专利名称：查尔酮酸类化合物及其制法和作为药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防和治疗恶性肿瘤的查尔酮酸类化合物，还涉及其制备方法和作为药物的用途。
维生素甲酸及其类似物可用于预防和治疗恶性肿瘤，治疗痤疮、牛皮癣以及其它皮肤疾病。作为药物可全身或局部应用给药。德国专利No.3434948和No.3434942、欧洲专利No.2210118以及H.Kagechika等在J.Med.Chem.1988，312182-2192报导了在芳香环上有乙烯基、酰胺键、偶氮键、烯酮键等取代的芳香羧酸或羧酸衍生物具有诱导细胞分化和预防或治疗皮肤疾病的作用。而且，在欧洲专利No.212848和211548以及Shudo等在Chem.Pharm.Bull.1986，34121中叙述了具有二-叔丁基苯基结构的化合物，它们对哮喘、过敏性疾病和牛皮癣等有治疗作用。
然而，迄今报导的具有诱导细胞分化作用的化合物都显示有维生素甲过高症，毒性较强，因而限制了临床的应用。
本发明的目的是提供一类比以前的化合物有更优良的抗肿瘤作用和诱导分化作用的新化合物。
本发明涉及具有式1结构的查尔酮酸类化合物及其盐类
式中R1和R2相同或不同，代表氢原子或碳原子数为1-5的烷基。
本发明中的烷基可以是直链的或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基等。此外，本发明化合物的盐系指药理学上可接受的盐类，例如钾、钠、镁、铵等无机碱盐，以及三乙胺等有机碱盐。
本发明的化合物是由式2表示的苯乙酮酸衍生物与式3所示的甲酰基苯甲酸衍生物在氢氧化钠存在下经缩合反应制备的
式中R1和R2的定义同前所述。
本发明的化合物的给药途径例如可非经口用药或经口用药。非经口用药的剂型可以是注射剂，经口给药的剂型例如是片剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、悬浮剂等中的一种剂型。所用的剂型可根据患者的症状、年龄、和治疗目的加以选择。常用的赋形剂例如有结晶纤维素、淀粉、乳糖、甘露糖醇等;结合剂例如有羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等;润滑剂例如有硬脂酸镁、滑石粉等;崩解剂例如有羧甲基纤维素钙等。这些制剂可用一般常规的方法制备。
成人的用药剂量范围每日为0.1-500mg，可一次或分三次给药。给药剂量可根据患者的年龄、体重和症状作适当的增减。
附图的简要说明如下
图1为全反式维甲酸及本发明的查尔酮类化合物对小鼠HL-60细胞及骨髓细胞(CFU-GM)的作用。
图2为全反式维甲酸及本发明的查尔酮类化合物分别对人肝癌Bel-7402细胞甲胎蛋白分泌量的影响。
图3为全反式维甲酸及本发明的查尔酮类化合物分别对人肝癌Bel-7402细胞白蛋白分泌量的影响。
图4为全反式维甲酸及本发明的查尔酮类化合物分别对人肝癌Bel-7402细胞γ-谷氨转肽酶活性的影响。
以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
下述实施例中，所用化学试剂均购自北京化学试剂厂、Aldrich及Fluka公司，所有使用的药理学实验用试剂购自SIGMA和GIDCO公司，分子生物学用载体除PST72载体购自PROMAGA公司外，其余均为法国Chambon教授赠送。所用的细胞流速光度计之型号为PATAXⅡ型，核磁共振仪为JEOLFX-90Q型，质谱仪为ZAB-2F型。
实施例14-[3-(3，5-二叔丁基-4-羟基苯基)-3-氧代-1-丙烯基]苯甲酸的制备3，5-二叔丁基-4-羟基苯基乙酮4.5g(18.3mmol)和4-甲酰基苯甲酸甲酯3.0g(18.3mmol)溶解于无水甲醇100ml中，加入干燥的粉状氢氧化钠6.0g，搅拌加热回流10小时。反应液冷却后，加入氢氧化钠2.0g于20ml水的溶液，搅拌加热回流2小时。反应液冷却后，用盐酸调节pH5-6，减压蒸除甲醇，剩余物中加水100ml，搅拌10分钟，滤集固体，干燥后用乙醇结晶，得本标题化合物4.5g，为淡黄色结晶，mp.222-224℃。
元素分析 C24H28O4＝380.46计算值(%)C75.75，H7.42实测值(%)C75.73，H7.381H-NMR(DMSO-d6) δppm1.42(s，18H，t-Bu)，7.52-8.00(m，Ar-H)MSm/e380(M+，30)，365(M+-CH3，100)，233(6)
IR (KBr)ν(cm-1)3620，2969，1780，1755，1605，1570，1420，1320，1290，1210，845，780实施例24-[3-(3，5-二叔丁基-4-甲氧基苯基)-3-氧代-1-丙烯基]苯甲酸的制备3，5-二叔丁基-4-甲氧基苯基乙酮3.0g(11.0mmol)和4-甲酰基苯甲酸甲酯1.88g(11.0mmol)溶解于无水甲醇40ml中，加入20%氢氧化钠水溶液5ml，室温搅拌4小时后，放置过夜。反应液中加入水10ml，室温搅拌过夜，用盐酸调节pH7，减压蒸除大部分甲醇，再加入盐酸使pH2-3，滤集析出的固体，干燥后用乙醇结晶，得本标题化合物3.8g，mp.192-194℃。
元素分析 C25H30NO4＝394.49计算值(%)C76.11，H7.67实测值(%)C75.75，H7.59MSm/e394(M+，10)，378(12)，261(50)，247(100)，149(99)实施例32-[3-(3，5-二叔丁基-4-羟基苯基)-3-氧代-1-丙烯基]苯甲酸的制备3，5-二叔丁基-4-羟基苯基乙酮0.65g(2.62mmol)和2-甲酰基苯甲酸甲酯0.43g(2.62mmol)按照与实施例1相似的方法得本标题化合物粗产品0.89g，乙醇结晶得黄色结晶0.72g，mp.105-106℃。
元素分析 C24H28O4＝380.46计算值(%)C75.75，H7.42实测值(%)C75.60，H6.931H-NMR(DMSO-d6) δppm1.40(s，18H，t-Bu)，5.38，6.06(m，2H，CH＝CH)7.68(m，6H，Ar-H)MSm/e380(M+，67)，233(100)IR (KBr)ν(cm-1)3590，2960，2910，1760，1660，1585，1420，1350，1230，880，780，745实施例4对人癌细胞的增殖抑制作用将对数生长期的细胞按12000个/毫升接种于96孔板中，次日弃培养基，换含不同浓度的实施例2制备的化合物及相应溶剂对照的培养基，每组平行3-6孔，于37℃继续培养4-5天后，弃上清。每组加200μl新鲜配制的含0.2mg/ml和MTT无血清培养基，继续培养4hr。轻轻弃上清，加200μl DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型超声振荡器振荡混匀。于MR700型酶标仪上，测定570nm处的光密度值。按下式计算细胞存活率，并计算IC50。结果见表1。
肿瘤细胞存活率＝ (实验孔测定值)/(对照孔测定值) ×100%表1IC50mol/L×10-6人卵巢癌A27805.57人肝癌Bel-74025.79人食管癌CaEs-172.42人巨细胞肺癌PLA-8014.29人巨细胞肺癌PLA-801D3.94人口腔癌KB4.40人结肠癌HCT-86.45人口腔癌耐长春新碱KB/VAR200*4.36人结肠癌耐长春新碱HCT-8/VCR2000*1.05＊多药耐药细胞实施例5对大鼠软骨肉瘤的抑制作用无菌条件下取生长良好的肿瘤，剪碎，按1∶3稀释，用16＃针头接种于60-80gWistar大鼠腋下，0.3ml/只，次日随机分组，每组10只，隔日1次灌胃给药(实施例2制备的化合物)，共给药四次。45天后处死动物，称体重、瘤重，结果以抑瘤率来评价。结果见表2。
抑瘤率＝ (对照组瘤重-实验组瘤重)/(对照组瘤重) ×100%表2给药量(mg/Kg)抑瘤率(%)0.6×495.5***1.2×499.3***＊＊＊P＜0.01实施例6对小鼠肉瘤S180的抑制作用无菌条件下取生长良好的肿瘤，剪碎，按1∶3稀释，接种于ICR小鼠腋下，0.2ml/只，次日随机分组，每组10只，隔日1次灌胃给药，共给药三次(实施例2制备的化合物)。十天后处死动物，称体重、瘤重，结果以抑瘤率来评价。结果见表3。
表3给药量(mg/Kg)抑瘤率(%)11.8×336.5***5.9×332.6***
实施例7对小鼠黑色素瘤B16的抑制作用无菌条件下取生长良好的肿瘤，剪碎，按1∶3稀释，接种于C57BL/6小鼠腋下，0.2ml/只，次日随机分组，每组10只，灌胃给药(实施例2制备的化合物)，隔日一次，共给药三次。十天后处死动物，称体重、瘤重，结果以抑瘤率来评价。结果见表4。
表4给药量(mg/Kg)抑瘤率(%)1×320.9*5×358.9**＊P＞0.05;＊＊P＜0.01实施例8对小鼠Lewis肺癌的抑制作用无菌条件下取生长良好的肿瘤，剪碎，按1∶3稀释，接种于C57BL/6小鼠腋下，0.2ml/只。次日随机分组，每组10只，灌胃给药(实施例2制备的化合物)，隔日一次。十天后处死动物，称体重、瘤重，结果以抑瘤率来评价。结果见表5。
表5给药量(mg/Kg)抑瘤率(%)2×325.5*4×351***6×365***实施例9选择性作用观察HL-60细胞克隆形成率采用双层软琼脂培养法。在31mm平皿中，加入不同浓度的药物(分别为全反式维甲酸和实施例2制备的化合物)和相应溶剂后，加含0.5%琼脂及20%小牛血清的RPNI1640底层培养基。上层加含0.3%琼脂及1000个活细胞的RPNI1640培养基。置37℃、5%CO2及一定湿度的温箱中培养10-14天。在16×解剖镜下计数集落数，每组平行三皿。
小鼠骨髓细胞CFU-GM测定无菌条件下取小鼠股骨，取出骨髓并制成单个细胞，计有核细胞数。在含35%马血清的Fischer's培养基中，加1%L-glutamin制成强化Fischer's液。于31mm平皿底部加不同浓度受试药物(分别为全反式维甲酸和实施例2制备的化合物)及相应溶剂后，加含0.5%琼脂、1%条件培养基的强化Fischer's液，制成底层培养基。上层加含0.3%琼脂及6.6×104的有核细胞的强化Fischer's液，置37℃、5%CO2及饱和湿度的培养盒中培养10-14天。在16×解剖镜下计数集落数，每组平行三皿。见图1。
实施例10对HL-60细胞的分化诱导作用将全反式维甲酸与本发明药物(实施例2制备的化合物)作用一定时间的细胞和对照组细胞，在4℃条件下1000rpm离心5min，弃上清，每管加入含0.1%NBT、200ng/mlTPA的生理盐水0.5ml，置37℃水浴中保温1hr。1000rpm离心5hr，取细胞沉淀涂片。Wright-Giemsa染色、油镜下每玻片观察200个细胞，计算NBT阳性的细胞数。
结果本发明药物的分化诱导作用与全反式维甲酸相仿，10-6mol/L作用6天，可使NBT阳性率达90%左右，EC50在5.8×10-9mol/L。
实施例11对NB4细胞的分化诱导作用将药物(分别为全反式维甲酸和实施例2制备的化合物)作用一定时间的细胞和对照组细胞，在4℃条件下1000rpm离心5min，弃上清，每管加入含0.1%NBT、200ng/mlTPA的生理盐水0.5ml，置37℃水浴中保温1hr。1000rpm离心5hr，取细胞沉淀涂片。Wright-Giemsa染色、油镜下每玻片观察200个细胞，计算NBT阳性的细胞数。
结果本发明化合物的EC50为3.9×10-9mol/L，全反式维甲酸为2.8×10-9mol/L。
实施例12对人肝癌Bel-7402的癌分化诱导作用甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)分泌量的测定取对数生长期的肝癌细胞，计数制成1×108/ml，接种于20ml培养瓶中，次日加药(分别为全反式维甲酸和实施例2制备的化合物)，对照组加相应溶剂。继续培养一定时间后，收集上清液。冷冻干燥后，溶于PBS中。采用放射免疫法，按AFP和ALB试剂盒方法测定AFP和ALB的含量。细胞用0.1%胰酶消化后，按胎盼蓝排斥法计数活细胞数。AFP和ABL结果换算为ng/107。结果见图2、3。
γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)活性测定将给药物(分别为全反式维甲酸和实施例2制备的化合物)处理一定时间的细胞和对照细胞，用PBS洗两次后，再用Policeman刮下。离心后，将细胞在0.05M Tris.HCl缓冲液中超声粉碎，制成匀浆。1000×g离心8min，取上清测γ-GT活力。γ-GT活力测定取制好的细胞上清50μl加入到37℃预热的0.25ml基质缓冲液(10μmol/ml、γ谷氨酰-α 胺硼酸缓冲液pH9.0)，37℃温浴1hr，加入50μl重氮试剂(0.29氨基苯磺酸、0.1%亚硝酸钠24∶1)混匀。对照管加50μl细胞上清、重氮试剂、基质缓冲液0.25ml混匀。室温放置10分钟后，在520nm波长下测光密度值，以对照管调零。根据α 胺标准曲线测α 胺释放量。结果换算为每小时每mg蛋白释放α- 胺的nmol数。结果见图4。
权利要求
1.由式1表示的查尔酮酸类化合物及其盐 式中R1和R2相同或不同，代表氢原子或碳原子数为1-5的烷基。
2.如权利要求1所述的化合物及其盐，其特征是所述的化合物是4-[3-(3，5-二叔丁基-4-羟基苯基)-3-氧代-1-丙烯基]苯甲酸。
3.如权利要求1所述的化合物及其盐，其特征是所述的化合物是4-[3-(3，5-二叔丁基-4-甲氧基苯基)-3-氧代-1-丙烯基]苯甲酸。
4.如权利要求1所述的化合物及其盐，其特征是所述的化合物是2-[3-(3，5-二叔丁基-4-羟基苯基)-3-氧代-1-丙烯基]苯甲酸。
5.一种制备如权利要求1所述的查尔酮类化合物及其盐的方法，包括将由式2表示的苯乙酮酸衍生物与由式3表示的甲酰基苯甲酸衍生物在氢氧化钠存在下的缩合反应 式中，R1，R2具有与前述相同的定义。
6.如权利要求1所述的查尔酮酸类化合物及其盐在制备对肿瘤细胞具有诱导分化作用的药物中的应用。
全文摘要
由式1表示的查尔酮酸类化合物及其盐式中R
文档编号C07C69/76GK1113909SQ9411945
公开日1995年12月27日 申请日期1994年12月16日 优先权日1994年12月16日
发明者郭宗儒, 韩锐, 褚凤鸣, 何晓庆, 夏丽娟, 龟尾一弥, 中池司郎 申请人:中国医学科学院药物研究所, 大正制药株式会社