小100倍的C215FabSEA的突变体C215FabSEAD227A。与野生型C215Fab-SEA不同，它不具有结合MHC II类分子的能力，这种能力据信是SEA-介导系统毒性的主要原因(Hansson等1997)。
在治疗Vb3 TCR转基因小鼠中的第一天B16-C215肿瘤时，有效治疗与毒性之间的窗口对于C215FabSEAD227A突变体要比C215FabSEA宽至少50倍(Hansson等1997)。根据此发现，免疫组织化学法揭示在导致相似治疗的两种蛋白剂量时，观察到肿瘤中相似的免疫活化，而在含有C215FabSEAD227A的脾脏中观察到小得多的系统免疫活化(Hansson等1997)。此外，在兔子中的药物动力学研究中揭示与C215FabSEA相比，C215FabSEAD227A向大多数MHC II类+细胞定位的脾和其它淋巴器官的靶向显著下降(数据未显示)。
为了临床使用，预期Fab-SEA-IL2三体融合蛋白含有突变的超级抗原。因此我们制备了C215FabSEAD227A-Q-hIL2三体融合蛋白。制备的蛋白能诱导静止人类T细胞的增殖(数据未显示)，并且在小鼠中诱导高达6次注射的持续的SEA依赖型CTL活性(图12)。相反，用C215FabSEAD227A(＜10％-数据未显示)和C215Fab-Q-hIL2(＜15％-数据未显示)观察到背景CTL活性。用每日施用的此蛋白的8次注射在正常C57B/6小鼠中对确定的(第三天)B16-GA733肿瘤的治疗得到与最佳剂量C215FabSEA同样好的治疗(图13)。在此系统中，设计为人而不是小鼠中最佳活性的C215FabSEAD227A的确仅具有较小的效应(图13)。然而，在最高剂量时，发现C215FabSED227A-Q-hIL2的部分毒性。相反，多个治疗实验表明与只有C215FabSEAD227A相比，C215FabSEAD227A和C215Fab-Q-hIL2的组合(8次注射)的确也导致Vb3 TCR转基因小鼠中第3天B16-GA733肿瘤治疗的实质改善(数据未显示)。在Vb3 TCR转基因小鼠中，＞90％的T细胞与SEA反应，与正常小鼠中的10-20％不同。有趣的是，反复注射(高达8次)C215FabSEAD227A-Q-hIL2(以20μg/kg反复注射后0/4只兔子死亡)的兔中没有表现比无IL-2的C215FabSEAD227A(以20μg/kg反复注射后0/4只兔子死亡；以20μg/kg时4/4死亡)更高的毒性以及比C215FabSEA(以1μg/kg反复注射后1/4只兔子死亡)低得多的毒性。同时，只有在用C215FabSEAD227A-Q-hIL2才观察到而用C215FabSEAD227A或C215FabSEA没有观察到持续的免疫活化(淋巴细胞反弹效应)，表明IL-2的包含的确有助于阻碍FabSEA诱导的T细胞无反应状态(数据未显示)。
用IL-2突变的C215FabSEAD227A-Q-hIL2蛋白治疗B16-C215肿瘤含有IL2的三体融合蛋白的更高毒性和以C215FabSEA-Q-hIL2为例更低的治疗效应可能部分是由于SEA活性“反复靶向”到淋巴样组织。这种反复靶向效应是由于IL2对其受体的高亲和性(Kd＝10pM)，这主要见于脾脏和其它淋巴样组织中的T细胞。为了说明此问题，我们已制备了C215FabSEAD227A-Q-hIL2的衍生物，其中IL-2部分经突变以降低对IL2R+细胞的亲和性并因而减少系统活化。原则上使用相同方法增大C215FabSEAD227A蛋白的治疗窗口。
IL-2与其高亲和性受体之间的相互作用已得到非常充分的研究。受体由三个亚单位a，b和g组成。B和g的结合对生物学活性是必须的，而亚单位a对最佳结合是必须的。我们的策略是按照需要通过去除亚单位a的结合，并且随后降低但不排除亚单位b和g的结合来降低IL-2与其高亲和性受体之间的亲和性。
设计C215FabSEAD227A-Q-hIL2的三个这样的突变体以去除IL2Ra结合(F42A，F42K)并且另外影响IL2Rb结合(F42A/D20S)。这些蛋白在诱导IL-2依赖型鼠细胞系CTLL-2的增殖时分别具有100(F42A)、1000(F42K)和3000倍(F42A/D20S)降低的活性。进行实验以更详细地测定这些蛋白，特别是关于结合活化人T细胞和IL2受体的亲和性和比例的特性。起初的治疗实验表明这样的策略是有希望的(图14，图15)。在所示的实施例中，对携带3天B16-GA733肿瘤的Vb3 TCR转基因小鼠进行8次注射(其中SEA活化＞90％的T细胞)。虽然在最高剂量仍观察到一些毒性，但是使用C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42A或C215FabSEAD227A-Q-hIL2F42K(8次注射)而不是C215FabSEAD227A-Q-hIL2(6次注射)时毒性变得更晚，并且在最高剂量的治疗与PBS处理的对照相比导致多于90％的肿瘤减小(图14)。目前我们正通过将其它突变导入SEA和IL2部分中来探索此高度有前途的方法以进一步改进对毒性窗口的治疗。
此外，制备在IL-2部分中包含Thr51Pro突变的C215FabSEA-Q-hIL2三体融合蛋白(Chang等1996)的工作正在进行中。此突变可用于阻断IL2R介导的融合蛋白的内化而不降低IL-2的生物学活性。这很可能是重要的，因为它将减少通过此途径对融合蛋白的去除，并因此增加药物的局部浓度和效力。Thr51Pro突变的蛋白可在SEA和IL-2中含有进一步的突变以分别降低对MHC II类和IL2受体的亲和性。实施例3 证实(Sag，IM)-缀合物效应的实验。靶细胞IM-受体阳性或MHCII类阳性细胞。
Sag-IM分子可与表达MHC II类的细胞结合，从而此促进SDCC。选择性地，可以靶向表达IM受体的细胞。因此有可能Sag-IM分子可用于诱导杀死不利的表达IM受体的细胞。
在效应细胞和靶细胞均不表达C215Fab所识别的抗原时，C215FabSEA-hIL2三体融合蛋白可看作是Sag-IM分子。效应细胞将是正确Vβ亚型的T细胞。靶细胞可能例如是表达IL2受体如那些存在于某些白血病或淋巴瘤细胞上的受体的异常造血细胞。
实验A概念的体外证据效应T细胞(反复以SEA刺激的人T细胞)和靶细胞(例如人“Raji”B细胞淋巴瘤细胞)将与经突变而降低与MHC I类结合的C215FabSEA-hIL2三体融合蛋白一起培养。这是SDCC分析的标准设置(效应T细胞，Raji细胞，实验物质)。我们实际上已发现具有严重下降的对MHC II类的亲和性的C215FabSEAD227A-Q-hIL2蛋白在杀死Raji细胞方面具有比C215FabSEAD227A高约10倍的效力。对于增加的效力的明显解释是三体融合蛋白呈递到Raji细胞上表达的IL2受体上。
实验B概念的体内证据鼠淋巴瘤模型(如C57 B1/6小鼠中的RBL-5淋巴瘤)已很好地得到建立(Hoglund等，实验医学杂志168，1469-1474)。在这样的模型中用Sag-IM蛋白靶向IL-2受体或其它IM-R可提供体内靶向IM-受体阳性细胞的概念的证据。
Sag-IM靶向IM-R阳性细胞由于效应细胞和靶细胞均频繁表达IM受体的事实而变得复杂化。不过，在有些情况下这种治疗方式可能有效。诸如靶细胞上IM-R表达的密度、靶细胞的数目和位置等的因素很可能起作用。同时应该强调例如IL2Rα在T细胞活化时仅受到正调节-因此在IM-R在靶细胞上而不是在效应细胞上以高丰度表达时可能是暂时窗口。
可相似地使用SAG-IM融合蛋白，其中Sag代表经突变而具有降低的对MHC II类的亲和性的野生型超级抗原。参考文献*-标记的文章可能发现比其它文章与免疫调节剂更相关。
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序列表(1)基本信息(i)申请人(A)名称Parmacia&Upjohn AB(B)街道Lindhagensgatan(C)城市Stockholm(E)国家Sweden(F)邮政编号(Zip)S-11287(G)电话+46 8 695 80 00(ii)发明名称靶细胞的定向细胞溶解、引起细胞溶解的试剂和组合物以及能用于制备这些试剂的化合物(iii)序列数23(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，版本#1.30(EPO)(2)关于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO1ATATAAGCTT CCACCATGGG CCACACACGG AGG33(2)关于SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO2ACGCAGATCT TTAGTTATCA GGAAAATGCT CTTGC 35(2)关于SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度39个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO3TCAAAGCTTC TCGAGCGCGC TGTTATCAGG AAAATGCTC 39(2)关于SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度46个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸
(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO4CGCGCGTCAG GCTAACGAAC TGCCAGGCGC CCCGTCACAG AGACGA 46(2)关于SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度60个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO5AGCTTCGTCT CACGCGCGTT CTTCCTGTGA CGGGGCGCCT GGCAGTTCGT TAGCCTGACG 60(2)关于SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO6TGGTACACCA CAGAAGACAG CTTGTATGTA TG32(2)关于SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度32个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO7CATACATACA AGCTGTCTTC TGTGGTGTAC CA 32(2)关于SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO8CGAATAAGAA AGACGTCACT GTTCAGGAGT TGG 33(2)关于SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO9CCAACTCCTG AACAGTGACG TCTTTCTTAT TCG 33(2)关于SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO10GAGATAATAA AGTTATTAAC TCAGAAAACA TG 32(2)关于SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO11CATGTTTTCT GAGTTAATAA CTTTATTATC TC 32(2)关于SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度49个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸
(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO12CGCGGATCCG CGCGGCACCA GGCCGCTGTT ATCCGGAAAA TGCTCTTGC 49(2)关于SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度77个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO13CCGGATAACA GCGCGCGTCA GGCTAACGAA CTCCCAGGCG CCCCGTCACA GGAAGAACGC 60CCGCAGGTCC AACTGCA 77(2)关于SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度69个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO14GTTGGACCTG CGGGCGTTCT TCCTGTGACG GGGCGCCTGG CAGTTCGTTA GCCTGACGCG 60CGCTGTTAT 69(2)关于SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度18个氨基酸
(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO15Ser Ala Arg Gln Ala Asn Glu Leu Pro Gly Ala Pro Ser Gln Glu Glu1 5 10 15Arg Ala(2)关于SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度18个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO16Ser Ala Arg Gln Ala Asn Glu Leu Pro Gly Ala Pro Ser Gln Glu Glu1 5 10 15Arg Pro(2)关于SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度84个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO17GCGGATCCCG GTCCGCGTCA GGCTAACGAA CTGCCAGGAG CTCCGTCTCA GGAAGAGCGT 60GCACCTACTT CAAGTTCTAC AAAG 84(2)关于SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸DNA引物”(xi)序列描述SEQ ID NO18CCGAATTCGC TAGCTTATCA AGTTAGTGTT GAGATGAT 38(2)关于SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO19Pro Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Pro1 5 10(2)关于SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型
(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO20Gly Pro Arg Gln Ser Asn Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ser Gln Glu Glu1 5 10 15Arg(2)关于SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO21Gly Pro Arg Gln Ala Lys Thr Leu Pro Gly Ala Pro Ser Gln Thr Thr1 5 10 15Arg(2)关于SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO22Gly Pro Thr Glu Ala Asp Glu Leu Pro Gly Ala Pro Ser Glu Glu Glu1 5 10 15Thr(2)关于SEQ ID NO23的信息(i)序列特征
(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO23Gly Pro Arg Gln Ala Asn Glu Leu Pro Gly Ala Pro Ser Gln Glu Glu1 5 10 15Arg
权利要求
1.一种通过在免疫调节剂存在的情况下使两种类型的细胞与超级抗原(SAG)接触从而在T细胞存在的情况下使靶细胞失活的方法，其特征在于超级抗原和免疫调节剂中至少一种以“游离”超级抗原(Sag)和将缀合物靶向靶细胞的部分之间的缀合物形式存在。
2.权利要求1的方法，其特征在于a.超级抗原(SAG)和免疫调节剂以包含超级抗原(Sag)、针对靶细胞的靶向部分(T)和免疫调节剂(IM)的三体缀合物形式(T，IM，Sag-缀合物)使用；b.超级抗原(SAG)以超级抗原(Sag)和针对靶细胞的靶向部分(T)之间的二体缀合物结合免疫调节剂(IM)和针对靶细胞的靶向部分(T’)之间的二体缀合物的形式(T，Sag-缀合物+T’，IM-缀合物)使用；c.超级抗原(SAG)以超级抗原(Sag)和针对靶细胞的靶向部分(T)之间的二体缀合物形式使用并且免疫调节剂(IM)以游离形式，即未与针对靶细胞的靶向部分结合的形式(T，Sag-缀合物+IM)使用；d.超级抗原(SAG)以自由形式(Sag)使用并且免疫调节剂以缀合物形式，即免疫调节剂(IM)与超级抗原(Sag)之间的二体缀合物形式(Sag+T，IM-缀合物)使用；以及e.超级抗原(SAG)与免疫调节剂以超级抗原(Sag)与免疫调节剂(IM)之间的二体缀合物形式(Sag，IM-缀合物)使用。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于使用选择性的a。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于使用选择性的b，同时具有免疫调节剂缀合物中的靶向部分可能与超级抗原缀合物中的靶向部分不同的可能性。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于使用选择性的c。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于使用选择性的e并且其中IM和T是常见的，例如细胞因子受体、例如靶向带有受体的缀合物细胞的IL-2。
7.权利要求1-6中任意一项的方法，其特征在于在患有与靶细胞有关的疾病如癌症的个体中体内使细胞失活。
8.权利要求1-7中任意一项的方法，其特征在于靶向部分是抗体，优选地其抗原结合片段如Fab或Fab2-片段或单链抗体。
9.权利要求1-8中任意一项的方法，其特征在于超级抗原Sag例如通过突变而修饰成a.与相应的野生型超级抗原相比，具有降低的与MHC II类抗原结合的能力；b.与相应的野生型超级抗原相比，在人血清中具有降低的血清反应性；c.与相应的野生型超级抗原相比，在人类中具有降低的免疫原性；d.是两种或多种游离超级抗原之间的嵌合体。
10.权利要求1-9中任意一项的方法，其特征在于超级抗原例如通过在编码对于MHC II类亲和性重要的氨基酸残基的密码子中的突变而修饰成具有降低的MHC II类亲和性。
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的方法，其特征在于免疫调节剂选自a.细胞因子如IL-2，或b.趋化因子，或c.结合淋巴细胞表面的受体和配体的胞外部分，例如B7分子的胞外部分如CD80和CD86。
12.权利要求1-11中任意一项的方法，其特征在于免疫调节剂选自能够例如通过阻碍超级抗原活化的T-细胞转变成无反应状态而在体内增强超级抗原效应的免疫调节剂。
13.权利要求1-11中任意一项的方法，其特征在于免疫调节剂是B7配体的胞外部分如CD80和CD86或CD28/B7信号转导的下游效应器如IL-2。
14.权利要求11-13中任意一项的方法，其特征在于免疫调节剂例如通过突变而修饰成与相应的天然形式相比表现对其淋巴细胞受体降低的亲和性。
15.根据权利要求1-13中任意一项所述的方法，其特征在于免疫调节剂是IL-2或CD80的胞外部分或其已按照权利要求14修饰的形式。
16.符合下面化学式的超级抗原(T)x(Sag)y(IM)z化学式Ia.T是靶向部分，Sag对应于游离超级抗原，IM是非超级抗原的免疫调节剂，并且T、Sag和IM通过在一个和相同缀合物分子内可能不同或相同的有机接头B连接在一起；b.x，y和z是一般选自0-10的整数如0-5，并且分别代表T、Sag和IM部分在给定缀合物分子中的数目，其中y＞0并且同时x和z中的一个或二者＞0。
17.权利要求16的超级抗原缀合物，其特征在于它是融合蛋白，其中x，y和z均是整数1-3、优选1-2，并且x，y和z之间的典型关系选自x＝y＝z；x＝y＝0.5z；x＝0.5y＝0.5z和x＝0.5y＝z。
18.权利要求16的超级抗原缀合物，其特征在于它是表达为两条链产物的融合蛋白。
19.权利要求18的融合蛋白，其中超级抗原部分SAG融合在靶向部分T’的C-末端上并且免疫调节剂IM融合在靶向部分T”的C-末端上。
20.权利要求19的融合蛋白，其中T’和T”如权利要求8中所定义，和/或SAG如权利要求9-10中任意一项所定义和/或IM如权利要求11-15中任意一项所定义。
21.权利要求20的融合蛋白，其中SAG是葡萄球菌肠毒素A(SEA)，T’是C215 Fab片段的CHl-结构域，T”是C215抗体的轻链而IM是白细胞介素2。
22.根据权利要求19-21所述的融合蛋白，其中SAG通过3-11氨基酸残基的易弯曲亲水性氨基酸接头B’与T’融合并且IM通过10-20个氨基酸残基的亲水并且中性或带正电的氨基酸接头Q与T”融合。
23.权利要求22的融合蛋白，其中B’选自Gly-Gly-Pro和Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO19)，并且Q选自Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Asn-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(SEQ ID NO23)、Gly-Pro-Arg-Gln-Ser-Asn-Glu-Thr-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Arg(SEQ ID NO20)、Gly-Pro-Arg-Gln-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Gln-Thr-Thr-Arg(SEQ IDNO21)和Gly-Pro-Thr-Glu-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Ala-Pro-Ser-Glu-Glu-Glu-Thr(SEQ ID NO22)。
24.权利要求16的超级抗原缀合物，其特征在于它是融合蛋白，其中靶向部分不存在(x＝0)，并且y和z是整数1-3、优选1-2，并且x和y之间的优选关系选自x＝y；x＝0.5y；0.5x＝y；x＝1/3y和1/3x＝y。
25.权利要求16的超级抗原缀合物，其特征在于具有化学式(Sag)y(IM)z化学式II其中y＝z＝1。
26.根据权利要求16、17、24或25所述的超级抗原缀合物，其特征在于靶向部分如权利要求8中所定义，和/或超级抗原部分如权利要求9-10中任意一项中所定义和/或免疫调节剂部分如权利要求11-15中任意一项中所定义。
27.一种定向免疫调节剂，其特征在于作为靶向部分(T‘’‘)与经修饰例如通过突变而对其淋巴细胞受体有更低的亲和性或在与其淋巴细胞受体结合时有更低的内化率(与相应的天然形式相比)的非超级抗原免疫调节剂(IM)之间的缀合物，所述缀合物符合化学式(T)x(Sag)y(IM)z化学式Va.T是靶向部分，Sag对应于游离超级抗原，IM是修饰的免疫调节剂，Sag和IM通过在一个和相同缀合物分子内可能不同或相同的有机接头B连接在一起；b.x，y和z是一般选自0-10的整数如0-5，并且分别代表T、Sag和IM部分在给定缀合物分子中的数目，其中z＞0并且同时x和y中的一个或二者＞0。
28.权利要求27的定向免疫调节剂，其特征在于它是融合蛋白，其中x，y和z均为整数1-3、优选1-2，并且x，y和z之间的典型关系为x＝y＝z；x＝y＝0.5z；x＝0.5y＝0.5z和x＝0.5y＝z。
29.权利要求27的定向免疫调节剂，其特征在于它是融合蛋白，其中超级抗原部分不存在(y＝0)，并且x和z是整数1-3，并且x和y之间的优选关系选自x＝y；x＝0.5y；0.5x＝y；x＝1/3y和1/3x＝y。
30.权利要求29的定向免疫调节剂，其特征在于它符合化学式(T)y(IM)z其中y＝z＝1。
31.编码超级抗原和不是超级抗原的免疫调节剂如IL-2的DNA分子。
32.权利要求31的DNA分子，其特征在于它是以双顺反子构建体形式，其中a.第一个顺反子含有编码包含可能经如权利要求9-10中定义的修饰的非缀合超级抗原(Sag)的多肽I的序列I，并且b.另一个顺反子含有编码包含可能如权利要求11-15中定义的得到修饰的免疫调节剂的多肽II的序列II。
33.权利要求32的DNA分子，其特征在于序列I和II中的一个或两个与各个编码抗体的至少一部分的序列融合使得多肽I和II可结合并形成包含游离超级抗原、免疫调节剂和抗体的三体融合蛋白。
34.权利要求31的DNA分子，其特征在于超级抗原是非缀合超级抗原并且编码超级抗原的序列可能通过编码寡肽接头的序列与编码免疫调节剂的序列融合。
全文摘要
一种通过在免疫调节剂存在的情况下使两种类型的细胞与超级抗原(SAG)接触从而在T细胞存在的情况下使靶细胞失活的方法,其特征在于超级抗原和免疫调节剂中至少一种以“游离”超级抗原(Sag)和将缀合物靶向靶细胞的部分之间的缀合物形式存在。超级抗原符合化学式(Ⅰ):(T)
文档编号A61K38/00GK1275085SQ98808475
公开日2000年11月29日 申请日期1998年7月2日 优先权日1997年7月21日
发明者M·索加尔德, L·阿布拉姆森, P·兰多, G·福斯伯格, T·卡兰德, M·多尔斯坦 申请人:法玛西雅和厄普约翰公司