P19/Ebi3复合物及其多克隆抗体在系统性红斑狼疮诊治中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及P19/Ebi3复合物及其多克隆抗 体在系统性红斑狼疮诊断、治疗中的用途。
【背景技术】
[0002] 系统性红斑狼疮（SystemicLupusErythematosus,SLE)是一种严重威胁人类健 康与生命的自身免疫性疾病，有较高的致死率和致残率。其病因与发病机制尚不明了，普遍 认为是环境因素作用于一定遗传背景的机体（包括组织相容性、细胞因子、细胞因子受体 等表达的不同型别）而形成的结果。其免疫病理特征是体内产生多种高低度、致病性自身 抗体，同时淋巴细胞凋亡。释放出大量细胞核内容物及核糖小体而成为自身抗原；抗原抗体 结合形成免疫复合物，免疫复合物的沉积可导致靶细胞损伤和炎症，导致各个组织和器官 发生病变。在该病理过程中，B细胞处于高度活化状态，且该过程与T细胞密切相关，有T细 胞依赖性。
[0003] 复杂的细胞因子网络调节T细胞和B细胞的生长、分化和功能，这些细胞因子可 以分为两大类：Thl型（主要诱导细胞免疫）和Th2型（主要促进抗体产生）。白细胞介 素12(IL-12)在细胞因子网络调节中起着重要的作用，它主要由单核巨噬细胞分泌产生。 IL-12家族由一个a-链（P19,P28或P35)和一个P-链（P40或Ebi3)异二聚体亚基组 成（图1)，其与一些自身免疫疾病，尤其是Thl细胞介导的自身免疫病的发病有关。
[0004] 目前对于系统性红斑狼疮的临床诊断主要依靠临床表现、实验室检查、组织病理 学和影像学检查。由于SLE临床表现病症因人而异，有时会出现误诊。而治疗系统性红斑 狼疮的常规方法是使用抗疟疾药、抗炎药和免疫抑制药，当症状难以控制时，对非留体抗炎 剂补充以皮质激素；虽然在控制病情、阻止疾病发展中有显著作用，但多有明显不良反应， 且对部分患者疗效不佳。B细胞和T细胞在SLE的发病机制中起着重要的作用，针对免疫细 胞的生物学疗法将成为治疗SLE的焦点。
【发明内容】
[0005] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于系统性红斑狼疮诊 治的复合物P19/Ebi3及其多克隆抗体。相比传统的系统性红斑狼疮的诊断和治疗方法，使 用多克隆抗体与导致自体抗体过度产生的病理性免疫响应相互作用或将其纠正的特异性 治疗将更有优势，如具有较高的特异性与准确性，较低的副作用，从而实现治愈系统性红斑 狼疮和/或在长期基础上改善患者的生活品质的病因性治疗。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种分离的P19/Ebi3复合物。
[0008] 进一步，上面所提到的复合物是由P19和Ebi3两个亚基组成的。
[0009] 进一步，上面所提到的P19亚基包括如SEQIDN0:1所示的氨基酸序列的蛋白，或 其保守性变异蛋白。
[0010] 进一步，上面所提到的Ebi3亚基包括如SEQIDN0:2所示的氨基酸序列的蛋白， 或其保守性变异蛋白。
[0011] 进一步，上面所述的亚基是由多核苷酸编码的，所述的P19亚基的核苷酸序列如 SEQIDNO: 3所示；所述的Ebi3亚基的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
[0012] 本发明提供了一种重组载体，它含有上面所述的多核苷酸序列。
[0013] 进一步，所述的重组载体中还含有与所述的多核苷酸序列操作性相连的表达调控 序列。
[0014] 本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、 粘粒、噬菌体、病毒等。
[0015] 病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺 病毒相关病毒载体、疱疹病毒（例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）载体、甲病毒载 体。
[0016] 真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、 pcDNA3. 0表达载体、pcDNA3. 1表达载体、pEGFP表达载体、pEFBos表达载体、pTet表达载 体、PTRE表达载体、pReceiver-Lvl8表达载体、pZE-LV122X表达载体或者在公知表达载体 的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。
[0017] 优选地，所述表达载体为真核表达载体。优选地，所述真核表达载体为 pReceiver_Lvl8 和pEZ_LV122X表达载体。
[0018] 本发明提供了一种宿主细胞，它含有所述的重组载体，或其基因组中整合有所述 的多核苷酸。
[0019] 优选地，所述宿主细胞为CHO细胞。
[0020] 本发明提供了一种P19/Ebi3复合物的制备方法，它包括下列步骤：
[0021] (a)培养所述的宿主细胞；
[0022] (b)从培养物中分离出所述的复合物。
[0023] 本发明提供了一种抗体，所述抗体特异性识别和/或结合所述的复合物。
[0024] 优选地，所述的抗体为多克隆抗体。
[0025] 本发明提供了一种制备抗体的方法，所述方法包括：以所述的复合物免疫动物，从 免疫后的动物体内分离出所述复合物的特异性抗体。
[0026] 优选地，所述抗体为多克隆抗体，用以下所述方法制备：
[0027] 用所述的复合物与完全弗氏佐剂混合（按照体积比1:2~2:1混合，优选地按照 体积比1:1混合）后免疫小鼠，2周后用所述的复合物与不完全弗氏佐剂混合（按照体积比 1:2~2:1混合，优选地按照体积比1:1混合）后强化免疫小鼠，按照相同的方式再次强化 免疫2-3次，1-2周后从血清中分离出多克隆抗体。
[0028] 本发明提供了P19/Ebi3复合物在制备抑制B细胞向浆细胞分化药物中的应用。
[0029] 进一步，所述浆细胞为B细胞分化的（GL7+)浆细胞。
[0030] 进一步，P19/Ebi3复合物的特异性抗体、基于P19/Ebi3复合物的肿瘤疫苗、用于 抑制P19/Ebi3复合物活性的蛋白质，抑制P19/Ebi3复合物活性的化合物。
[0031] 本发明提供了一种P19/Ebi3复合物在制备诊断系统性红斑狼疮产品中的应用。
[0032] 进一步，上面所提到的诊断产品包括：通过免疫检测、免疫共沉淀、ELISA或芯片 来检测P19/Ebi3复合物的水平以诊断系统性红斑狼疮的产品。
[0033] 进一步，所述用免疫检测来诊断系统性红斑狼疮的产品包括：与P19/Ebi3复合物 特异性结合的抗体；所述用免疫共沉淀来诊断系统性红斑狼疮的产品包括：与P19/Ebi3复 合物中两个亚基同时特异性结合的抗体；所述用ELISA来诊断系统性红斑狼疮的产品包 括：ELISA试剂盒；ELISA试剂盒包括与P19/Ebi3复合物特异性结合的抗体；所述用芯片来 诊断系统性红斑狼疮的产品包括：蛋白芯片；其中蛋白芯片包括与P19/Ebi3复合物特异性 结合的抗体。
[0034] 优选地，所述产品包括试剂盒和芯片。
[0035] 本发明提供了P19/Ebi3复合物抑制剂在制备治疗系统性红斑狼疮药物中的应 用。
[0036] 进一步，本发明所述抑制剂包括：P19/Ebi3复合物的特异性抗体、基于P19/Ebi3 复合物的肿瘤疫苗、用于抑制P19/Ebi3复合物活性的蛋白质，抑制P19/Ebi3复合物活性的 化合物。
[0037] 进一步，所述P19/Ebi3复合物的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述 P19/Ebi3复合物的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰（例如，嵌合 抗体、scFv、Fab、F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能够保留与P19/Ebi3复合物的结合能力 即可。
[0038] 优选地，所述P19/Ebi3复合物的特异性抗体为多克隆抗体。
[0039] 进一步，所述的药物包括所述的抗体或其活性片段。
[0040] 进一步，本发明的药物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括（但并不限 于）：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶 和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化 合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和 镁、聚乙二醇等。
[0041] 本发明的药物还可与其他治疗系统性红斑狼疮的药物联用，多种药物联合使用可 以大大提尚治疗的成功率。
[0042] "P19/Ebi3复合物"包括P19/Ebi3复合物以及P19/Ebi3复合物的任何功能等同 物。所述功能等同物包括P19/Ebi3复合物保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍 生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与P19/Ebi3的DNA 杂交的DNA所编码的蛋白质。
[0043] 优选地，P19/Ebi3复合物是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
[0044] (1)由序列表中SEQIDNO: 1和SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0045] (2)将SEQIDNO: 1和/或SEQIDNO:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基 酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQIDNO: 1和/或SEQIDNO: 2所示的氨基酸 序列具有相同功能的由SEQIDNO: 1和/或SEQIDN0:2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。 取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳 地1-10个。
[0046] (3)与SEQIDNO: 1和/或SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性 (又称