专利名称：集落刺激因子的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种集落刺激因子的制备方法，尤其是本发明涉及一种采用悬浮式细胞培养和层析技术制备含有多种活性成分的集落刺激因子的方法。
临床上白细胞减少和功能低下症，主要见于各种肿瘤病人因药物化疗和射线放疗所致的骨髓造血功能抑制，骨髓移植和器官移植病人大剂量使用免疫抑制剂，治疗方法主要采用血液成分输血等综合手段。从70年代末至今，国外学者纷纷致力于研究开发治疗白细胞减少症的特效药物，先后从小鼠等动物和人体组织中分离具有集落刺激因子活性的生物物质。现已能采用基因重组技术生产多种集落刺激因子，并进入治疗应用研究阶段。集落刺激因子的药用研究表明;为了恢复正常造血，常需设计与体内环境相适应的多种细胞因子联合应用的程序。现已用于临床的粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF，粒细胞集落刺激因子G-CSF等均为基因重组技术生产的单一特定的CSF。其临床疗效不如多种细胞因子的联合用药，并常有发热、过敏反应等副作用，而在其生产工艺方法，为获得高比活性的集落刺激因子，常采用高效液相层析或电泳等技术手段，使得集落刺激因子回收率大大降低(1.4-14%)，并常丢失原料中的其它生物活性组分。
为了解决上述现有技术上存在的问题，本发明人经过长期深入的研究，发明了一种新的制备方法，用该方法制备的集落刺激因子含有多种生物活性成份，回收率高，生产工艺简单，解决了现有技术中存在的问题，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种集落刺激因子的制备方法，该方法采用悬浮式细胞培养和层析技术，生产工艺简便，回收率高，可达45-50%。制备的集落刺激因子产品含有多种生物活性物质。
在本发明的方法中，采用人体组织为原料，所述的人体组织包括例如健康血员外周血(来源于血库);或无脑新生儿或引产胎儿胸腺和/或脾脏等(来源于医院的计划生育手术室)。在体外诱导培养条件下，诱生并分离集落刺激因子产品，也可称为利白素(leupo)。在本发明的方法中，体外诱导培养特别相似于人机体处于应激状态下内环境，收获的产品为人源性纯天然生物制品，含有多种生物活性组分，其副反应大大低于基因重组产品，能显著改善药物化疗等所致的骨髓造血功能抑制，减轻药物对骨髓的毒性反应，提高白细胞总数和中性粒细胞计数，增加中性粒细胞活性氧生产能力，超化活性和吞噬杀菌能力。改善贫血和增加血小板计数，促进造血干细胞集落形成。
因此，本发明的方法的特征在于，在无菌条件下，将人体组织制成细胞悬浮液;在含有诱导剂的培养基中将细胞悬浮液进行体外诱导和悬浮培养制成培养液，诱导和培养的条件为CO2浓度5-10%(体积)，温度94-96%，温度36.5-37.5℃，在恒温下培养3-7日;将所述培养液相继进行超滤浓缩，盐析，透析，得到蛋白溶液a;用阴离子交换树脂将蛋白溶液a进行离子交换层析，获得蛋白溶液b;将蛋白溶液b用伴刀豆蛋白A-琼脂糖凝胶进行亲和层析，得到蛋白溶液C;将蛋白溶液C用透析袋透析，截留分子量大于10000道尔顿，得到含有多种活性成份的集落刺激因子。
在本发明的方法中，人体组织包括例如健康血员外周血(来源于血站或血库)，无脑新生儿或引产胎儿胸腺和/或脾脏等(来源于医院计划生育手术室)。
本发明方法的具体实施步骤如下一、人外周血白细胞及无脑新生儿或引产胎儿胸腺和/或脾脏细胞悬浮液制备1、外周血白细胞悬浮液制备在中心血站或医院血库，选择符合标准的健康献血员，按下述方法制备白细胞(1)血液成分自动分离器单采法。
(2)沉降单采法。
可参见《输血技术手册》肖星甫主编，四川科技出版社，1992，178页，《临床血液学》沈迪主编，人民卫生出版社，1991，896页。
2、无脑新生儿或引产胎儿脾脏和/或胸腺细胞悬浮液制备在无菌条件下摘取无脑新生儿或引产胎儿的胸腺和/或脾脏，撕碎后经100目不锈钢丝网揉擦过滤。收集过滤的细胞，加入Hank′s溶液，离心(大约1000-3000转/分，5-20分钟)后，弃去上清液，沉淀细胞用RPMI-1640培养基制成单个细胞悬浮液。
二、细胞体外诱导和悬浮培养用上述方法获得的白细胞或胸腺和/或脾脏细胞，经锥兰染色确定细胞活性≥70%，用选自下述之一的培养基悬浮培养RPMI-1640，改良伊格培养基MEM，D-改良伊格培养基DMEM(此三种均为美国的Gibco公司生产)，三种均为完全培养基;添加组分及浓度范围为HEPES25-50mM，谷氨酰胺2-10mM，毒霉素100-200μg/ml，链霉素100-200μg/ml，以及包括下述组分及含量的诱导剂氯化锂1-10mM，植物血凝集-P 1-10μg/ml，脂多糖0.1-1μg/ml，AB+型人血清2-5%(重量)，PH值为7.2-7.6。其中mM为毫摩尔，M为摩尔，上文或下文中也都如此表示，除非另有说明。
用上述完全培养基调整白细胞浓度至3-5×106/ml，胸腺和/或/脾脏细胞浓度1.5-3×106/ml，在无菌条件下灌装培养瓶，在温度36.5-37.5℃，CO2浓度5-10%(体积)，温度94-96%条件下恒温诱导和培养3-7日。
三、超滤浓缩及盐析、透析收集上述细胞培养液，经纱布过滤，离心(大约9000转/分，大约10-30分钟)，上清液经超滤器超滤浓缩15至30倍，超滤膜截留的分子量范围为10000至50000道尔顿，超滤器如德国产SarterieusⅡ型超滤器，在室温下加入硫酸铵至大约75-90%饱和度，置1-5℃下轻轻搅拌过夜，次日离心(大约3000转/分，大约10-30分钟)，弃上清液，沉淀蛋白的浓度为500-600克/升，沉淀蛋白用无热源蒸馏水溶解后装入透析袋至1/2-1/3体积(透析膜截留的分子量大于10000道尔顿)，用无热源蒸馏水透析至无NH4+，再用缓冲溶液A透析过夜，得到蛋白溶液a，其中缓冲溶液A是0.01M三羟甲基氨基甲烷·盐酸，PH值为7.4，含0.01%(重量)聚乙二醇(其分子量为6000)，0.02%(重量)的叠氮钠。
四、二乙基氨基乙基-琼脂糖凝胶离子交换层析二乙基氨基乙基-琼脂糖凝胶DEAE-Sepharose按产品说明书活化、消毒处理后装填层析柱，用缓冲液A平衡之，上述透析后的蛋白液a用缓冲液A洗柱至紫外监测仪基线(OD280nm)平稳。然后用缓冲液A补充氯化钠至0.25M，进行洗脱、收集洗脱下的蛋白溶液，得到蛋白溶液b。
五、伴刀豆蛋白A-琼脂糖凝胶亲和层析伴刀豆蛋白A-琼脂糖凝胶ConA-Sepharose按产品说明书活化，消毒处理后装填层析柱用缓冲液B(缓冲液A补充氯化钙1mM，氯化镁1mM，氯化锰1mM，氯化钠0.5M，PH7.4)平衡之。上样DEAE-Sepharose洗脱蛋白液，用缓冲液B洗柱至紫外监测仪基线(OD280nm)平稳。然后用缓冲液B补充)α-甲基-D-甘露糖苷0.2M进行洗脱，收集洗脱下的蛋白溶液，得到蛋白溶液C，将蛋白溶液C装入透析袋，截留的分子量在10000至50000道尔顿之间，用无热源蒸馏水透析24-48小时，得到产物，测定它是一组糖基化蛋白或多肽，含有GM-CSF，G-CSF，IL-1，IL-3，IL-6，EGF等多种细胞活性因子。
将上述产物在干燥箱中于冷冻条件下干燥，到基本干燥即可，冷冻的条件为温度为0℃-60℃，时间为5-100小时，压力为0.01-0.1托。由此得到蛋白制品。
为制备含有本发明所述的药物组分，可将经上述分离提纯的蛋白制品，与适当的无活性且宜于制成药物之载体相混合，适合的载体通常采用适于静脉注射的D-甘露糖，在适宜浓度下(3-5%W)与蛋白制品混合，正压过滤除菌后，冰冻干燥。
为了确定集落刺激因子活性，将纯系BALB/C小鼠骨髓细胞制备成单细胞悬液。单个细胞可固相化于含胎牛血清的琼脂半固体培养基中。当存在有适当集落刺激因子时，单个细胞便会增殖分化，形成和发展集落，可在显微镜下计数集落，并可提出单个集落进行染色观察(参见Burgess，A.W.Nice E.C酶学方法.第116卷，学术出版社.奥兰多(1985).和Burgess.A.W生长因子和干细胞 科学出版社，纽约(1984))。
用下述表1-2，
图1-5说明本发明产品的特性。
一、集落刺激因子对环磷酰胺介导的小鼠白细胞减少症外周血白细胞计数(图1)和分类计数(图2)的效应。
二、集落刺激因子对环磷酰胺介导的小鼠骨髓造血功能抑制的重建效应(图3)三、集落刺激因子对环磷酰胺注射小鼠体重和存活率的影响(表1)四、集落刺激因子对小鼠和人骨髓干细胞体外生长和分化的刺激效应(表2)五、集落刺激因子凝胶电泳和凝胶过滤色谱的分子量分布(图4)六、本发明得到的制品(利白素)与G-CSF对小白鼠的治疗对照(图5)在进行本发明的方法中，对仪器和材料要求1、一切与制品的接触的工具，器皿等不污染热原2、用于体外诱导培养的细胞活性≥70%3、生产所用各种化学药品不低于分析纯级，符合药典规定下述实施例用于说明本发明，而无限制其范围的作用。
实施例1用血液成分自动分离器单采法或沉降单采法将人外周血制成白细胞悬浮液，经锥兰染色确定细胞活性大于70%，用完全培养基调整白细胞浓度至4×106/ml，所述的完全培养基是以RPML-1640为基料，还含有HEPES30mM，谷氨酰胺6mM，青霉素150μg/ml，链霉素130μg/ml，以及含下述组分的诱导剂氯化锂5mM，植物血凝集-P5g/ml，脂多糖0.5μg/ml，AB+型人血清3%(重量)，完全培养基的PH值为7.4。在无菌条件下装入培养瓶，在温度为37.2℃，CO2浓度6%(体积)，温度95%条件下恒温诱导培养5天。收集上述细胞培养液，经4层纱布过滤，离心(9000转/分，大约15分钟)，上清液经超滤器超滤浓缩20倍。超滤膜截留的分子量范围为10000-50000道尔顿，加入硫酸铵至80%饱和度，置4℃下轻轻搅拌过夜(大约12小时)。次日离心(3000转/分，15分钟)，弃上清液，沉淀蛋白的浓度为561克/升(80%饱和度)，用无热源蒸馏水溶解沉淀的蛋白之后装入透析袋1/2-1/3体积(透析膜截留的分子量为大于10000道尔顿)，用无热源蒸馏水透析至无NH4+，再用缓冲溶液A透析过夜，得到蛋白溶液a，其中缓冲溶液A为0.01M三羟甲基氨基甲烷·盐酸，PH值为7.4，其中含有0.01%(重量)聚乙二醇(其分子量为6000)和0.02%(重量)叠氮钠。
二乙基氨基乙基-琼脂糖凝胶(DEAE-Sepharose)按产品说明书活化，消毒处理后填装层析柱，用缓冲溶液A平衡之，上述透析后的蛋白溶液a用缓冲溶液A洗柱至紫外监测仪基线(OD280nm)平稳，然后用缓冲液A补充氯化钠至0.25M进行洗脱，收集洗脱下的蛋白溶液，得到蛋白溶液b。
伴刀豆蛋白A-琼脂糖凝胶(ConA-Sepharose)按产品说明书活化，消毒处理后装填层析柱用缓冲溶液B平衡之，缓冲液B是缓冲液A补充氯化钙1mM，氯化镁1mM，氯化锰1mM，氯化钠0.5M，PH值为7.4。上述洗脱的蛋白液用缓冲液B洗柱至紫外监测仪基线(OD280nm)平稳，然后用缓冲液B补充α-甲基-D-甘露糖苷0.2M进行洗脱，收集洗脱下的蛋白溶液，得到蛋白溶液C。将蛋白溶液C装入透析袋，截面的分子量在10000至50000道尔顿范围内，用无热源蒸馏水透析40小时，测定它是一组糖基化蛋白或多肽，含有GM-CSF，G-CSF，IL-1，IL-3，IL-6，EGF等多种细胞活性因子。
实施例2制备过程和操作条件相同于实施例1，不同的是使用胸腺和/或脾脏细胞，细胞浓度为2.3×106/ml，培养是改良伊格培养基MEM，最终所得结果相同于实施例1。
以上对本发明的方法进行了详细的说明，本领域熟练技术人员可根据本发明的构思对其进行适当的变化或改变，这都未超出本发明的范围。
权利要求
1.一种制备含多种活性成分的集落刺激因子的方法，其特征在于，在无菌条件下将人体组织制成细胞悬浮液；在含有诱导剂的培养基中将细胞悬浮液进行体外诱导和悬浮培养，制成培养液；诱导和培养的条件为CO2浓度5-10%(体积)，湿度94-96%，温度36.5-37.5℃，在恒温下诱导和培养3-7日；将所述培养液相继进行超滤浓缩，盐析，透析，得到蛋白溶液a；用阴离子交换树脂将蛋白溶液a进行离子交换层析，获得蛋白溶液b，将蛋白溶液b用伴刀豆蛋白A-琼脂糖凝胶进行亲和层析，得到蛋白液C；将蛋白溶液C用透析袋透析，截留分子量大于10000道尔顿，得到含有多种活性成份的集落刺激因子。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述细胞悬浮液是人外周血白细胞悬浮液，无脑新生儿或引产胎儿脾脏和/或胸腺细胞悬浮液。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述的诱导剂是含有植物血凝素-P，脂多糖，氯化锂和AB+人血清的诱导剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在超滤浓缩中超滤膜截留的分子量在10000至50000道尔顿范围内。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在制备蛋白溶液a时的透析中透析膜截留的分子量大于10000道尔顿。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的细胞是人外周血白细胞，无脑新生儿或引产胎儿胸腺和/或脾脏细胞，所述细胞的活性大于70%。
7.根据权利要求1的方法，其特征在于，从蛋白溶液C中透析截留的分子量在10000至50000道尔顿范围内。
8.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述的阴离子交换树脂是二乙基氨基乙基-琼脂糖凝胶离子交换树脂。
全文摘要
本发明涉及一种用悬浮式细胞培养和层析技术制备含多种生物活性成分的集落刺激因子的方法，本发明的特点是，将人体组织制成细胞悬浮液，经体外诱导和培养，再经超滤、盐析、透析以及离子交换层析和糖蛋白亲和层析，透析后制成含多种活性成分的集落刺激因子。该方法的优点是生产工艺简单，回收率高，制品疗效好。
文档编号C07K1/14GK1106461SQ9411879
公开日1995年8月9日 申请日期1994年12月7日 优先权日1994年12月7日
发明者高志华, 李德全, 李正东 申请人:深圳时瑞科技有限公司