专利名称：粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及其突变体(mG-CSF)与人血清白蛋白第三结构域(3DHSA)的 ...的制作方法
技术领域：
本发明属长效融合蛋白药物技术领域，具体是涉及制备粒细胞集落刺激因子及其突变体与人血清白蛋白第三结构域的融合蛋白。
背景技术：
人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是由单核细胞、纤维母细胞、内皮细胞产生的一种分子量约为20KD的糖蛋白类调节因子，其等电点约为6.0。G-CSF作用于骨髓中性粒细胞系造血前体细胞，促进其增殖、分化、成熟和释放。成熟人体内G-CSF有177个氨基酸(a型)和174个氨基酸(b)型两种异构体，b型分子的螺旋含量很高，晶体构型含有四个α螺旋，属于长链螺旋细胞因子家族。鉴于b型的生物学活性及稳定性均显著高于a型，b型分子深受研究者的推崇。重组人G-CSF已广泛用于骨髓移植和肿瘤的治疗，此外，重组人粒细胞集落刺激因子还被用于治疗急性白血病、再生障碍性贫血等疾病。G-CSF在辅助肿瘤治疗方面的作用主要是增加白细胞数目，降低化疗和放疗的风险。目前已有多种以b型为基础的重组人粒细胞制剂被批准上市，如非格司亭(filgrastim),来格司亭(Ienograstim),那托司亭(nartograstim)。其中非格司亭和那托司亭为大肠杆菌表达的非糖基化形式的重组人G-CSF，而来格司亭是CHO细胞表达的带糖基化修饰的G-CSF。非格司亭氨基酸序列即在天然G-CSF的N端附加一个蛋氨酸，那托司亭为非格司亭的突变体，共涉及天然G-CSF中5个氨基酸的定点突变，具体突变位点及方式为Thr I Ala, Leu 3 Thr, Gly 4 Tyr, Pro5 Arg, Cys 17 Ser0但是，天然和基因重组的人G-CSF易被肾小球滤过和体内蛋白酶降解，在体内的循环半衰期比较短，生物利用度非常低，为维持发挥作用的药效浓度需要频繁或高剂量给药，增加了患者的疼痛和经济负担。因此，延长粒细胞集落刺激因子的半衰期是目前各国学者研究的重点。为延长粒细胞集落刺激因子的体内半衰期，可对其进行特定修饰。一种途径是通过与某些特定组分耦联达到增加G-CSF表观分子量，从而降低肾脏的清除率。另一种途径是与惰性蛋白融合，在受体介导的内吞作用保护下阻止蛋白酶与蛋白的接触，从而降低G-CSF被体内蛋白酶降解的风险。通过聚乙二醇修饰、抗体Fe片段融合及白蛋白融合均可有效改善G-CSF的体内半衰期。但是，聚乙二醇化修饰需要特殊的化学试剂，产物均一性差，分离纯化困难，造成产品的价格昂贵。为保证Fe融合蛋白二硫键的正确折叠需要选用成本很高的哺乳动物表达 系统，另外，Fe融合蛋白的分子量偏大易造成融合蛋白分子扩散通过粘膜的速率较低，进而影响药效。人血清白蛋白是人血浆中的主要成分，具有维持血浆渗透压的功能，同时充当内源和外源多种物质或药物载体的作用。一方面由于其分子量比较大，正常情况下不易被肾小球滤过，另一方面可与体内新生的Fe受体(FcRn)结合，通过受体介导的内吞作用耐受体内蛋白酶的降解，其体内半衰期为19天。基于白蛋白的上述特点，美国人类基因组科学公司首先开发了白蛋白融合技术，目前已有多种白蛋白融合蛋白药物处于临床实验阶段。
虽然白蛋白融合技术已成功应用于延长多种蛋白或多肽类药物分子的半衰期，但是仍有一些亟待改进的方面。首先，由于白蛋白分子量约为66.5KD，在融合其他蛋白或多肽时会产生明显的空间位阻作用导致融合蛋白的活性明显降低。其次，在酵母分泌表达白蛋白及其融合蛋白时易发生降解现象，且降解片段理化性质与融合蛋白十分相近，增加了后续分离纯化的难度。最后，白蛋白融合蛋白在储存的过程中容易发生聚合现象，临床应用中容易诱发免疫反应。已有研究证实人血清白蛋白的第三结构域(3DHSA)是人血清白蛋白与FcRn结合的关键部位，独立的3DHSA仍然具有与FcRn结合的能力，其作为伴侣分子能够延长药物半衰期。此外，在表达人血清白蛋白第三结构域时未见降解现象，且其分子量大小适中，便于基因操作，较白蛋白融合更便于满足延长不同分子半衰期的需要。利用重叠延伸PCR(0verlapping PCR)方法，将3DHSA与效应分子进行直接融合，一方面可有效降低融合时产生的空间位阻效应，另一方面避免因连接肽的引入所导致降解和潜在免疫原性等问题。基于上述的理论与实践可以推测，将G-CSF及其突变体与3DHSA融合时所构建的蛋白将同时具有G-CSF与3DHSA的双重生物学活性，可用于中性粒细胞减少症的治疗，并延长G-CSF的体内半衰期。
发明内容
本发明所要解决的问题在于克服粒细胞集落刺激因子体内半衰期短的缺点，设计制备集粒细胞集落刺激因子与人血清白蛋白第三结构域的特性为一体的新型融合蛋白分子。本发明的融合蛋白在保留G-CSF生物活性的基础上，使其体内半衰期得到适当延长，提供具有潜在应用价值的创新药物分子。技术方案:两种融合蛋白，即粒细胞集落刺激因子及其突变体与人血清白蛋白第三结构域的融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列分别包括SEQ NO:1与SEQ NO:2，SEQ NO:1与SEQ NO:
3。所述的融合蛋白氨基酸序列包括SEQ NO:1与SEQ NO:2，SEQ NO:1与SEQ NO:3，在不损害融合蛋白特性的原则下，对SEQ NO:2和SEQ NO:3部分氨基酸残基的取代、缺少或加入得到的多肽分子。所述融合蛋白的粒细胞集落刺激因子及其突变体的氨基酸序列分别与SEQ NO:2和SEQ NO:3至少85%以上同源的氨基酸序列。所述融合蛋白的粒细胞集落刺激因子及其突变体的氨基酸序列分别与SEQ NO:2和SEQ NO:3至少95%以上同源的氨基酸序列。所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ NO:14和SEQ NO:15。所述的融合蛋白在制备治疗粒细胞减少症作用药物的应用。具体来说:
本发明的技术方案:通过PCR技术分别扩增获得3DHSA-G10，3DHSA_mG10，HlO-G-CSF和ΗΙΟ-mG-CSF基因片段；利用重叠延伸PCR技术分别实现3DHSA-G10和HlO-G-CSF, 3DHSA-mG10和ΗΙΟ-mG-CSF的无缝连接，琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物并对其依次进行酶切和胶回收，酶切回收后的3DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF融合基因分别与酶切回收的pPICz a A载体片段连接构建重组表达载体；将线性化充分的重组表达载体通过电击转化的方式插入宿主细胞毕赤酵母GS115的基因组中，从MD平板上挑取转化出的克隆进行试管培养并诱导，SDS-PAGE检测诱导上清，根据是否有相应分子量的诱导条带出现鉴定阳性重组菌株。融合基因的获得、重组表达载体的构建、重组菌株的鉴定、融合蛋白的诱导表达、纯化、生物学活性及药代动力学特性研究步骤详见具体的实施方案。本发明提供了用上述方法制备重组人粒细胞集落刺激因子及其突变体与人血清白蛋白第三结构域的融合蛋白，该融合蛋白包括与人血清白蛋白第三结构域完全同源的第一区和与人粒细胞集落刺激因子及其突变体至少85%同源的第二区，优选的是包括与人血清白蛋白第三结构域序列完全同源的第一区和与人粒细胞集落刺激因子及其突变体序列相同的第二区，或95%以上同源且活性增强的衍生物。所述衍生物是指在不损害融合蛋白特性的条件下对二区部分氨基酸残基的取代、缺失或加入而得到的一系列多肽分子。在本发明的融合蛋白中，人血清白蛋白的第三结构域与粒细胞集落刺激因子及其突变体的相对位置既可以是3DHSA- (m) G-CSF，又可以是(m) G-CSF-3DHSA，优选为3DHSA-(m)G-CSF,即人血清白蛋白的第三结构域与粒细胞集落刺激因子及其突变体的N末端连接。二者选择直接融合，中间不引入任何连接肽，以避免因连接肽的引入而导致的蛋白降解和潜在免疫原性方面的问题。本发明还提供分别编码人粒细胞集落刺激因子及其突变体与人血清白蛋白第三结构域融合蛋白(3DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF)的DNA序列，该序列包括与人血清白蛋白第三结构域核苷酸序列相同的第一区(SEQN0:4)和与粒细胞集落刺激因子(SEQN0:5)及其突变体(SEQN0:6)核苷酸序列相同的第二区。SEQ NO:4 是 3DHSA DNA 序列；SEQNO:5 是 G-CSF DNA 序列；SEQNO:6 是 mG-CSF DNA 序列；SEQNO:4，SEQNO:5 和 SEQNO:6 均自 5’ 端至 3’ 端本发明的又一目的是提供携带编码本发明融合蛋白相应DNA序列的重组表达载体。该重组表达载体包括pPICz a A、pPIC9、pGAPz α B,优选pPICz a A。其中优选pPICz α A载体，该载体本身分子量小便于基因操作，同时具有强AOXl启动子和MFa分泌信号肽等元件。AOXl启动子启动能力强，在甲醇作为唯一碳源时可高效启动目的基因的分泌表达。本发明的再一目的是提供表达本发明融合蛋白编码基因的宿主，该宿主是可通过化学和电击转化的方法将完整或线性化的重组融合蛋白表达载体转入的细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞，其中优选酵母细胞，优选酵母是毕赤酵母，优选毕赤酵母是GS115。优选的酵母表达系统除了具有类似原核表达系统遗传背景清楚、易操作、繁殖能力强、营养要求低、易于工业放大等优点外，同时具有真核细胞的蛋白翻译后修饰能力，易于大量生产高质量的重组蛋白。GSl 15缺陷型菌株便于转化后的筛选，而且其自身分泌杂蛋白少便于纯化，糖基化程度低，可有效避免因酿酒酵母过度糖基化修饰引起免疫原性的问题。成功转化的细胞 ，即含有本发明融合蛋白基因的细胞，可通过提取基因组DNA进行PCR鉴定、菌落Dot blotting、SDS-PAGE检测细胞的诱导上清筛选重组菌株或可选择小鼠抗人G-CSF和HSA的抗体对上述方法所筛选重组菌株的培养上清进行Western blotting鉴定。可以通过培养含有本发明融合蛋白基因的宿主生产本发明中的融合蛋白。宿主培养既可选择摇瓶也可选择生物反应器，优选生物反应器。宿主的培养包括两个阶段，第一阶段旨在宿主的大量生长，第二阶段主要用于诱导表达融合蛋白。可以综合利用多种手段自含有本发明融合蛋白基因宿主的培养液中分离并纯化融合蛋白。如超滤、盐析、醇沉、制备电泳、层析等技术以及上述技术的优化组合。有益效果:1、本发明首次利用重叠延伸PCR技术成功的将SEQ NO:4和SEQ NO:5，SEQ NO:4和SEQ NO:6核苷酸序列进行了直接拼接，成功构建了两种融合蛋白，其克服粒细胞集落刺激因子体内半衰期短的缺点，其为集人血清白蛋白第三结构域与人粒细胞集落刺激因子的特性为一体的新型高效融合蛋白分子。2、本发明构建了适合酵母分泌表达的重组表达载体并利用电击转化的方式将其插入毕赤酵母基因组中，综合利用菌落印迹和SDS-PAGE对电击转化出的毕赤酵母GSl 15菌落进行了快速的筛选，既降低了筛选工作量又保证了准确率。3、本发明利用蓝色琼脂糖重力柱和丁基疏水柱纯化得到了较高纯度的两种融合蛋白:3DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF，纯化所得融合蛋白均保留了 G-CSF的生物活性，二者在体内的半衰期分别为3.4h和4.5h，约为G-CSF的1.6和2.1倍，提供具有潜在应用价值的创新药物分子。
图1 为质粒 pPICz a A-3DHSA-G-CSF 和 pPICz a A-3DHSA-mG_CSF 的构建示意图。图2为融合基因 3DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF的鉴定图3 为重组质粒 pPICz a A-3DHSA-G-CSF 和 pPICz a A-3DHSA-mG_CSF 的酶切鉴定结果，图A和B中M为Marker，Al泳道为重组质粒pPICz a A-3DHSA-G-CSF，Α2泳道为重组质粒 pPICz a A-3DHSA-G-CSF 的酶切产物，BI 泳道为重组质粒 pPICz a A-3DHSA-mG_CSF，B2泳道为重组质粒pPICz a A-3DHSA-mG-CSF的酶切产物。图4为阳性重组克隆的筛选及鉴定，其中A和B分别为pPICz a A_3DHSA-G_CSF和pPICz a A-3DHSA-mG-CSF的菌落印迹结果结果，C和D分别为pPICz a A-3DHSA-G-CSF和pPICz a A-3DHSA-mG-CSF 的 SDS-PAGE 检测结果。图5为融合蛋白的Western blotting鉴定，图A为小鼠抗人G-CSF抗体检测结果，其中M为Marker，I泳道为3DHSA-G-CSF，2泳道为G-CSF，3泳道为3DHSA-mG_CSF，图B为小鼠抗人HSA抗体检测结果，其中M为Marker，I泳道为3DHSA-G-CSF，2泳道为HSA，3泳道为3DHSA-mG-CSF。图6为诱导时间对融合蛋白表达量的影响，图A和图B分别为3DHSA-G-CSF和3DHSA-mG-CSF的SDS-PAGE结果，其中M为Marker，I 9泳道分别是诱导时间为24h，36h,48h，60h，72h，84h，96h，108h 和 120h 的结果。图7为纯化后融合蛋白的纯度鉴定，其中M为Marker，图Al为3DHSA-G-CSF，图BI为 3DHSA-mG-CSF。
图8为融合蛋白的体外活性测定。图9为融合蛋白的半衰期测定。
具体实施例方式以下实施例中所用DH5 a、GSl 15和pPICz a A购自Invitrogen,模板质粒pPICz a A-HSA-G-CSF (SEQ NO:7)的构建参考 CN 01124114.4。各实施例中所用质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根(北京)生化有限公司，人G-CSF Elisa试剂盒购自达科为(深圳)科技有限公司，各种限制性内切酶、各种DNA聚合酶、T4DNA连接酶、核酸marker及小分子量蛋白marker购自宝生物工程(大连)有限公司，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，吉赛欣购自华北制药金坦生物技术股份有限公司，重组HSA购自武汉禾元生·物技术公司，小鼠抗人HSA和G-CSF抗体购自美国Santa公司，HRP标记兔抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术公司，蓝色琼脂糖填料和丁基疏水填料购自GE公司，酵母粉和蛋白胨购自0X0ID，YNB和博莱霉素购自Invitrogen，其他试剂均为分析纯，购自鼎国(北京)股份有限公司。实施例13DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF融合基因的克隆3DHSA-G10和3DHSA_mG10的扩增，所用引物如下:P1: 5 ’ TCTCTCGAGAAGAGAGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAAT3 ’ (5 ’ 端带有 Xho I 酶切位点，CTCGAG)，引物 SEQ NO:8。P2:5，CCAGCGGGGTTAAGCCTAAGGCAGCTTGAC3，，引物 SEQ NO: 9。P3:5，ATGTGGGTGCTAAGCCTAAGGCAGCTTGAC3，，引物 SEQ NO: 10。PCR方法如下:50 μ L体系中加入:10 μ mo I/L的上下游引物各2 μ L (扩增3DHSA-G10所用引物为Pl和Ρ2，3DHSA_mG10所用引物为Pl和P3)，2.5 μ mol/L的d NTP4 μ L, IOXPremistar buffer 5 μ L, 5U/ μ L 的 Premistar DNA 聚合酶 0.5 μ L，pPICz a A-HSA-G-CSF质粒(SEQ NO:7) I μ L，不足部分由灭菌双蒸水补齐，反应条件为:94°C预变性5min, 94°C变性lmin,56°C退火lmin,72°C延伸lmin,重复25个循环。HlO-G-CSF和HlOiG-CSF的扩增，所用引物如下:P4:5，TTTGGGTTTGACCCCGCTGGGACCGGCAAG3，，引物 SEQ NO: 11。P5:5’ CGTCTCGAGTTAGGGCTGGGCAAGGTGGC3，(5，端带有 Xho I 酶切位点，CTCGAG)，引物 SEQ NO:12oΡ6:5’ TTTGGGTTTGGCACCCACATACAGAGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTCAGAG 3，，引物 SEQ NO: 13。PCR方法如下:50 μ L体系中加入:10 μ mol/L的上下游引物各2 μ L (扩增3H10-G-CSF 所用引物为 Ρ4 和 Ρ5, HlO-mG-CSF 所用引物为 P6 和 P5)，2.5 μ mol/L 的d NTP4 μ L, IOXPremistar buffer5 μ L, 5U/ μ L 的 Premistar DNA 聚合酶 0.5 μ L,pPICz a A-HSA-G-CSF质粒(SEQ NO:7) I μ L，不足部分由灭菌双蒸水补齐，反应条件为:94°C预变性5min,94°C变性lmin,56°C退火lmin,72°C延伸lmin,重复25个循环。利用重叠延伸PCR 法分别将 3DHSA-G10 与 HIO-G-CSF，3DHSA_mG10 与 HlO-mG-CSF进行融合:分别切胶回收3DHSA-G10，3DHSA_mG10，H10-G-CSF 和 HlOiG-CSF 基因片段的 PCR产物并稀释30倍，于50 μ L体系中加入:10ymol/L的Pl和P5各2 μ L，2.5 μ mol/L的dΝΤΡ4μ L, 10XLA Taq buffer5 μ L，5U/μ L 的 LA Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L，稀释后的回收片段各 I μ L (扩增 3DHSA-G-CSF 所用模板为 3DHSA-G10 与 H10-G-CSF，扩增 3DHSA-mG_CSF 所用模板为3DHSA-mG10与HlO-mG-CSF)不足部分由灭菌双蒸水补齐，反应条件为:94°C预变性 5min,94°C变性 lmin,56°C退火 lmin, 72。。延伸 lmin30s,重复 25 个循环。通过I %琼脂糖凝胶电 泳检测反应产物，对比DL2000，在加样泳道约IOOObp大小出现融合基因条带，如图2。切胶回收目的基因片段，分别对回收的目的基因片段和pPICzaA进行Xho I单酶切，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收融合基因片段及载体片段，用T4DNA连接酶将上述回收产物连接；连接产物转化DH5a感受态细胞，37 °C培养过夜，挑取转化的单菌落接种于5mL LB液体培养基中37°C培养8h，提取质粒进行酶切鉴定，酶切所得大小片段分别与载体和融合基因片段大小吻合，如图3。将上述克隆送南京思普金测序，测序结果证实重组表达载体构建成功，命名为pPICz a A-3DHSA-G-CSF和pPICz aA-3DHSA-mG-CSF。实施例2重组菌株的筛选提取pPICz a A-3DHSA-G-CSF 和 pPICz a A-3DHSA-mG_CSF 质粒，经 Sal I 单酶切进行线性化，琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切产物，
1.5kV电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，30°C静置2h，将转化物均匀涂布在4块含有lmol/L山梨醇的MD平板上，30°C倒置培养3天，将转化出的克隆对应标记好同时转接于新制备的两块MD平板上，30°C倒置培养3天，将紫外照射处理好的PVDF膜轻放在其中一块MD平板菌落上方，同时在膜上放置紫外照射处理好的滤纸2张，用3mL无水甲醇将滤纸表面全部浸润，30°C继续培养24h后，取出PVDF膜和滤纸，按照Western blotting流程对PVDF膜依次进行封闭、洗涤、孵育小鼠抗人G-CSF抗体、洗涤、孵育HRP标记的兔抗小鼠Ig 二抗、洗漆和显色。(参见Scorer CA等Biotechnologyl22:181-184.1994)根据是否出现有色菌落圈初步判定阳性重组菌株，如图4(A)和4(B)。在另一块MD平板上挑取有菌落圈形成的对应单菌落并接种于IOmLBMGY (30mg磷酸氢二钾，118mg磷酸二氢钾，134mg无氨基培养基，IOOmg酵母粉，200mg蛋白胨，2yg生物素，0.1mL甘油，ρΗ6.0)液体培养基中30°C、200r/min培养24h, 2000r/min离心5min,弃上清,用等体积的BMMY (30mg磷酸氢二钾，118mg磷酸二氢钾，134mg无氨基培养基，IOOmg酵母粉,200mg蛋白胨,2 μ g生物素,0.1mL无水甲醇，pH6.0)液体培养基重悬菌体，30°C、200r/min每12h往BMMY中加入100 μ L的无水甲醇进行诱导，培养120h后，8000r/min离心lOmin，收集上清，进行SDS-PAGE验证，如图4(C)和4(D)。对比蛋白Marker根据蛋白电泳条带的粗细将阳性克隆中相对表达量最高的菌株命名为 GS115/pPICz a A-3DHSA-G-CSF 和 GS115/pPICz a A-3DHSA-mG_CSF。实施例33DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF融合蛋白的诱导表达及鉴定将筛选到的GS115/pPICz a A-3DHSA-G-CSF 和 GS115/pPICz a A-3DHSA-mG_CSF 单菌落接种至装有100ml BMGY(0.3g磷酸氢二钾，1.18g磷酸二氢钾，1.34g无氨基培养基，Ig酵母粉，2g蛋白胨，20 μ g生物素，ImL甘油，ρΗ6.0)的500ml锥形瓶中，220r/min, 30°C培养24h，2000r/min离心5min，收集菌体。用IOOml的BMMY (0.3g磷酸氢二钾，1.18g磷酸二氢钾，1.34g无氨基培养基，Ig酵母粉,2g蛋白胨,20 μ g生物素，ImL无水甲醇，pH6.0)重悬菌体沉淀，每12h补加ImL无水甲醇,持续诱导五天。8000r/min离心IOmin,收集上清，进行SDS-PAGE检测，融合蛋白表达量随着诱导时间的延长而不断提高，如图5 (A)和5 (B)。采用 Western blotting 鉴定融合蛋白 3DHSA-G-CSF 和 3DHSA-mG_CSF 的 G-CSF 和 HSA 抗原性，分别设定G-CSF (参见Yun Bai等PNAS20:7292-7296，2005)和HSA作为阳性对照(参见 YangHe 等 PNAS47:19078-19083，2011)如图 6(A)和 6 (B)。实施例43DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF的纯化及纯度鉴定GS115/pPICz a A-3DHSA-G-CSF 和 GS115/pPICz a A-3DHSA-mG_CSF 阳性重组菌株发酵液离心所得上清过0.45 μ m滤膜后用纯水稀释三倍，用蓝色琼脂糖填料富集并纯化目标蛋白，收集的目的蛋白峰用丁基疏水填料纯化融合蛋白，5mM醋酸钠缓冲液透析纯化所得的融合蛋白后冷冻干燥保存，命名为3DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF，其氨基酸序列为SEQNO:14和SEQ NO:15。采用SDS-PAGE法对纯化所得融合蛋白的纯度进行检测，如图7 (A)和7 (B)0实施例53DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF的促NFS-60细胞增殖活性用MTT法测定纯化所得融合蛋白3DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF的促NFS-60细胞增殖活性。将传代培养正常的NFS-60细胞(美国ATCC)用RPM1-1640培养基离心洗涤三次，将细胞按I X IO5个/mL的密度悬浮于富含5%马血清、5%胎牛血清的不含G-CSF的RPM1-1640培养基中(V/V)。于96孔板中每孔加入50 μ L细胞悬液，设6复孔培养，除空白夕卜，每孔中加入不同浓度的待测样品，同时选取吉赛欣(重组人G-CSF的商品名)为阳性对照药，370C ,5% CO2，饱和湿度条件下培养48h后，每孔加入MTT工作液20 μ L，继续培养4h，每孔加入裂解液100 μ L，混匀后，放入酶标仪，于波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。活性分析结果显示:两种融合蛋白均具有剂量依赖性刺激NFS-60细胞增殖的作用，如图8。实施例63DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF的体内半衰期测定采用G-CSF终浓度 为lmg/kg的体重剂量，对6周龄的ICR雄性小鼠皮下分别注射吉赛欣和两种融合蛋白，分别于给药后的0.25h, 0.5h, lh, 2h, 4h, 8h, 12h, 24h和36h进行眼眶取血，常温静置30min后，2000r/min离心lOmin，取上清，利用人G-CSF预包被El isa试剂盒检测血清中G-CSF的浓度。将血药浓度数据输入PKsolver进行数据处理，拟合血药浓度曲线。结果显示，3DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF的半衰期为分别为3.4h和4.5h，为G-CSF的1.6倍和2.1倍，如图9。
权利要求
1.粒细胞集落刺激因子及其突变体与人血清白蛋白第三结构域的融合蛋白，其特征在于它是由粒细胞集落刺激因子及突变体与人血清白蛋白第三结构域在基因水平直接融合后表达的重组蛋白；所述人血清白蛋白第三结构域的氨基酸序列如SEQ N0:1所示；所述粒细胞集落刺激因子及其突变体的氨基酸序列为SEQNO:2和SEQNO:3。
2.根据权利要求1所述的粒细胞集落刺激因子及其突变体与人血清白蛋白第三结构域的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白氨基酸序列分别包括SEQNO:1与SEQNO:2, SEQNO:I与SEQNO:3，或不损害融合蛋白特性的原则下，对SEQ NO:2和SEQ NO:3部分氨基酸残基的取代、缺少或加入得到的多肽分子。
3.根据权利要求1所述的粒细胞集落刺激因子及其突变体与人血清白蛋白第三结构域的融合蛋白，其特征在于所述粒细胞集落刺激因子及其突变体氨基酸序列与SEQ NO:2和SEQ NO:3至少85%以上同源的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的粒细胞集落刺激因子及其突变体与人血清白蛋白第三结构域的融合蛋白，其特征在于所述粒细胞集落刺激因子及其突变体氨基酸序列与SEQ NO:2和SEQ NO:3至少95%以上同源的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4所述的粒细胞集落刺激因子及其突变体与人血清白蛋白第三结构域的融合蛋白，其特征在于:粒细胞集落刺激因子与人血清白蛋白第三结构域的融合蛋白的氨基酸序列为SEQNO:14、粒细胞集落刺激因子的突变体与人血清白蛋白第三结构域的融合蛋白的氨基酸序列为SEQNO:15o
6.根据权利要求1-5任何一项所述的融合蛋白在制备治疗粒细胞减少症作用药物的应用。
全文摘要
本发明属长效融合蛋白药物技术领域，具体是涉及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及其突变体(mG-CSF)与人血清白蛋白第三结构域(3DHSA)的融合蛋白；融合蛋白中所述的人血清白蛋白第三结构域的氨基酸序列如SEQ NO1，粒细胞集落刺激因子及其突变体的氨基酸序列为SEQ NO2和SEQ NO3；所述的本发明首次成功构建了两种融合蛋白，其克服粒细胞集落刺激因子体内半衰期短的缺点，其为集人血清白蛋白第三结构域与人粒细胞集落刺激因子的特性为一体的新型融合蛋白分子。本发明的融合蛋白在保留G-CSF生物活性的基础上，其在体内的半衰期分别为3.3h和4.4h，约为G-CSF的1.6倍和2倍，提供具有潜在应用价值的创新药物分子。
文档编号A61K47/48GK103102418SQ201310042159
公开日2013年5月15日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者高向东, 赵述强, 张瑜, 姚文兵, 田浤, 刘超, 陈晓菲 申请人:中国药科大学