一种巨噬细胞移动抑制因子四环小分子抑制剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种巨噬细胞移动抑制因子(MIF)四环小分子抑 制剂，尤其涉及一种对MIF的互变异构酶活性以及MIF接到的炎症、细胞增殖具有强烈抑制 作用的小分子化合物。
【背景技术】
[0002] 巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是一种含有115个氨基酸残基的蛋白质，分子量为 12.5kDa，是由α链和β链组成的三维结构。MIF的蛋白晶体结构是一个同源三聚体，每个单体 有两个平行的α螺旋和6个β链组成。
[0003] MIF的重要来源之一是脑垂体，占垂体蛋白总量的0.05 %。单核细胞/巨噬细胞也 是MIF的重要来源之一。此外，淋巴细胞也表达MIFJIF可与细胞膜表面蛋白⑶74的细胞外 基团结合而发挥作用。MIF与CD74的细胞外基团，即73-232位的氨基酸残基高亲和结合，激 活ERK1/2和AKT蛋白激酶，从而引起各种细胞的增殖和炎性因子的释放，产生各种生理和病 理反应。MIF是一种独特的蛋白质，它参与炎症反应、免疫反应、细胞增殖、血管生成等。MIF 与多种疾病相关，包括但不限于动脉粥样硬化症、肾小球肾炎、Crohn病、类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、肿瘤、迟发性超敏反应、移植排斥反应、神经退行性疾病、糖尿病、中风、脊 髓损伤。
[0004] MIF具有互变异构酶活性，可以催化D-多巴色素、苯丙酮酸的互变异构化。MIF还能 催化硫醇蛋白的氧化还原反应。由于涉及多种炎症、免疫、肿瘤、神经退行性疾病的发生、发 展，MIF已成为上述疾病的重要靶点。
[0005] 目前针对MIF的治疗策略主要是靶向其互变异构酶活性中心发展小分子抑制剂。 但目前发现的MIF小分子抑制剂普遍活性较低，至今还没有针对MIF的小分子抑制剂成功上 市。因此，开发高活性的MIF小分子抑制剂对于治疗包括动脉粥样硬化症、肾小球肾炎、 Crohn病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肿瘤、迟发性超敏反应、移植排斥反应、神经退 行性疾病、糖尿病、中风、脊髓损伤在内的多种疾病具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 为克服现有技术中的缺点，本发明旨提供一种巨噬细胞移动抑制因子(MIF)四环 小分子抑制剂，以期抑制MIF介导的炎症、免疫和细胞增殖功能。
[0007] 为实现上述技术目的，本发明的巨噬细胞移动抑制因子(MIF)四环小分子抑制剂 的分子结构式如下：
[0008]
[0009] 其中，R1可以是苯环、二氧六环、氮氧六环、二氮六环;R2，R3和R 4独立选自于包含如 下基团的组合:氣、卤素、C1-C3烷基、杂烷基、芳香基、杂芳烷基、环烷基、杂环和卤代烷基； R5是卤素或_(CH2)n_，这里η可以是0或1;R6可以是羟基、卤素、杂烷基、芳香基、芳氧基、杂芳 烷基、环烷基、杂环和卤代烷基等。
[0010] 进一步的，所述的MIF四环小分子抑制剂的衍生物之一为FGH-001，其分子结构式 如下：
[0011]
[0012] 本发明基于MIF的晶体结构对包含超对100万个化合物的Chembridge和Specs两个 化合物数据库进行虚拟筛选，获得对MIF的互变异构酶活性具有高强度选择性抑制作用的 小分子化合物，包括其药学上可接受的盐和前体药，在体外试验中能抑制MIF介导的ERK1/2 的活化，抑制单核细胞增殖，抑制肿瘤细胞增殖，抑制炎症反应。
[0013] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0014] 本发明的MIF四环小分子抑制剂抑制用于治疗包括动脉粥样硬化症、肾小球肾炎、 Crohn病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肿瘤、迟发性超敏反应、移植排斥反应、神经退 行性疾病、糖尿病、中风、脊髓损伤在内的多种疾病。
【附图说明】
[0015] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： [00 16]图1是本发明的FGH-001对MIF的互变异构酶活性的抑制作用示意图。
[00Π ] 图2是本发明的FGH-001对BV2细胞ERK1/2和AKT磷酸化的抑制作用示意图。
[0018]图3是本发明的FGH-001对BV2细胞增殖的抑制作用示意图。
[0019 ]图4是本发明的FGH-001对U251细胞增殖的抑制作用示意图。
[0020]图5是本发明的FGH-001对胰腺癌细胞增殖和肿瘤形成的抑制作用示意图 [0021 ]图6是本发明的FGH-001对胰腺癌细胞凋亡的促进作用示意图。
[0022]图7是本发明的FGH-001对对LPS诱导的炎症的抑制作用示意图。
[0023]图8是本发明的FGH-001对二型糖尿病(db/db)小鼠血糖的影响示意图。
【具体实施方式】
[0024] 本实施例基于MIF的晶体结构，对包含超对100万个化合物的Chembridge和Specs 两个化合物数据库进行虚拟筛选。经过RE0S规则过滤和基于分子指纹的聚类分析后，对170 个化合物进行D-多巴色素互变异构酶活性试验，获得了一系列的具有微摩尔级活性的MIF 互变异构酶抑制剂，其分子结构式如下：
[0025]
[0026] 其中，R1可以是苯环、二氧六环、氮氧六环、二氮六环;R2，R 3和R4独立选自于包含 如下基团的组合:氢、卤素、C1-C3烷基、杂烷基、芳香基、杂芳烷基、环烷基、杂环和卤代烷 基;R 5是卤素或-(CH2) η-,这里η可以是0或1 ;R6可以是羟基、卤素、杂烷基、芳香基、芳氧基、 杂芳烷基、环烷基、杂环和卤代烷基等。
[0027] 优选的，所述的MIF四环小分子抑制剂的衍生物之一为FGH-001，其分子式如下：
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[0029] 如图1所示，所述的MIF四环小分子抑制剂FGH-001抑制MIF的互变异构酶活性。如 图所示，将不同浓度的FGH-001与10nM MIF和ΙμΜ D多巴色素进行反应，用多巴色素异构酶 ELISA检测试剂盒测定MIF的相对活性，求出品pIC50值。结果为三次实验所得的平均数土标 准差。结果:FGH-001浓度依赖性地抑制MIF的互变异构酶活性。pIC50为6.4 ± 0.3。
[0030] 如图2所示，所述的MIF四环小分子抑制剂FGH-001对BV2细胞ERK1/2和AKT磷酸化 的抑制作用，如图所示，将不同浓度的FGH-001与BV2细胞(5xl06)孵育12小时后裂解细胞， 用SDS-PAGE和Western blot检测方法检测ERK1/2和AKT的磷酸化水平以及总的ERK2和AKT 的蛋白表达水平。结果:FGH-001浓度依赖性地抑制BV2细胞ERK1/2和AKT的磷酸化。
[0031 ] 如图3所示，所述的MIF四环小分子抑制剂FGH-001对BV2细胞增殖的抑制作用，如 图所示，将不同浓度的FGH-001与BV2细胞(5xl06)孵育24小时后用MTT检测法测定细胞的增 殖程度。结果:FGH-001浓度依赖性地抑制BV2细胞增殖。
[0032] 如图4所示，所述的MIF四环小分子抑制剂FGH-001对对U251细胞增殖的抑制作用。 将不同浓度的FGH-001与U251细胞（5xl06)孵育24小时后用MTT检测法测定细胞的增殖程 度。结果:FGH-001对U251细胞的增殖无显著影响。
[0033] 实施例1:
[0034]本实施例的FGH-001对胰腺癌细胞增殖和肿瘤形成的抑制作用。
[0035] MIF在胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、结肠癌等多种实体肿瘤中