一种新的查尔酮衍生物及其制备方法与在自身免疫病应用
【专利摘要】本发明公开了一种具有抗炎、免疫抑制作用的新的查尔酮衍生物及其制备方法与在制备自身免疫性疾病药物中的应用。本研究采用活性亚结构拼接的方法，形成含氟查尔酮衍生物，再将含氟查尔酮衍生物与哌嗪片段连接起来，最后合成得到6个新的4’?(1?哌嗪基)查尔酮衍生物。基于体外免疫活性筛选及2个自身免疫性疾病(多发性硬化疾病动物模型和关节炎模型)为筛选平台。本发明首次发现这6个化合物具有显著的免疫抑制作用，在治疗自身免疫性疾病(如：多发性硬化、类风湿关节炎和系统性红斑狼疮和肠炎)显示出较好的药物开发前景。
【专利说明】
一种新的查尔酮衍生物及其制备方法与在自身免疫病应用
技术领域
[0001] 本发明涉及医药领域，具体涉及一种具有免疫抑制作用的新的查尔酮衍生物及其 制备方法与在制备自身免疫性疾病药物中的应用。 技术背景
[0002] 自身免疫性疾病是一类难治性的免疫紊乱而造成的疾病，尤其是类风湿关节炎、 多发性硬化和系统性红斑狼疮等以T细胞反应为主自身免疫性疾病一直困扰着很多病人， 这些疾病具有迀延日久、延绵难治的特点，一直是当今世界医学领域的难题。免疫抑制剂可 通过调节免疫应答的各个环节阻断疾病进程来达到治疗自身免疫性疾病的目的。目前我国 的免疫抑制剂主要依赖进口，且多数免疫抑制剂对机体免疫系统的作用缺乏特异性和选择 性，毒副作用大，限制了其在临床广泛应用。特别在众多类型的自身免疫性疾病的治疗中， 仍然缺乏疗效可靠的药物，目前在国际上虽然有一些新型的生物技术和常规免疫抑制用于 自身免疫性疾病的治疗，但药物的种类非常有限而价格昂贵，因此研制开发具有我国自主 知识产权的高效低毒的抗炎和免疫抑制创新药物已成为当今医学和药学研究的紧迫课题。
[0003] 多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种中枢神经系统炎性脱髓鞘病变为主 要特征的自身免疫性疾病，发病原因主要在于自身免疫T细胞破坏血脑屏障，炎症介质进入 并攻击神经系统，造成神经纤维上的髓鞘脱失、神经元及轴索损伤，炎症细胞浸润。如果未 及时规范诊治，病情最终可导致失明、瘫痪、甚至死亡，因此这种病号称"死不了的癌症"。该 疾病白种人群较为高发，在我国发病率相对较低，但近年来呈现逐年增长的趋势。由于对疾 病本身的了解有限，迄今为止没有一种有效方法能将MS完全治愈，惟一的办法就是靠药物 控制病情的发展，如当下就连临床中可选择的药物也是寥寥无几，且高昂的药费也绝非是 普通人可以承受的。MS治疗药物的告急，让寻找疗效好、价格低廉的药物成为了一场激烈的 国际角逐战，因此研究治疗多发性硬化的药物具有显著的社会效益和经济效益。
[0004] 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以侵蚀性关节炎为主要表现的 全身性自身免疫病。我国大陆地区的RA患病率约为0.2%~0.4%。其主要结局是残疾，在类 风湿关节炎自然病程中，5-10年的致残率为60%，病程30年的致残率为90%。寿命缩短10-15年，而伴关节外表现者的5年生存率仅为50%，极大影响了患病人群的生活质量，常规治 疗本病虽有一定的疗效，但存在毒副作用多，如胃肠道反应、肝肾功能损伤、骨髓抑制、皮疹 等不良反应，患者依从性差。生物制剂虽疗效显著，但经济成本颇高，因此开发治疗类风湿 性关节炎的药物具有巨大的市场前景和社会价值。
[0005]查尔酮类化合物分子结构独特，含有多个反应中心，可以与多种受体结合，从而表 现出广泛的生物活性，是一类非常重要的有机合成及药物合成中间体。从天然产物中提取 分离以及通过化学、生物等方法合成的查尔酮类化合物，表现出抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗菌 和免疫调节等多种药理学性质，尤其在免疫调节方面对T、B淋巴细胞、巨噬细胞和抗原递程 细胞等具有广泛的调节作用，因此，查尔酮类化合物的研究与开发已成为药物化学的一个 热点研究领域。氮杂环化合物因其广泛的生物活性和较好的有机催化活性，一直颇受人们 的青睐。哌嗪作为含氮杂环体系中的重要一员，具有优良的生物活性和低毒性的特点，其环 上的N原子可以参与生物体中氢键的形成，增加药物与受体的亲和力和选择性，使该类化合 物在新药研发方面显示出越来越重要的作用。
[0006] 然而在免疫调节方面，单用查尔酮类化合物对免疫细胞缺乏特异性，目前查尔酮 类化合物对自身免疫性疾病动物模型缺乏深入评价，免疫调节和抗炎活性作用强度有限。 为进一步提高免疫调节和抗炎活性，我们采用亚结构拼接方法，再将查尔酮和哌嗪拼接，合 成一系列含有哌嗪的查尔酮类衍生物。经体外活性筛选及体内自身免疫性疾病动物模型评 价，首次发现含有哌嗪查尔酮类衍生物显著抑制T淋巴细胞的增殖功能和炎症因子的产生， 对风湿关节炎、多发性硬化等以T细胞反应为主自身免疫性疾病具有较好的治疗效果，使该 类化合物在制备自身免疫性疾病药物中具有较好的应用前景。
【发明内容】
：
[0007] 针对上述情况，本发明的发明目的是提供一种治疗自身免疫性疾病的药物及其制 备方法与应用。为解决本发明的技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0008] -种查尔酮衍生物的结构如式I所示：
[0009：
所述的式I中，R可以为4-二甲氨基、3-二 甲氨基、二甲氨基、4-二乙氨基、3-二乙氨基或2-二乙氨基。
[0010] 所述的查尔酮衍生物的制备方法为：取4-氟苯乙酮与对-二甲氨基苯甲醛或3-二 甲氨基苯甲醛或2-二甲氨基苯甲醛或对-二乙氨基苯甲醛或3-二乙氨基苯甲醛或2-二乙氨 基苯甲醛为原料，于反应容器中，加入乙醇和20 %Κ0Η，室温静置10-24小时；加水，抽滤，所 得固体依次用水和30%乙醇洗涤2次，干燥后得橙黄色固体;将上述固体和碳酸钾置于反应 容器中，加入六水合哌嗪和DMF，在120°C反应1-24小时;冷却后将反应物倒入水中，用DCM萃 取3次;有机相经无水硫酸钠干燥后浓缩，残余物经硅胶柱层析，以2 % CH30H/DCM为洗脱剂， 分离得到黄色固体，即为所述的查尔酮衍生物。
[0011] 所述的查尔酮衍生物的应用在于制备治疗自身免疫性疾病的免疫抑制药物或抗 炎药物的应用。
[0012]进一步地，所述的自身免疫性疾病为:多发性硬化症。
[0013] 进一步地，所述的自身免疫性疾病为:类风湿关节炎。
[0014] 进一步地，所述的自身免疫性疾病为:系统性红斑狼疮。
[0015] 有益效果：
[0016]本研究采用活性亚结构拼接的方法，形成含氟查尔酮衍生物，再将含氟查尔酮衍 生物与哌嗪片段连接起来，最后合成得到6个新的4'-(1_哌嗪基)查尔酮衍生物。基于体外 免疫活性和抗炎筛选及2个自身免疫性疾病(多发性硬化疾病动物模型和关节炎模型)为筛 选平台。首次发现这6个化合物具有显著的免疫抑制作用，显著降低多发性硬化症经典模 型-实验性自身免疫性脑脊髓膜炎的发病率，减少疾病临床评分。6个化合物口服给药显著 减少关节炎的临床评分。6个新的4 ' -(1-哌嗪基)查尔酮衍生物在治疗自身免疫性疾病(如： 多发性硬化、类风湿关节炎和系统性红斑狼疮等)显示出较好的药物开发前景。
【附图说明】
[0017] 图1:对实验性自身免疫脑脊髓炎小鼠模型发病率的影响
[0018] 图2:对实验性自身免疫脑脊髓炎小鼠模型临床神经障碍评分的影响
【具体实施方式】
[0019] 实施例1:制备方法
[0020] 4-二甲氨基-4'-(l-哌嗪基)查尔酮(结构式如下式Π ，简称化合物1)的合成方法 为:称取4-氟苯乙酮(2.76g，20mmo 1)和对-二甲氨基苯甲醛(3.28g，22mmo 1)于100mL圆底烧 瓶中，加入30mL乙醇和20mL 20 %Κ0Η，室温搅拌过夜。加入50mL水，抽滤，固体依次用50mL水 和50mL 30%乙醇-水洗涤2次，干燥后得橙黄色固体。将上述固体和5.48g(40mmol)碳酸钾 置于100mL圆底烧瓶中，加入5.8g(30mmo 1)六水合哌嗪和60mL DMF，在120°C反应过夜。冷却 后将反应物倒入150mL水中，DCM萃取(30mL X 3)。有机相经无水硫酸钠干燥后浓缩，残余物 经柱层析（以2%CH30H/DCM为洗脱剂)分离得到黄色固体即为4-二甲氨基-4'-(l-哌嗪基） 查尔酮，两步收率70%。波谱数据如下：
[0021]
[0022] 式II :4-二甲氨基-4二（1-呢嗪基）查尔酮化字结构式
[0023] Yellow solid ^HMlRUOOMHz，CDC13) δ: 8.01(d，J = 9.0Hz，2H)，7.80((1, J = 15.3Hz，lH)，7.56(d，J = 9.0Hz，2H)，7.41(d，J=15.6Hz，lH)，6.92(d，J = 9.0Hz，2H)，6.70 (d,J = 9.0Hz,2H) ,3.33(t,J = 4.8Hz,4H) ,3.01-3.04(m,10H,NCH2) ,2.12(s,lH) ；13C NMR (75MHz,CDC13)5 :188.3,154.2,151.8,144.1,130.3,130.1,129.1,123.0,116.8,113.6, 111.8,48.5,45.9,40.2；HRMS:m/z calcd for C2iH26N30(M+H)+336.2070,found 336.2072.
[0024] 3-二甲氨基-4 ' -(1 -哌嗪基)查尔酮(结构式如下式ΙΠ，简称化合物2)的合成方法 为：以4-氟苯乙酮和3-二甲氨基苯甲醛为原料，其余合成方法同4-二甲氨基哌嗪 基)查尔酮。
[0025]
12 式m : 3-二甲氨基-4' _(1-哌嗪基)查尔酮化学结构式 2 Yellow solid;m.p.l61 ~NMR(300MHz，CDCl3)S:8.00(d，J = 8.7Hz，2H)， 7.81(d,J=15.4Hz,lH) ,7.55(d,J = 9.0Hz,2H) ,7.43(d,J=15.4Hz,lH) ,7.02(s,lH), 6·74-6.83(m，3H)，3.31-3.39(m，4H)，3.00-3.06(m，4H)，3.02(s，6H)，2.ll(s，1H); 13C NMR (75MHz,CDC13)5:188.5,155.6,152.2,144.0,131.3,129.1,128.1,126.4,123.0,121.7, 116.8,112.9,111.6,48.5,45.7,40.3；HRMS:m/z calcd for C2iH26N30(M+H)+336.2070, found 336.2067.
[0028] 2-二甲氨基-4 ' -(1-哌嗪基)查尔酮(结构式如下式IV，简称化合物3)的合成方法 为：以4-氟苯乙酮和2-二甲氨基苯甲醛为原料，其余合成方法同4-二甲氨基哌嗪 基)查尔酮。
[0029]
[0030] 式IV: 2-二甲氨基-4 '_(1-哌嗪基)查尔酮化学结构式
[0031] Pale red solid;m.p. 165~167Γ 5^^^(30010^,0)(:13)6:7.98((1,1 = 8.4^, 2H) ,7.82(d,J=15.3Hz,lH),7.55(d,J = 8.7Hz,2H),7.42(d,J=15.4Hz,lH) ,7.13(d,J = 6.8Hz,lH),7.05-7.12(m,lH),6.77-6.88(m,2H),3.34(s,4H),3.03(s,4H),3.01(s,6H), 2.10(s，lH) ;13C 匪R(75MHz，CDC13)S :188.9,155.1,152.8,141.6,134.7,132.2,130.3, 126.8,126.2,123.1,121.7,116.8,112.9,111.5,48.8,45.9,40.2；HRMS:m/z calcd for C2iH26N30(M+H)+336.2070,found 336.2071.
[0032] 4-二乙氨基-4'-(l-哌嗪基)查尔酮(结构式如下式V，简称化合物4)合成方法为： 以4-氟苯乙酮和对-二乙氨基苯甲醛为原料，其余合成方法同4-二甲氨基-4'-(l-哌嗪基） 查尔酮。
[0033]
[0034] 式V:4-二乙氨基-4'-(l-哌嗪基)查尔酮化学结构式
[0035] Pale brown solid;m.p. 166~NMR(300MHz，CDCl3)S:8.01(d，J = 9.0Hz， 2H) ,7.86(d,J=15.3Hz,lH),7.57(d,J = 8.7Hz,2H),7.45(d,J=15.3Hz,lH) ,7.03(d,J = 8.7Hz,2H),6.82(d ,J = 9.0Hz,2H),3.37(t ,J = 4.7Hz,4H),3.34(t ,J = 4.8Hz,4H),3.05(t, J = 4.9Hz，4H) ,2. ll(s, 1H)，1.24(t，J = 6.8Hz，6H) ;13C NMR(75MHz，CDC13)S: 187.7,153.6， 140.1,134.1,130.3,126.0,122.4,120.8,116.8,112.9,111 .5,48.5,46.1,45.12,12.64; HRMS:m/z calcd for C23H29N30Na(M+Na)+386.2208,found 386.2209.
[0036] 3-二乙氨基-4 ' _(1-哌嗪基)查尔酮(结构式如下式VI，简称化合物5)合成方法为： 以4-氟苯乙酮和3-二乙氨基苯甲醛为原料，合成方法同4-二甲氨基-4'-(l-哌嗪基）查尔 酮。
[0037]
[0038] 式VI: 3-二乙氨基-4' _(1-哌嗪基)查尔酮化学结构式
[0039] Brown solid;m.p.l69~ΠΙΓ;1!! NMR(300MHz，CDCl3)S:7.98(d，J = 8.9Hz，2H)， 7.85(d,J=15.4Hz,lH) ,7.56(d,J = 8.7Hz,2H) ,7.44(d,J=15.3Hz,lH) ,7.11(d,J = 6.9Hz,lH) ,7.01-7.09(m,2H),6.84(t,J = 5.4Hz,lH) ,3.37(t,J = 4.9Hz,4H) ,3.34(t,J = 4·8Ηζ，4H)，3.06(t，J = 4.7Hz，4H) ,2.12(s，lH) ,1.25(t，J = 6.8Hz，6H) ;13C 匪R(75MHz, CDC13)δ :188.9,155.1,152.8,141.6,135.2,132.6,131.1,126.3,125.0,122.9,121.4, 116.8,111.8,48.7,45.9,45.16,12.65；HRMS:m/zcalcdforC23H 3〇N3ONa(M+H)+364.2389, found364.2391.
[0040] 2-二乙氨基-4'-(1-哌嗪基)查尔酮(结构式如下式W，简称化合物6)合成方法为： 以4-氟苯乙酮和2-二乙氨基苯甲醛为原料，合成方法同4-二甲氨基-4'-(l-哌嗪基）查尔 酮。
[0041]
[0042] 式W: 2-二乙氨基-4' _(1-哌嗪基)查尔酮化学结构式
[0043] Pale yellow solid;m.p.l67~匪R(300MHz，CDCl3)S:7.99(d，J = 8·7Ηζ，2Η)，7.84(d，J=15.4Hz，lH)，7.56(d，J = 8.7Hz，2H)，7.42(d，J=15.4Hz，lH)，7.13 (d，J = 6 · 7Hz，1H)，7 · 07(t，J = 5 · 3Hz，1Η)，6· 74-6.82(m，2H)，3.36(t，J = 4.8Hz，4H) ,3.34 (t，J = 4.8Hz，4H)，3.05(t，J = 4.7Hz，4H)，2.12(s，lH)，1.23(t，J = 6.9Hz，6H) ;13C 匪R (75MHz,CDC13)5 :188.9,155.1,152.8,141.6,134.7,132.2,130.3,126.8,126.2,123.1, 121.7，116.8，112.9，111.5,48.8,46.0,45.14，12.63;HRMS:m/z calcd for C23H29N3ONa(M+ Na)+386.2208,found 386.2210.
[0044] 实施例2:体外免疫活性筛选
[0045] 1.建立筛选模型
[0046] BALB/C小鼠脾脏淋巴细胞在有丝分裂原ConA的刺激下，细胞的形态和代谢可发生 一系列的变化，转化为母细胞，并分化增殖。本实验加入ConA (刀豆蛋白A) 5μg/ml诱导T淋巴 细胞增殖。以MTT法定量测定细胞的增殖。活细胞内线粒体脱氢酶能将MTT有黄色还原成蓝 色的甲肷，甲肷产量与活细胞成正比。用有机溶剂溶解后，可用酶标仪检测0D值。
[0047]结果评定：淋巴细胞的增殖采用被测样品0D值减对照孔0D值，除对照孔0D值乘 以％〇
[0048] 百分比前有负号表示此样品对T细胞有抑制作用。
[0049] 百分比前没有负号表示此样品对T细胞有增强作用。
[0050]淋巴细胞毒性的判断"有"，"无"，在无细胞毒的情况下，T淋巴细胞的增强/抑制百 分比在±15%以上，就表示有作用。
[0051 ] 2.体外免疫活性筛选的结果
[0052]实验结果如下表1中所示:6个4'-(1_哌嗪基)查尔酮衍生物浓度依赖性抑制丝裂 原ConA诱导的T淋巴细胞增殖，体外显示出对T淋巴细胞有较好的免疫抑制效应。
[0053] 表1.查尔酮衍生物对丝裂原ConA诱导的T淋巴细胞增殖功能的影响(mean 土 SD，η =3)
[0054]
[0056] a'_'表明样品有抑制活性，彡15%显示样品是有作用； 1 b表明细胞毒性实验；
[0058] e表明丝裂原ConA诱导T淋巴细胞增殖实验；
[0059]实施例3:体外抗炎活性筛选 [0060] 1.建立筛选模型
[00611 小鼠巨噬细胞株Raw 264.7细胞购自美国细胞库（41'(：0，培养于含10%?83的 RPMI-1640培养液中。Raw264.7细胞（1X105个/孔)接种于24孔板，同时加入不同浓度的本 发明所得的查尔酮衍生物，在lμg/ml LPS刺激作用下培养24h，另设溶剂对照及无刺激剂本 底对照。离心收集培养上清(5000rpm，4°C，5min)，采用Griess法检测上清中N(V的含量。
[0062] 表2.查尔酮衍生物抗炎活性筛选结果
[0063]
[0064]抗炎活性筛选结果如表2所示，6个查尔酮衍生物显著抑制LPS诱导巨噬细胞 RAW264.7炎症因子N0,体外显示出良好的抗炎活性。
[0065]实施例4:实验性自身免疫脑脊髓炎模型的建立及药物干预 [0066] 1.实验性自身免疫脑脊髓炎建模
[0067]将髓磷脂少突细胞糖蛋白35-55肽段(缩写为:MOG35-55)(2mg/ml)，用PBS配置相应 浓度，与等体积CFA(含4mg/ml H37Ra)用玻璃注射器充分乳化，用异氟醚麻醉小鼠，分三点 给小鼠注射乳化液，背部两肩正中、后背部中心两侧各50μ1，最终每只小鼠皮下注射MOG 35-55 和H37Ra分别150yg和300yg。同时在第0和第2天每只小鼠腹腔注射400yg PTX。模型制备后， 按体重随机分为EAE模型组和6个化合物给药组(20mg/kg)，每天给药1次。EAE的疾病评分采 用5分制。评分标准如下:0分，没有明显疾病症状；1尾巴张力消失或后肢无力；2分，尾巴张 力消失和后肢无力；3分，后肢部分瘫痪;4分，后肢完全瘫痪;5分，濒死状态或者死亡。免疫 后记录小鼠状态和疾病评分，并且每天称体重。
[0068] 2.药物干预的结果
[0069] 结果如说明书附图1、图2所示，与EAE(实验性自身免疫性脑脊髓膜炎）模型组比 较，4'-(1_哌嗪基)查尔酮衍生物(20mg/kg)给药显著降低疾病的发病率，减少神经障碍评 分，显示出对多发性硬化病的治疗效果。
[0070] 实施例5:胶原关节炎模型的建立及药物干预
[0071] 1.建模
[0072] 牛II型胶原加入0.1M的醋酸，浓度10mg/ml，提前4天4°C冰箱溶解，胶原与等体积 的弗氏完全佐剂充分乳化，待雄性DBA/1小鼠麻醉后，于其尾根部进行致敏，每只50μ1/只，3 周后以相同剂量进行再次免疫攻击，肉眼观察小鼠四肢，对关节炎的严重程度进行0-4级评 分，每组小鼠四肢评分总和除以小鼠只数，取平均值作为临床评分。[0-4级评分系统:0 =正 常；1 = 一个或多个趾关节红或红肿；2 =踝关节以下中度红肿；3 =包括膝关节在内的严重 红肿;4 =包括膝关节在内的完全红肿，关节变形、残废。每只小鼠最多评分为16分]。第0天 即为攻击当天。模型制备后，按临床评分随机分为CIA模型组和6个化合物给药组（20mg/ kg)，每天给药1次。
[0073] 2.药物干预结果
[0074]结果见表3所示：与关节炎模型组比较，4'-(1_哌嗪基）查尔酮衍生物口服(20mg/ kg)显著降低DBA/1小鼠胶原关节炎的临床评分，显示出对关节炎的治疗效果。
[0075] 表3对胶原关节炎小鼠临床评分的影响(mean土SD，n = 8)
[0076]
【主权项】
1. 一种查尔酮衍生物，其特征在于:化合物的结构如式I所示：沂述的式I中，R可以为4-二甲氨基、3-二甲氨 基、2_二甲氛基、4_二乙氛基、3_二乙氛基或2_二乙氛基。2. -种如权利要求1所述的查尔酮衍生物的制备方法，其特征在于：取4-氟苯乙酮与 对-二甲氨基苯甲醛或3_二甲氨基苯甲醛或2-二甲氨基苯甲醛或对-二乙氨基苯甲醛或3-二乙氨基苯甲醛或2-二乙氨基苯甲醛为原料，于反应容器中，加入乙醇和20%K0H，室温静 置10-24小时;加水，抽滤，所得固体依次用水和30%乙醇洗涤2次，干燥后得橙黄色固体;将 上述固体和碳酸钾置于反应容器中，加入六水合哌嗪和DMF，在120°C反应1-24小时;冷却后 将反应物倒入水中，用DCM萃取3次;有机相经无水硫酸钠干燥后浓缩，残余物经硅胶柱层 析，以2%CH 3OH/DCM为洗脱剂，分离得到黄色固体，即为所述的查尔酮衍生物。3. -种如权利要求1、2所述的查尔酮衍生物的应用，其特征在于制备治疗自身免疫性 疾病的免疫抑制药物或抗炎药物的应用。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的自身免疫性疾病为:多发性硬化症。5. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的自身免疫性疾病为:类风湿关节炎。6. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的自身免疫性疾病为:系统性红斑狼疮。
【文档编号】A61P37/06GK106008400SQ201610382524
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】万春平, 毛泽伟, 郑喜, 祁燕, 李小丝
【申请人】云南省中医医院