抑制心肌细胞程序性坏死的CaMKII的抑制剂及用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于一种CaMKII的抑制剂及其在制备应用于心脏损伤修复疾病的药物中 的用途。
【背景技术】
[0002] 细胞死亡是涉及细胞发育、衰老和死亡的一个基本过程，分类为不同形式，包括细 胞坏死、细胞凋亡和细胞自噬。以前的观点认为，细胞凋亡是一种严格控制、调控机制明确 的主动过程；而细胞坏死则被认为是意外、被动的细胞死亡。但最近的研究进展发现，如肿 瘤坏死因子-a(TNF-a)等的细胞死亡因子可触发"程序性"细胞坏死（即程序性坏死），且细 胞坏死有免疫源性，涉及重要的生理和病理过程，包括胚胎发育、细菌及病毒性感染的宿主 反应及组织损伤和炎症。研究发现，受体相互作用蛋白1(RIP1)和3(RIP3)形成了坏死体，从 而使混合系激酶区域样蛋白（MLKL)磷酸化，最终导致了各类型细胞的程序性坏死。
[0003] 成年心肌细胞是终末分化的细胞，心肌细胞的缺失是出现心力衰竭的一个重要致 病因素。在过去的三十余年里，有大量研究关注心肌细胞凋亡而非细胞坏死，但细胞坏死早 已被认为是重度心肌损伤中细胞死亡的主要形式。普遍认为，细胞坏死是一种不可调控的 被动细胞死亡形式，因此不可能成为用于治疗的有用靶点。人们对心肌细胞坏死的根本机 制依然知之甚少。
[0004] 申请人在研究中发现，RIP3上调在缺血性和氧化应激诱导的心肌细胞坏死中发挥 了重要作用，最终导致心肌重塑和心力衰竭。重要的是，申请人已经证实，通过激活多功能 Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶II(CaMKII)而非之前报道的RIP1-RIP3-MLKL级联反应，上调 RIP3可诱发心肌细胞坏死，揭示了一种全新模式的心肌细胞程序性坏死。另外，RIP3介导的 心肌细胞凋亡同样依赖于CaMKII，而非RIP1的激活。以RIP3-CaMKII通路为靶向可保护心 脏，避免缺血性和氧化应激诱导的心肌细胞程序性坏死、心肌重塑和心力衰竭。我们发现， CaMKII是RIP3的新底物和心肌细胞程序性坏死机制的组成成分，说明保护心肌细胞程序性 坏死可以作为治疗靶点。因此寻找合适阻断CaMKII与RIP3通路的抑制剂成为了新的药物开 发难题。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提出一种抑制心肌细胞程序性坏死的CaMKII的抑制剂，以及该 CaMKII的抑制剂在制备抑制心肌细胞程序性坏死的药物中的应用。
[0006] 本发明提供了一种抑制心肌细胞程序性坏死的CaMKII的抑制剂，该抑制剂为3-15 ymol/kg KN-93、Ad-CaMKII-DN和/或3-15ymol/kg的AIP;所述的KN-93的结构式为
[0008] 所述的Ad-CaMKII-DN为CaMKII去活性突变腺病毒，是CaMKIlSC的丙氨酸替代43号 赖氨酸残基的突变体;所述的AIP的肽段序列为KKALRRQEAVDAL。
[0009] 在试验中，结果显示，本发明上述KN-93和AIP优选为5-10ymol/kg。
[0010] 上述的抑制剂，其中，所述的Ad-CaMKII-DN是采用定点突变试剂盒的点突变获得 的，该定点突变试剂盒为QuikChange II，Stratagene;该突变包括以下步骤：
[0011] 1)将大鼠 CaMKII-SC基因的编码区克隆到pcDNA4/His B质粒上;然后用针对K43位 点的引物，
[0012] ： 5'-ggacaagagtatgctgccgcaattatcaacaccaaaaag-3',
[0013] Τ?5? ： 5'-ctttttggtgttgataattgcggcagcatactcttgtcc-3',
[0014] 以pcDNA4/His B-CaMKIId2质粒为模板，利用Hifi高保真酶进行PCR，得到的产物 经限制性内切酶Dpnl于37°C处理6h，取10μ1消化后的产物转化到Top 10感受态细胞里，再 涂布于氨苄抗性的LB平板，37°C培养箱过夜培养，挑取单克隆培养并提质粒测序，获取K43A 阳性的克隆；
[0015] 2)之后再将突变质粒的基因编码区以及标签一起克隆到腺病毒载体上，得到了 Ad-CaMKIlS-DN 病毒。
[0016]本发明所述的抑制剂，其中所述的KN-93、AIP的浓度为3-15ymol/kg;优选5-10μ mol/kg;其中，应用在细胞试验时，所述的ΚΝ-93或AIP为浓度为5μπι〇1/1;应用在动物实验 时，所述的ΚΝ-93或ΑΙΡ为浓度为ΙΟμ mol/kg;所述的Ad-CaMKII-DN为CaMKII去活性突变腺病 毒，其用量为每个心肌细胞10-100个腺病毒。
[0017] KN-93是一种强效的特异性的CaMKII抑制剂，其Ki为0.37μΜ，对APK，PKC，MLCK或 Ca2+-PDE没有明显的抑制活性。通过与CaMKII结合，抑制其激酶活性。
[0018] Ad-CAMKII-DN是一种过表达无活性CaMKII突变体的腺病毒，表达的无活性CaMKII 竞争性的和底物结合，却不能够发挥激酶活性，从而发挥抑制CaMKII的作用。
[0019] AIP，序列KKALRRQEAVDAL，全称Autocamtide-2-Related Inhibitory Peptide， C64H116N22019,通过模拟成CaMKII底物与其结合，从而抑制CaMKII和真正的底物结合，从 而发挥抑制CaMKII的作用。三种抑制剂均为CaMKII活性的抑制剂。本发明提出了所述的应 用，其中，所述的KN-93的分子式为C 26H29CiN2〇4S，分子量501.04;其结构式为：
[0021] 本发明进一步提出，其中，应用在细胞试验中，所述的KN-93为浓度为5μπι〇1/1;应 用在动物实验中，所述的ΚΝ-93为浓度为lOymol/kg。
[0022] 本发明进一步提出，其中，所述的Ad-CaMKII-DN为CaMKII去活性突变腺病毒，其剂 量为每个心肌细胞10-100个腺病毒。
[0023] 本发明进一步提出，其中，所述的Ad-CaMKII-DN是CaMKIlSC的丙氨酸替代43号赖 氨酸残基的突变体。
[0024] 本发明进一步提出，其中，所述的Ad-CaMKII-DN是采用定点突变试剂盒的点突变 获得的，包括以下步骤：
[0025] 1)将大鼠 CaMKII-SC基因的编码区克隆到pcDNA4/His B质粒上;然后用针对K43位 点的引物，
[0026] ： 5' -ggacaagagtatgctgccgcaattatcaacaccaaaaag-3',
[0027] Τ?5? ： 5' -ctttttggtgttgataattgcggcagcatactcttgtcc-3',
[0028] 以pcDNA4/His B-CaMKIId2质粒为模板，利用Hifi高保真酶进行PCR，得到的产物 经限制性内切酶Dpnl于37°C处理6h，取10μ1消化后的产物转化到Top 10感受态细胞里，再 涂布于氨苄抗性的LB平板，37°C培养箱过夜培养，挑取单克隆培养并提质粒测序，获取K43A 阳性的克隆。
[0029] 2)之后再将突变质粒的基因编码区以及标签一起克隆到腺病毒载体上，得到了 Ad-CaMKIlS-DN 病毒。
[0030] 本发明进一步提出，其中，所述的Ad-CaMK II-DN所采用的定点突变试剂盒为 QuikChange II，Stratagene〇
[0031] 本发明进一步提出，其中，所述的AIP的肽段序列为:KKALRRQEAVDAL。
[0032] 本发明进一步提出，其中，应用在细胞试验中，所述的AIP为浓度为5μπι〇1/1;应用 在动物实验中，所述的ΑΙΡ为浓度为lOymol/kg。
[0033] 本发明提出了所述的应用，其中，所述的抑制心肌细胞程序性坏死的药物为通过 抑制CaMKII的活化从而阻断细胞程序性死亡的通路导致的心脏缺血损伤、心脏缺血/再灌 损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心脏破裂的药物。
[0034]首先申请人在研究中发现RIP3缺失可阻断缺血/再灌（I/R)诱导的心肌细胞坏死。 [0035] RIP3缺失可阻断缺血/再灌（I/R)诱导的心肌细胞坏死
[0036]由于RIP3是导致心肌细胞在内各类型细胞程序性坏死的重要决定性因素，我们首 先采用Ripk3-缺陷（Ripk3v )小鼠及其野生型(WT)同窝小鼠研究了RIP3在I/R诱导的心肌 损伤中的潜在作用。通过30min缺血随后4h再灌注后，RIP3缺失将I/R诱导的心肌梗死面积 从30.5%显著降低至19.2%，同时这两组的风险区域相似（图la)。重要的是，Ripk3 v小鼠 心脏可耐受I/R诱导的心肌细胞坏死，表现为乳酸脱氢酶(LDH)释放量的减少和伊文斯蓝染 料(EBD)通透性降低（图lb、c)。这些结果提示RIP3缺失有保护效果的原因是其对I/R诱导心 肌细胞程序性坏死的抑制作用。
[0037]由于心肌细胞坏死在心脏不良重塑和心脏坏死的致病机理中起到重要作用，我们 随后评估了 RIP3对I/R损伤后遗症的潜在作用。在慢性I/R(30min缺血随后8周再灌注）中， RIP3缺失可有效阻断I/R诱导的心脏重塑，包括纤维化和肥大（图Id、e)。而且，RIP3缺失，可 完全消除I/R诱导的心脏收缩功能障碍，表现为射血分数(EF)和室短轴缩短率(FS)下降以 及左心室扩张（由收缩期左心室内部直径，LVID指示）（图lf-h)。重要的是，Ripk3 v小鼠中 慢性I/R诱导的死亡率也低于WT同窝小鼠（图li)。因此，急慢性体内数据均显示RIP3对于1/ R诱导的心肌细胞程序性坏死，和心脏不良重塑与心力衰竭后遗症的发生是不可或缺的。 [0038] 且RIP3缺失将可阻断多柔比星(D〇X〇rubicin，D〇X)引发的心肌细胞坏死。
[0039] 与I/R损伤一样，化疗的副作用通常也会引发心肌细胞的过度损耗和心力衰竭。尤 其是多柔比星(Dox)，一种广泛用于处理多种癌症的前线化疗药物，会造成不可逆的心脏毒 性，致使30 % -40 %的患者出现心肌细胞大量死亡、心肌病和心力衰竭。不断增加的证据表 明，Dox诱导的心肌损伤至少部分是由氧化应激导致的。尽管有大量的研究关注Dox诱导的 心肌症和心力衰竭，其机制仍不清楚。为了明确RIP3是否与多种损伤引发的心肌细胞损失 有关，我们随后研究了 RIP3在Dox诱导的心肌细胞死亡和之后心肌重塑和心力衰竭中的潜 在作用。Dox (20mg/kg，i . p.)单次给药可损伤WT小鼠的心肌细胞膜完整性，表现为Dox给药 一周后分析的EBD阳性染色结果（图2a)小鼠中Dox诱导的心肌细胞坏死率显著低 于WT小鼠，表现为EBD-阳性染色较少（图2a)和血清LDH浓度降低（图2b)。值得注意的是， RIP3缺失还可以保护心脏以免出现Dox诱导的心脏收缩性和形