时的凋亡性和坏死性细胞死亡。70%左右的Dox和H/R诱导细胞死 亡可耐受zVAD(图6f-i)，这说明，在我们提供的条件下，缺血和氧化应激诱导的心肌细胞死 亡主要由细胞坏死介导。大多数的RIP3介导的心肌细胞坏死是受调控的，即程序性坏死，因 为其中很大比例可通过CaMKII抑制而消除。
[0058] 在体内环境下，RIP3-缺失小鼠体内，约50%的I/R和Dox诱导的心肌细胞坏死受到 阻断，这说明近半数的心肌细胞坏死为RIP3依赖性程序性坏死。基于这些体内和体外数据， 我们得出结论:心肌细胞程序性坏死和凋亡在I/R和Dox诱导的心肌损伤中发挥重要作用。 [0059] 方法
[0060]动物在中国北京的北京大学试验动物中心(经实验动物管理评估及认证协会认可 的实验动物机构)饲养。动物随机分配至实验组。仅适用雄性动物。我们的研究中未使用不 入选或排除参数。我们未进行研究者的处理设盲，但也未进行主观评估。涉及实验动物(包 括小鼠和大鼠）的所有操作均按照北京大学动物研究委员会批准的研究方案进行，并符合 实验室动物管理与使用指南。
[0061 ] I/R损伤和梗死面积测量
[0062] 如前所述的成年小鼠 Ripk3v-及其WT同窝对照小鼠（C57B6背景，12-16周龄）。如前 所述进行I/R手术，以及风险面积和梗死面积测量。
[0063] 使用戊巴比妥(70mg/kg，i.p.)麻醉小鼠，通过气管造口术使用哈佛啮齿动物呼吸 机控制呼吸。进行中线胸骨切开术，并在冠状动脉左前降支周围放置可逆圈套封堵器。心肌 I/R通过收紧圈套30min，随后放松(再灌注)4h或8周进行诱导。再灌注结束时，处死动物，采 集血液样本进行LDH测量。使用心脏进行梗死面积测量和病理学分析。
[0064] 如前所述进行血清LDH和梗死面积测量。对于LDH，采集血液样本并3,000rpm离心 10min以获取血清。如前所述使用Sigma试剂盒通过分光光度法测定LDH。
[0065]为测量梗死面积，在终点时，使用戊巴比妥钠（100mg/kg i .p.至起效)麻醉动物并 进行肝素化(400USP 1]/1^，1.?.)。切下心脏并在升主动脉插管(远端连接主动脉窦），随后 逆向灌注0.05%阿尔新蓝以显示风险面积。使用阿尔新蓝灌注前，在闭塞处将冠状动脉重 新封堵。随后，在_80°C将心脏冷冻10min并切片(5-6片/心脏），随后在含1 % 2，3，5-氯化三 苯基四氮唑的磷酸盐缓冲液中孵育15分钟，显示出未染色的梗死区域。使用NIH的Image J软 件通过平面几何测定梗死和左心室面积。梗死面积计算方法为梗死区面积除以风险面积 (IF/AAR)。
[0066] 使用戊巴比妥(40mg/kg，i ·ρ·)麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠（8周龄），通过气管 造口术使用哈佛啮齿动物呼吸机控制呼吸。进行中线胸骨切开术，并在冠状动脉左前降支 周围放置可逆圈套封堵器。心肌I/R通过收紧圈套45min，随后放松24h进行。切下心脏进行 免疫组化。
[0067] 体内KN-93处理
[0068] 腹腔注射（丨.？.）咖-93(1(^111〇1/1^;1^11丨？〇代，422711)或等量生理盐水，和151^11 后，小鼠接受30-min缺血随后进行4-h再灌注。此后处死小鼠进行心脏I/R损伤的评估。 [0069]为评估其对Dox诱导心脏损伤的影响，于Dox处理(20mg/kg，i.p.)当日开始进行每 日一次KN-93注射（10ym 〇l/kg，i . p.)或等量生理盐水注射，持续7天。随后通过超声波心动 描记术评估心脏功能。
[0070] 超声波心动描记术
[0071] 如前所述，使用戊巴比妥(70mg/kg，i.p.)和麻醉小鼠，并进行超声波心动描记术。 [0072]确定细胞膜对EBD的通透性
[0073] 将EBD溶于生理盐水（10mg/ml)，腹腔内注射（100(g/g体重），14h后小鼠接受30-min 缺血和 4-h 再灌注 ，或 Dox 处理 (20mg/kg)。随后处死动物 ，获得心室肌并使用 0CT( 最佳切 削温度化合物）（Sakura)包埋，在液氮中速冻，并切为5-μπι冰冻切片。使用抗CaV3抗体 (Abcam，ab2912)进行免疫组化，使用共聚焦显微镜(LSM700，Zeis S)对切片进行成像。
[0074] 大鼠心室肌细胞的分离、培养和腺病毒感染
[0075] 从1日龄大鼠中分离新生大鼠心室肌细胞(NRVMs)，通过之前所述方法进行腺病毒 介导的基因转移。前期得到了表达RIP3的新病毒载体。Ad-CaMKII-DN(使用丙氨酸(K43A)替 代CaMKIlSC的43号赖氨酸残基）。
[0076] T287A(p-CaMKII 突变）和 M281/282V(ox-CaMKII 突变）突变的 CaMKlUcDNA 为 Mark Anderson博士所赠。T287A/M281/282V CaMKII突变和K51A RIP3突变(51号赖氨酸残基被丙 氨酸取代)分别在CaMKII-SM281/282V和大鼠 WT RIP3结构(RIP3-HA)上，使用定点突变试剂 盒（QuikChange II，Stratagene)的点突变产生。表达这2种突变的慢病毒由SinoGenoMax Co.，Ltd.构建。
[0077] 如前所述进行心肌细胞H/R。为诱导心肌细胞缺氧，在RPMI 1640/10%胎牛血清 (FBS)培养基中培养NRVM 48h。随后将培养基换为95%N2/5%C02饱和的无血清RPMI 1640， 将细胞置于37°C95%N2/5%C02饱和的密闭箱中不同时间(氧气浓度<0.1%)(0hmeda氧气监 测器，5120型）。常氧控制时，将培养基换为RPMI 1640/10 %FBS，分析前将细胞置于37°C/ 5 % C〇2培养箱培养3-24h。
[0078] 心脏CaMKII激活的评估
[0079] 心脏CaMKII激活通过其磷酸化和氧化水平进行评估。对于I/R诱导的CaMKII活化， 切下Ripk3 V〃j、鼠及其WT同窝雄性小鼠的心脏，并使用Langendorf f设备进行灌注。全心缺 血通过停止灌流30min，随后再灌注5min(氧化)或2h(磷酸化)进行诱导。随后均质化心脏进 行免疫印迹。
[0080] RIP3的无细胞激酶活性测定
[0081 ] 无细胞激酶活性测定在含lOOmM Tris-HCL，pH 7.5、20mM MgCl2和4mM DTT的激酶 缓冲液中进行。将有或无200yMCaCl2和ΙμΜ CaM(Sigma)的商业化人CaMKII-δ蛋白（Abeam) 于冰上孵育lmin，10mM EGTA中孵育lOmin，随后如图指示，在有商业化人RIP3(Abcam)或牛 血清白蛋白（BSA)的情况下于30°C暴露于ImM ATP lOmin或30min。加入SDS上样缓冲液终止 反应。将样本煮沸5min，使用SDS-PAGE分离。使用抗磷酸化(T287)和总CaMKII的商业化抗 体进行印迹。
[0082] 心脏组织学
[0083] 在4%多聚甲醛(pH 7.4)中过夜固定心脏，石蜡包埋，5μπι连续切片。对这些切片进 行标准苏木精伊红染色或免疫组化。
[0084] 心脏活性氧(ROS)测量
[0085]使用二氢乙锭(DHE)原位染色评估心脏ROS生成情况。小鼠接受30-min缺血后15-min再灌注，或24-h Dox处理(20mg/kg，i . p.)。采集心脏，OCT包埋并用液氮中冷冻。在低温 槽上切为14μπι的横截面切片，并置于载玻片上。使用·Ε(5μΜ)于37°C孵育样本15min，避光。 磷酸盐缓冲液冲洗后，使用Zeiss共聚焦显微镜(LSM700)获得图像。使用Image J对心脏切片 的DHE荧光进行定量。
[0086] 使用细胞渗透性指示剂5_(和-6)-氯甲基-2,7-二氯二氢荧光素二乙酯⑶皿-H2DCFDA，DCF，Invitrogen Canada Inc.)用于评估培养NRVM中的R0S生成。使用Μ0Ι为 100的 Ad-RIP3感染NRVMs 241UPBS冲洗后，将细胞于ΙΟμΜ DCF中孵育30min，在完全生长培养基中 恢复15min，并再次使用PBS冲洗。使用激光扫描系统(LSM 700，Carl Zeiss)以483nm激发和 520nm发射波长测量荧光，并使用Image J软件分析。
[0087] 免疫印迹和共聚焦免疫细胞化学成像
[0088] 如之前所述进行了免疫印迹和共聚焦免疫细胞化学成像。
[0089] 细胞活性测定
[0090] 通过此前所述的ATP检测评估心肌细胞坏死。使用Sigma试剂盒通过分光光度法检 测培养基中LDH的浓度。如前所述，使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐 (MTT)检测测量细胞活性 56。如前所述进行DNA梯度电泳。
[0091 ] TUNEL 染色
[0092] 使用CardioTACSTM原位凋亡检测试剂盒（罗氏应用科学，Cat .#11684795910)进行 TUNEL染色。
[0093] Caspase 3活性测定
[0094] 使用Promega(Cat · #G8091)的试剂盒按照生产商指示测量Caspase 3活性。
[0095]线粒体膜电位（Δ ΨΜ)评估
[0096] 将细胞与Δ 敏感染料四甲基罗丹明乙酯（TMRM)(Calbiochem) -同孵育（10ηΜ， 37°C孵育15min)以测量心肌细胞Δ 。使用激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss LSM700)于 543nm激发和>560nm发射波长获取TMRM图像。使用ImageJ对TMRM荧光强度和TMRM阳性区域 进行定量。
[0097] 为测定I/R对心肌Δ 影响，WT和Ripk3V-小鼠的心脏经Langendorff灌注后首 先接受I/R(30-min缺血随后Ι-h再灌注）。随后使用碧云天生物技术公司的商业化试剂盒 (Cat. #C3606)从心脏中分离出线粒体。按照生产商实验方案使用试剂盒（碧云天，Cat. # C2006)进行JC-1染色，以测定Δ 。使用同样的实验方案评估Dox给药（2〇11^/1^，1?.)后 WT和Ripk3-Λ小鼠的心肌Δ Ψη。
[0098]通过RNA干扰进行基因沉默
[00"] 对于基因沉默的检测，使用Invitrogen的网站设计了含19个核苷酸的siRNA，每个 3'末端均为dTdT悬垂。使用Lipofectamine? RNAiMAX(Invitrogen)按照生产商指示进行 s iRNA转染心肌细胞。s iRNA转染72h通过免疫印迹评估基因沉默的效率。
[0108] 实时定量PCR
[0109] 实时定量PCR使用了以下引物对：18S RNA，5'-GGA AGG