专利名称：涉及作为心脏衍生的心肌抑制因子的巨噬细胞迁移抑制因子(mif)的治疗和生物测定方法
涉及作为心脏衍生的心肌抑制因子的巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的治疗和生物测定方法
技术领域：
本发明得到了由国家卫生研究院授予的基金号R01GM58863的政府支持。政府可具有本发明的某些权利。
本申请是基于2003年8月四日提交的美国临时申请60/498，659，2004年2月 25日提交的60/547,0 , 2004年2月25日提交的60/547，056，2004年2月25日提交的 60/547，057，2004 年 2 月 25 日提交的 60/547，059，和 2004 年 3 月 26 日提交的 60/556，440， 每一篇的完整内容在这里为所有目的引作参考。
发明背景发明领域
本发明总地涉及脊椎动物物种中涉及细胞因子和其它细胞信号转导机理的病理学和生理学，以及涉及细胞因子和其它细胞信号转导机理的诊断试验。本发明的其它方面涉及作为心肌抑制因子和作为体内内毒素-诱发的心脏功能障碍的介质的巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)。本发明的其它方面涉及调解和/或抑制MIF的生产或活性，以及治疗和预防心脏功能障碍、败血症、烧伤或与烧伤相关的其它状况的化合物、组合物和方法。本发明的其它方面涉及LPS攻击后从心脏、肝和脾的MI F释放和TNF受体I/II信号转导的作用。 本发明的其它方面涉及不依赖于TNF受体I/II信号转导的MIF向血清中的释放。本发明的其它方面涉及CD 74在心肌细胞上的表达和它对心脏功能障碍的介导。技术背景
巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是多能的、促炎性的细胞因子，在过去的四十多年来，已经仔细地考查了它的作用机理。本领域目前有关MIF的理解包括指向下述的研究 它作为三聚体的结晶，它的生理上有关的低聚状态；它的推定的膜受体；和它作为互变异构酶和氧化还原酶的细胞内酶活性的生理相关性。
许多研究已经证实，MIF在许多疾病中有重要作用，象类风湿性关节炎(M. Leech, 等， “Macrophage Migration Inhibitory Factor in Rheumatoid Arthritis Evidence of Proinflammatory Function and Regulation by Glucocorticoids ", Arthritis Rheum,42,1601-1608(1999), M. Leech, φ, “ Involvement of Macrophage Migration Inhibitory Factor in the Evolution of Rat Adjuvant Arthritis ", Arthritis Rheum. ,41,910-917(1998), A.Mikulowska,等，“Macrophage Migration Inhibitory Factor is Involved in the Pathogenesis of Collagen Typell-Induced Arthritis in Mice “，J. Immunol.，158，5514-5517 (1997))，迟发型超敏反应 (J. Bernhagen,等， "An Essential Role for Macrophage Migration Inhibitory Factor in the Tuberculin Delayed-Type Hypersensitivity Reaction " , J.Exp. Med.,183,277-282(1996), H. Y. Lan, φ, “ De Novo Renal Expression of Macrophage Migration Inhibitory Factor During the Development of Rat CrescenticGlomerulonephritis'7，Am. J. Pathol.，149，1119-1127 (1996)，Η· Y. Lan，等，“Macrophage Migration Inhibitory Factor Expression in Human Renal Allograft Rejection"， Transplantation，66，1465-1471 (1998)，H. Y. Lan,等， “TNF-Alpha Up-Regulates Renal MIF Expression in Rat Crescentic Glomerulonephritis “，Mol. Med.，3， 136-144(1997)， Τ.Shimizu，等， “Increased production of Macrophage Migration Inhibitory Factor by PBMCs of Atopic Dermatitis “，J. Allergy Clin.Immunol., 104，659-669 (1999))，炎性肺病(S. C. Donnelly，等，“Regulatory Role for Macrophage Migration Inhibitory Factor in Acute Respiratory Distress Syndrome “ ， Nat. Med. , 3, 320-323 (1997), H. Makita,等, “Effect of Anti-Macrophage Migration Inhibitory Factor Antibody on Lipopolysaccharide-Induced Pulmonary Neutrophil Accumulation “，Am. J. Respir. Crit.Care Med.，158，573-579 (1998)，A. G.Rossi, 等，“Human Circulating Eosinophils Secrete Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF). Potential Role in Asthma “，J. Clin. Invest.，101，2869—2874(1998))， 癌症(J. Chesney,等，“An Essential Role for Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) in Angiogenesis and Growth of a Murine Lymphoma “，Mol. Med.，5， 181-191(1999)，M.T. del Vecchio，等，“Macrophage Migration Inhibitory Factor in Prostatic Adenocarcinoma-Correlation with Tumor Grading and Combination Endocrine Treatment-Related Changes 〃，Prostate，45，51-57(2000)，J.D.Hudson， 等， “AlProinflammatory Cytokine Inhibits p53Tumor Suppressor Activity “， J. Exp. Med.，190，1375-1382 (1990)，A. Kamimura，等，“Intracellular Distribution of Macrophage Migration Inhibitory Factor Predicts the Prognosis of Patients with Adenocarcinoma of the Lung “，Cancer，89，334-341(2000)，K. Meyer-Siegler, 等， “Increased Stability of Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) in DU-145Prostate Cancer Cells “ , J. Interferon Cytokine Res. ,20,769-778(2000), T. Shimizu，等，“High Expression of Macropha ge Migration Inhibitory Factor in Human Melanoma Cells and Its Role in Tumor Cell Growth and Angiogenesis“， Biochem. Biophys. Re s. Commun.，264，751-758 (1999)，Takahashi，等， “Involvement of MacrophageMigration Inhibitory Factor(MI F) in the Mechanism of Tumor Cell Growth “，Mol. Med.，4，707-714 (1998))，心肌梗塞(Μ. Takashashi,等，“Elevation of Plasma Levels of Macrophage Migration Inhibitory Factor in Patients with Acute Myocardial Infarction “ , Am. J. Cardiol. ,89,248-249(2002), M. Takahashi, 等，“Macrophage Migration Inhibitory Factor as a Redox-Sensitive Cytokine in Cardiac Myocytes , Cardiovasc Res. , 52,438-445 (2001), C. M. Yu, “ Elevation of Plasma Level of Macrophage Migration Inhibitory Factor in Patients with Acute Myocardial Infarction，Am. J. Cardiol.，88，774-777 Q001))，和败血症性休克 (J· Berhnagen，等，〃 MIF is a Pituitary-Derived Cytokine that Potentiates Lethal Endotoxaemia “，Nature，365，756-759(1993)，Μ· Bozza，等， “Targeted Disruption of Migration Inhibitory Factor Gene Reveals Its Critical Role in Sepsis “， J. Exp. Med. 189, 341-346 (1999), T. Calandra,等,“MIFas a Glucocorticoid-1 nduced Modulator of Cytokine Production “ , Nature,377,68-71 (1995), Τ. Caland ra, 等，“Protection from Septic Shock by Neutralization of Macrophage Migration Inhibitory Factor " , Nat. Med. ,6,164-170(2000), T. Calandra,等，“Macrophage Migration Inhibitory Factor is a Critical Mediator of the Activation of Immune Cells by Exotoxins ofGram-Positive Bacteria " , Proc. Natl. Acad. Sci. USA,95, 11383-11388(1998))。有一些证据证实，单克隆的或多克隆的抗-MI F抗体可能影响败血症的病理学，然而尚未在人类中穷尽地表征它们的作用。但是，在败血症性休克的过程中，MIF在动物和人的血浆中增多，并且单克隆或多克隆抗体对MIF活性的封闭，能导致患有实验诱导败血症的动物的存活率显著提高(MBozza，等，‘‘Targeted Disruption of Migration Inhibitory Factor Gene Reveals Its Critical Role in Sepsis", J. Exp. Med. 189, 341-346 (1999), T. Calandra,等，“Protection from Septic Shock by Neutralization of Macrophage Migration Inhibitory Factor " , Nat. Med. , 6, 164-170(2000)) ο
已经用许多抑制剂证实了对MI F活性的封闭。如2002年8月23日提交的目前未决的美国专利申请系列号10/2 ，299所述，已经用多种化学化合物证实了对MIF酶活性的封闭。也参见，例如，美国专利号6，492，428。如美国专利号6，030，615所述，还已经使用抗体来封闭MIF活性。使用1996年10月M日提交的目前未决的美国专利申请系列号08/738，947或美国专利号6，268, 151公开的反义技术，也可以抑制MIF表达，美国专利号6，268, 151另外证实了可以与所有上述的MIF抑制剂一起使用的药物制剂。
脂多糖(LPQ能抑制固有的心肌收缩性，且认为其对于发生在败血症和败血症性休克中的心肌功能障碍是重要的(A.M. Lefer，“ Mechanisms of cardiod印ression in endotoxin shock" ,Circ Shock Suppl 1 1-8(1979), J. E. Parrillo," Acirculating myocardial depressant substance in humans with septic shock. Septic shock patient swith a reduced ejection fraction have a circulating factor that depresses in vitro myocartdial cell performance " , J.Clin.Invest.76 1539-1553 (1985), J. M. Reilly,等，〃 A circulating myocardial depressant substance is associated with cardiac dysfunction and peripheral hypoperfusion(lactic acidemia)in patients with septic shock “，Chest. 95 :1072-1080(1989))。在 LPS 攻击后，会释放出许多促炎性的细胞因子，已经证实它们能直接介导观察到的心脏功能障碍，包括TNF-α，I L-I β，IL-6，IL-18，NO和巨噬细胞迁移抑制因子(MIF) (0. Court, 等，“Clinical review :Myocardial depression sepsis and septic shock" , Crit. Care 6 :500-508(2002), L. B. Garner,等，"Macrophage Migration Inhibitory Factor is a caridac-derived myocardial depressant factor" , Am. J. Physiol Heart Circ Physiol,285 :H 2500-2509(2003), S. Krishnagopalan, φ, “ Myocardial dysfunction in the patient with sepsis" , Curr. Opin. Crit. Care 8:376—388(2002))。最近，我们在亚致死量的内毒素攻击(内毒素中毒)的模型中，描述了巨噬细胞迁移抑制因子(MIF) 作为心脏衍生的心肌抑制因子(L. B. Garner，等，“Macrophage Migration Inhibitory Factor is a cardiac-derived myocardial depressant factor" , Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol 285 :H2500_2509 (2003))。LPS攻击诱导了促炎性的细胞因子MIF的组成性存在，到12小时最大释放。在该模型中MIF的释放与显示MIF介导的心脏功能障碍平行，其在LPS攻击后延迟。抗-MIF抗体对MIF的中和，导致了显著的保护，在8小时开始且到 48 小时完全消除((L. B. Garner，等，“Macrophage Migration Inhibitory Factor is a cardiac-derived myocardial depressant factor" , Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol285 =H 2500-2509 (2003))) 0在前述的细胞因子中，在它的延迟释放和阻断下游介质的能力方面，MI F是独特的。
研究人员以前已经报道了心肌中的TNF-α水平和在内毒素血症过程中发生的收缩功能障碍之间在时间上的不一致性(X.Meng，等，‘‘TNF-alpha and myocardial depression in endoxtoxemic rats :temporal discordance of an obligatory relationhship" ,Am. J. Physiol 275 :R502_508 (1998))。也就是说，在 TNF-α 水平恢复到基线之前，心脏功能障碍不会发生，表明TNF-α是其它心脏抑制剂的重要标记信号，所述的心脏抑制剂能更直接地协同作用，造成败血症中的功能障碍。尚不清楚这些早期细胞因子的重要性，但是，已经在人实验中测试了针对败血症性休克的早期介质的治疗策略(例如抗-IL-Ιβ和抗-TNF-α模态)，没有观察到益处，可能是由于它们在该疾病过程中的较早出现(C· J· Fisher，等，〃 Recombinant human inerleukin 1 receptor antagonist in the treatment of patients with sepsis syndrome. Results from a randomized, double-blind， placebo-controlled trial “ ， Phase IIIrhIL-Ira Sepsis Syndromve Study Group, Jama,271 :1836-1843(1994)，C· J· Fisher，等，〃 Initial evaluation of human recombinant interleukin-lreceptor antagonist in the treatment of sepsis syndrome :a randomized，open-label，placebo-controlled multicenter trial“，The IL-IRA Sepsis Syndrome Study Group,Crit. Care Med. ,22 12-21 (1994)，C. Natanson， 等， “Selected treatment strategies for septic shock based on proposed mechanisms of pathogenesis “，Ann. Intern. Med.，120 :771-783 (1994)，K. Reinhart， 等，“Anti-tumor necrosis factor therapy in sepsis :update on clinical trials and lessons learned"，Crit. Care Med.，29 :S121_125(2001))。
巨噬细胞迀移抑制因子(MI F)也参与几种疾病的发病机理，包括败血症。MIF能对抗糖皮质激素的抗炎作用，且也能显著改变组织代谢。尽管MIF似乎是普遍表达的，目前没有出版物表明MIF是否在体内在心肌中表达，或者在败血症的过程中，MIF从心肌或其它组织的释放是否能负面地影响心脏性能。
在败血症过程中的心脏功能障碍(0. Court，等，“Clinical review Myocardial depression sepsis and septics hock 〃，Crit. Care,6 :500-508(2002)， S.Krishnagopalan，等，“Macrophage Dysfunction in the Patient with Sepsis"， Curr. Opin. Crit. Care, 8, 376-388 (2002))与人(P.Amimnn，等， “Elevation of Troponin I in Sepsis and Septic Shock"，Intensive Care Med·，27，965-969(2001)， C. N. Sessler, 等， “New Concepts in Sepsis “，Curr. Opin. Crit. Care，8， 465-472(2002))和动物模型(Μ· Bozza，等，“Targeted Disruption of Migration Inhibitory Factor Gene Reveals Its Critical Role in Sepsis"，J.Exp. Med. ,189, 341-346 (1999)，T· Calandra，等，” Protection from Septic Shock by Neutralization of Macrophage Migration Inhibitory Factor/r , Nat. Med. , 6,164-170 (2000)) 43 ^ 后果相关。以前已经证实，败血症或烧伤伴随的心脏功能障碍主要是由于循环心肌抑制因子，包括 TNF-α (B. P. Giroir,等，“Inhibition of Tumor Necrosis Factor Prevents Myocardial Dysfunction During Burn Shock"，Am. J. Physiol.，267，H118-H124(1994)， Ha udek,等， "Differential Regulation of Myocardial NF Kappa B Following Acute or Chronic TNF-Alpha Exposure"，J.Mol.Cell Cardiol. ,33,1263-1271 (2001), A. Kumar,等，"Tumor Necrosis Factor Alpha and Interleukin IBeta are Responsible for in vitro Myocardial Cell Depression Induced by Human Septic Shock Serum“， J. Exp. Med.，183,949-958(1996))。但是，由于TNF-α是标记性的快速响应细胞因子，且在分辨心肌功能障碍之前数天或周就从循环中消失，仍然需要发现是否可能存在其它的心肌抑制蛋白。
以前的使用活细菌的研究，通过直接腹膜内地注射大肠杆菌或通过盲肠结扎和穿刺(CLP)，已经证实了 MIF血浆和/或腹膜液水平在攻击后几小时增加，且针对MIF的抗体能保护小鼠免于致命的细菌性腹膜炎(T.Calandra，等，‘‘Protection from Septic Shock by Neutralization of Macrophage Migration Inhibitory Factor" , Nat. Med., 6，164-170 (2000))。另外，当晚至感染发作后8小时施用抗体时，能保护小鼠(T. Calandra, 等，“Protection from Septic Shock by Neutralization of Macrophage Migration Inhibitory Factor"，Nat. Med.，6，164-17(^2000))。
MIF具有许多令它在细胞因子中与众不同的性质。MIF能从许多细胞类型中预形成释放，包括淋巴细胞、巨噬细胞和脑垂体前叶(J. Bernha gen，等，“Regulation of the Immune Response by Macrophage Migration Inhibitory Factor :Biological and Structural Features"，J. Mol. Med.，76，151—161 (1998)，T. Calandra，等，“Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) :AGlucocorticoid Counter-Regulator Within the Immune System" ,Crit. Rev. hnmunol. ,17,77-88(1997), S. C. Donnelly,等，〃 Macrophage Migration Inhibitory Factor :A Regulator of Glucocorticoid Activity with a Critical Role in Inflammatory Disease " , Mol. Med. Today,3,502-507(1997), R.A. Mitchell,等，"Tumor Growth-Promoting Properties of Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) “，Semin. Cancer Biol.，10，359-366 (2000))。但是，MIF 的来源清单继续增长，且包括其它组织，例如肺、肝、肾上腺、脾、肾、皮肤、肌肉、胸腺、皮肤和睾丸(M. Bacher,等，“Migration Inhibitory Factor Expression in Experimentally Induced Endotoxemia " , Am. J.Pathol. ,150,235-246 (1997), G. Fingerle-Rowson, 等， "Regulation of Macrophage Migration Inhibitory Factor Expression by Glucocorticoids in vivo"，Am. J. Pathol，162，47-56 (2003))。MIF 至少具有 2 种不同的催化活性互变异构酶和氧化还原酶活性。为此，已经开发了 MIF互变异构酶活性的药理学抑制剂，用于治疗MIF-相关的疾病，例如败血症，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，哮喘，特应性皮炎，类风湿性关节炎，肾病，和癌症(A.Dios，等，“Inhibition of MIF Bioactivity by Rational Design of Pharmacological Inhibitors of MIF Tautomerase Activity", J. Med. Chem. , 45, 2410-2416 (2002), M. Orita, φ, “ Macrophage Migration Inhibitory Factor and the Discovery of Tautomerase Inhibitors " , Curr. Pharm. Des. ,8, 1297-1317 (2002))。已经证实，这些疾病能从抗-MIF抗体获益。
几项研究表明，MIF可能通过直接的和间接的机理发挥作用。以前的研究已经提供证据，MIF能促进其它促炎性细胞因子的释放和药效学作用。能表达反义MIF cDNA(导致较少的内源性MIF)的巨噬细胞分泌/表达明显更少的TNF- α，IL-6和Ν0，而LPS会引起NF-kB活性的降低04)。因此，MIF好像直接与LPS信号转导途径相互作用(H. Lue， 等，“Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) :Mechanisms of Action 禾口 Role in Disease" ,Microbes Infect. , 4,449-460 (2002)) 另外，如 2002 年 12 月 19 日提交的美国专利申请号(代理案卷号9551-095-27)所证实的，对致死量的LPS有抗性的MI F敲除的(MIH(O)小鼠具有比处于基线的野生型小鼠更低的TNF-α循环血浆水平。经LPS攻击， 它们表现出循环TNF-α浓度的减小，一氧化氮(NO)浓度增加，IL-6和IL-12浓度未改变 (M.Bozza,等，〃 Targeted Disruption of Migration Inhibitory Factor Gene Reveals Its Critical Role in Sepsis"，J. Exp. Med. 189，341-346 (1999))。尽管 MIF 似乎能促进促炎性细胞因子，已经证实了 MIF的效果以独立于TNF-α的方式起作用。当在TNF-α敲除的小鼠中进行CLP时，与野生型小鼠的0%生存率相比，在施用了抗-MIF抗体的小鼠中观察至Ij了 60%生存率(Τ. Calandra，等，"Protection from Septic Shock by Neutralization of Macrophage Migration Inhibitory Factor" ，Nat. Med. ，6，164—170(2000))。
关于与败血症无关的心脏功能障碍，还已经在急性心肌梗塞后的患者中描述 了升高的血清 MIF 浓度(M. Takahashi，等，“Elevation of Plasma Levels of Macrophage Migration Inhibitory Factor in Patients with Acute Myocardial Infarction " , Am. J. Cardiol. ,89,248-249(2002), M. Takahashi,等，“Macrophage MigrationInhibitory Factor as a Redox-Sensitive Cytokine in CardiacMyocytes “,Cardiovasc Res. , 52,438-445 (2001), C. M. Yu, φ, “ Elevation of Plasma Level of Macropha ge Migration InhibitoryFactor in Patients with Acute Myocardial Infarction “，Am. J. Cardiol.，88，774-777 Q001))，生理相关性至今未知。类似地，已经注意到培养的心肌细胞能释放MIF，作为对缺氧和过氧化氢(自由基引发剂)的响应，但是对血管紧张肽II，内皮缩血管肽-1，IL-Ιβ，或TNF-α无响应(J. Fukuzawa， 等， “Contribution of Macrophage Inhibitory Factor to Extracellular Signal-Regulated KinaseActivation by Oxidative Stress in Card iomyocytes", J. Biol. Chem.，277，24889-24895，M. Takahashi，等，"Macrophage Migration Inhibitory Factor as a Redox-Sensitive Cytokine in Cardiac Myocytes" ,Cardiovasc Res. ,52, 438-445(2001))。存在许多能潜在地触发心肌的MIF释放、从而负面地影响心脏功能的临床情况。心脏功能障碍可通过心肌细胞和心脏组织的任何异常的状况得以表现。这样的功能障碍通常包括但不限于心肌炎，心内膜炎，心包炎，风湿性心脏病，心肌梗塞，心律失常， 纤颤，心原性休克，局部缺血，肥大，心肌病，心绞痛，心脏杂音或心悸，心脏病发作或心力衰竭，和与先天性心脏病有关的任何症状或缺陷。
巨噬细胞迁移抑制因子能在许多器官中表达，包括心脏，且已经与内毒素中毒鼠模型中的延迟的心脏功能障碍相联系(Garner，等，“Macrophage Migration Inhibitory Factor is A Cardiac-Derived Myocardial Depressant Factor" , Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol, 258, H2500-H 2509 (2003))
烧伤会导致包含降低的心输出量、休克和左心室衰竭的心脏损伤和收缩功能障石导(J. T. Murphy,等， “Evaluation of Troponin-Ias An Indicator of Cardiac Dysfunction After Thermal Injury,45,700-704, (1998)，Ε. M. Reynolds，等，“Left Ventricular Failure Complicating Severe Pediatric Burn Injuries" , J. Pediatr. Sur g. 30,264-269 ；discussion 269-270(1995) , W. C. Shoemaker,等，k “ Burn Pathophysiology In Man. I. SequentialHemodynamic Alterations, J. Surg. Res. ,14, 64-73 (1973), R.R.Wolfe,等， "Review :Acute Versus Chronic Response to Burn Injury"，Circ. Shock, 8,105-115 (1981)) 0已经报道，这些收缩缺陷早在烧伤后2小时就出现(J. W. Horton,等，“Postbum Cardiac Contractile Function and Biochemical Markers of Postburn Cardiac Injury “，J. Am. Coll. Surg.，181，289—298(1995))。一些近期的研究已经阐明了早期的分子事件，其涉及对肠衍生的因子作出响应的内毒素信号转导途径,包括 toll-样受体 4 (Tlr-4)，I RAK，和 NF_kB (D. L. Carlson，等，“I Kappa B Overexpression in Cardiomyocytes Prevents NF-Kappa B Translocation and Provides Cardioprotection in Trauma " , Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol,284, H804-814(2003), J. T. Sambol," Burn-Induced Impairment of Cardiac Contractile Function is Due to Gut-Derived Factors Transported in Mesenteric Lymph ", Shock，18，272-276U002)，J. A. Thomas，等，“IRAK Contributes to Burn-Triggered Myocardial Contractile Dysfunction " , Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. ,283, H829-836U002)，J. A. Thomas，等，〃 TLR4Inactivation and rBPI (21) Block Burn-Induced Myocardial Contractile Dysfunction " , Am. J.Physiol. Heart Circ.Physiol. ,283, H1645-1655(2002))。
尽管通过Tlr-4受体内毒素信号转导代表着烧伤伴随的心脏功能障碍的初始途径，其它研究人员已经证实，早期的下游介质包括TNF-α，IL-Ιβ，和IL_6(H.Lue， 等，“Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) :Mechanisms of Action 禾口 Role in Disease"，Microbes Infect. ,4,449-460 (2002)) 在实验中，当阻断 TNF-α 时，会减轻烧伤伴随的心脏功能障碍，强调了它作为功能障碍的关键调节剂的重要性(B. P. Giroir, 等，“Inhibition of Tumor Necrosis Factor Prevents Myocardial Dysfunctional During Burn Shock"，Am. J. Physiol.，267，H118-124 (1994))。当在人实验中测试针对败血症性休克的早期介质的治疗方案(例如抗-ILl β和抗-TNF-ex模态)时，没有观察到益处，可能是由于它们在该疾病过程中的较早出现(C. J.Fisher，等，“Recombinant human inerleukin lreceptor antagonist in the treatment of patients with sepsis syndrome. Results from a randomized, double-blind，placebo-controlled trial“， Phase III rhlL-lra Sepsis Syndromve Study Group， Jama,271:1836-1843(1994)， C· J· Fisher，等，〃 Initial evaluation of human recombinant interleukin-lreceptor antagonist in the treatment of sepsis syndrome :a randomized, open—label， placebo-controlled multicenter trial“ ，The IL-IRA Sepsis Syndrome Study Group, Crit. Care Med.，22 :12-21 (1994)，C. Natanson，等，“Selected treatment strategies for septic shock based on proposed mechanisms of pathogenesis"，Ann. Intern. Med.,120 :771-783(1994), K. Reinhart, “ Anti-tumor necrosis factor therapy in sepsis :update on clinical trials and lessons learned/r , Crit. Care Med. , 29 S121-125(2001))ο
最近，已经证实称作巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的细胞因子在败血症死亡 ￥ Φ ^ # ffl (H. Lue, φ, “ Macrophage Migration Inhibitory Factor(MIF) Mechanisms of Action and Role in Disease" ， Micorbes Infect. ，4，449—460(2002))。 实际上，已经证实抗-MI F疗法能显著提高败血症的致死模型(盲肠结扎和穿刺)中的存活率，甚至在长达损伤后8小时施用时(T. Calandra，等，“Protection From Septic Shock Byneutralization of Macrophage Migration Inhibitory Factor" , Nat. Med., 6,164-170(2000)) ο 另外，已经证实 MIF 在 ARDS (K. N. Lai，等，“Role For Macrophage Migration Inhibitory Factor in Acute Respiratory Distress Syndrome" , J. Patho 1.，199，496-508Q003))-烧伤的普遍并发症(M. Bhatia，等，“Role of Inflammatory Mediators in the Pathophysiology of Acute Respiratory Distress Syndrome ", J. Pathol.，202，145-156 (2004))中起关键作用。此研究的目的则是，使用明确的鼠烧伤模型，鉴别和表征MI F为烧伤伴随的心脏病态的有用治疗靶(Garner，等，“Macrophage Migration Inhibitory Factor is a Cardiac-Derived Myocardial Depressant Factor" , Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. ，285，H2500—2509(2003))。
因此，仍然需要对目前得不到治疗的心脏抑制、心脏功能障碍、烧伤伴随的病态和心脏保护的疗法。
美国专利号6，030，615涉及用于治疗由细胞因子-介导的毒性造成的疾病的方法和组合物。
美国专利号6，420，188涉及用于拮抗MIF活性的方法和组合物，和治疗多种基于该活性的疾病的方法。
美国专利号6，599，938涉及用于拮抗MIF活性的方法和组合物，和治疗多种基于该活性的疾病的方法。
美国专利号6，645，493涉及用于抑制MIF的释放和/或生物活性的组合物和方法。
发明简述
本发明的一个实施方案涉及药物组合物，其对于选自下述的至少一项是有效的 治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包含
有效量的至少一种抗-MI F抗体；和
至少一种药学上可接受的载体。
本发明的另一个实施方案涉及药物组合物，其对于选自下述的至少一项是有效的治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包含
有效量的至少一种抗-⑶74抗体，和
有效量的至少一种药学上可接受的载体。
本发明的另一个实施方案涉及药物组合物，其对于选自下述的至少一项是有效的治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包含
有效量的至少一种抗-TNFR抗体；
有效量的至少一种抗-MIF抗体；和
至少一种药学上可接受的载体。
本发明的另一个实施方案涉及治疗和/或预防对象的心脏功能障碍的方法，该方法包括
给对象施用有效量的至少一种抗-MIF抗体。
本发明的另一个实施方案涉及治疗和/或预防对象中烧伤伴随的心脏功能障碍的方法，该方法包括
给对象施用有效量的至少一种抗-MIF抗体。
本发明的另一个实施方案涉及治疗和/或预防对象的心脏功能障碍的方法，该方法包括
给对象施用有效量的至少一种抗-⑶74抗体。
本发明的另一个实施方案涉及改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能的方法，该方法包括
给对象施用有效量的至少一种抗-MIF抗体。
本发明的另一个实施方案涉及鉴别MIF抑制剂的方法，该方法包括
将至少一个肌细胞暴露于至少一种MIF ；
检测至少一种MIF-相关的肌细胞活性；
将肌细胞暴露于所述的MIF和至少一种候选剂；
检测在有候选剂存在的情况下，MIF-相关的肌细胞活性；和
检测候选剂是否能影响MIF-相关的肌细胞活性。
本发明的另一个实施方案涉及治疗和/或预防急性心肌梗塞后对象中的心脏功能障碍的方法，该方法包括
给对象施用有效量的至少一种抗-TNFR抗体和有效量的至少一种抗-MIF抗体。
本发明的另一个实施方案涉及治疗和/或预防对象的心脏功能障碍的方法，该方法包括
给对象施用有效量的至少一种抗-MIF抗体。
本发明的另一个实施方案涉及治疗和/或预防对象中烧伤伴随的心脏功能障碍的方法，该方法包括
给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种抗-MIF抗体和至少一种药学上可接受的载体。
本发明的另一个实施方案涉及治疗和/或预防对象的心脏功能障碍的方法，该方法包括
给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种抗-⑶74抗体和至少一种药学上可接受的载体。
本发明的另一个实施方案涉及改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能的方法，该方法包括
给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种抗-MIF抗体和至少一种药学上可接受的载体。
本发明的另一个实施方案涉及治疗和/或预防急性心肌梗塞后对象中的心脏功能障碍的方法，该方法包括
给对象施用有效量的组合物，其包含至少一种抗-TNFR抗体，至少一种抗-MIF抗体，和至少一种药学上可接受的载体。
本发明的另一个实施方案涉及用于选自下述的至少一项的方法治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱， 治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包括给所述的对象施用有效量的至少一种选自下述的试剂小分子MIF抑制剂，其盐，其前药，和其组合。
本发明的另一个实施方案涉及用于选自下述的至少一项的方法治疗或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗或预防有此需要的对象中的心脏抑制，和其组合，其包括给需要的对象施用有效量的至少一种抗-TNFR 抗体；和任选地，至少一种药学上可接受的载体。
当结合附图阅读时，能更好地理解前面的描述。为了解释本发明的目的，在附图中显示了一个目前优选的实施方案，但是应当理解，本发明不限于所示的准确安排和手段。
图1 在心脏组织中，在LPS攻击12小时内，检测了 MIF蛋白释放。每个数据点是 3个独立的蛋白印迹实验的平均值(+/_标准误差)。在图下面显示了代表性的蛋白印迹。< 0. 05
图2 =LPS攻击不能上调心脏组织中的MIF mRNA。图中每个数据点是3个独立的 RNA印迹实验的平均值(+/_标准误差)。在图下面显示了代表性的RNA印迹。没有鉴别出时间点之间的显著差异(P > 0. 05).
图3 在LPS攻击之前和之后，MIF存在于心脏、肝和脾中。在LPS攻击后12小时 (B，E，和H)，在心脏、肝和脾(A，D，G)中预形成的MIF减少，且在M小时后(C，F，和1)再补充，如免疫组织化学所证实的。放大率100X(肾，脾)，400X(心脏)。
图4 :rMIF攻击后，在C57BL/6J小鼠和内毒素-抗性的C3H/HeJ小鼠中通过 Langendorff制品测得的心脏功能，证实了 rMIF能以独立于LPS的机理介导心脏功能障碍。 数据代表着每组7(C3H/HeJ)至10(C57BL/6J)个独立的Langendorff实验的平均值。*p < 0. 05.
图5 =LPS和LPS+抗-MIF抗体施用对心脏功能的影响的超声心动图评估。处于基线的和LPS施用后8小时的野生型小鼠中的代表性的M-模式超声心动图，分别是A和B。C 和D分别显示了在8和48小时时LPS+抗-MIF处理的小鼠中的代表性的超声心动图。当处理前给予抗-MIF抗体时，在LPS攻击的小鼠中观察到了心脏功能的显著保护(FS% ) (E)0 数据代表着来自在多个时间点监视的3只小鼠的9个心动周期的平均值。*p < 0. 05.
图6 证实LPS攻击后抗-MIF抗体对MIF的抑制的烧伤模型。烧伤数据证实抗-MIF抗体对MIF的抑制，和在烧伤后恢复心脏功能。
图7 证实热伤后心脏的MIF释放速度的图示。巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)在心脏组织中组成性地表达，且在烧伤后8小时最大释放。每个数据点代表着3个独立的蛋白印迹实验的平均密度，任意单位(A.U.)/mm2士SE。在图下面显示了代表性的蛋白印迹。采用单向ANOVA和使用Tukey方法的多重比较方法，确定了与对照组相比的统计显著性(*p < 0. 05).
图8:证实MI F存在于多种组织样品中的免疫化学染色载玻片。插图G-烧伤后， 组成性地存在于心脏、肝、脾、肺和肾中的MIF减少。在烧伤后8小时，心脏、肾和脾(A，E， I)中的预形成的MI F会减少(B，F，J)，除了肝(M，N)以外，并在M小时时在心脏和肾中增加(C，G)，但是不在心脏或肝中(K，0)，如通过免疫组织化学所证实的。阴性对照(二抗， 没有一抗抗-MI F抗体)一致地证实了，在每个时间点，在研究的每个器官中都不存在背景染色，如最右列所代表的(D，H，L，P)。放大率100X(肾，脾，肝)，400X(心脏).
图9 热伤后，3种不同的细胞因子随时间的浓度变化的图示。图9-烧伤后， MIF(ng/ml)，IL-12(pg/ml)，和IL-6(pg/ml)的血清浓度(分别是A-C)。将数据表达为通过 ELISA测得的6只C57BL/6J小鼠的平均值士SE，并使用单向-AN0VA，以及采用Bonferroni 方法的多重比较方法，进行统计学分析，以确定组间的显著性(与基线相比，*P < 0. 05).
图10 证实热伤后MIF mRNA上调的图示和代表性的RNA印迹。到8小时，烧伤显著上调心脏组织中的MIF mRNA表达。使用与MIF和β -肌动蛋白mRNA互补的32P放射性标记的探针，检测了 MIF和β -肌动蛋白mRNA。每个数据点代表着3个独立的RNA印迹实验的平均密度，任意单位(A. U.)/mm2 士 SE。在图下面显示了代表性的RNA印迹。通过用存在的相对β-肌动蛋白密度乘以MIF密度，确定了标准化的MIF。采用单向ANOVA和使用 Tukey方法的多重比较方法，确定了与基线相比的统计显著性(*ρ < 0. 05).
图11 计算出的冠状动脉血流速度的图示以3种不同方式对比未治疗的热伤和用抗-MI F治疗的热伤的流速的控制测量。烧伤后18小时，通过Langendorff制品测得的心脏功能随冠脉血流量(A)和Ca2+而变化。将心脏功能表达为25个独立的Langendorff实验(11假操作，9烧伤，5抗-MI F处理后的烧伤)的平均值士SE。使用重复测量ANOVA和采用Bonferroni方法的多重比较方法，对随治疗组和冠状动脉血流速度而变的每个LVP， +dP/dtmax，和_dP/dtmax，进行单独的分析，以确定组间的显著性差异(*p < 0. 05).
图12:烧伤后抗-MI F抗体治疗作用的超声心动图和图示，证实了MIF封闭的心脏保护作用。烧伤后抗-MIF抗体治疗作用的超声心动图评估，证实了 MIF封闭的心脏保护作用。A和B分别代表了处于基线和烧伤后8小时的野生型小鼠中的代表性的M-模式超声心动图。C和D分别说明了在4和48小时烧伤+抗-MIF处理的小鼠中的代表性的超声心动图。在烧伤前施用抗-MIF抗体的烧伤小鼠中，观察到了心脏功能的明显恢复(FS% ) (E)0来自每组的数据，代表着来自在多个时间点监视的3只小鼠的9个心动周期的平均值士SE。 将通过超声心动描记术测定的心脏功能表达为缩短分数％ (LVED-LVES/LVED χ 100) 士SE， 并使用单向重复测量-ANOVA和采用Tukey检验的多重比较方法分析，确定特定组之间的显著性差异。
图13 在(A)野生型小鼠，(B)TNFR-/-小鼠，和(C)用Enbre 1 预处理(60分钟)的野生型小鼠中进行-g/kg内毒素攻击后的血清MIF浓度(从基线倍数增加)。将数据表达为(A)6只C57BL/6J小鼠，(B)6只TNFR-/-小鼠，和(C)用Enbrel 预处理的3 只C 57BL/6J小鼠的MIF的基线水平分数(平均值+/_标准误差)。通过ELISA测定了血清水平，并使用单向-ANOVA和采用Bonferroni方法的多重比较方法进行统计学分析，确定组间显著性(与基线相比，*P < 0. 05)。
图14:在心脏组织中进行LPS攻击后，未检测到MI F蛋白释放。每个数据点是3 个独立的蛋白印迹实验的平均值(+/-标准误差)。在图下面显示了代表性的蛋白印迹。*P < 0. 05
图15 在TNFR-/-小鼠中LPS攻击之前和之后，心脏、肝和脾中MIF的存在。在LPS 攻击后12小时出斤，)，在心脏、肝和脾中的预形成的11正仏，0，6)没有降低(而这种现象在野生型小鼠中观察到)，如通过免疫组织化学所证实的。放大率100X (肾，脾)，400X (心脏)。
图16 =LPS攻击不能上调TNFR-/-小鼠心脏组织中的MIF mRNA。图中的每个数据点是3个独立的RNA印迹实验的平均值(+/_标准误差)。在图下面显示了代表性的RNA印迹。没有鉴别出时间点之间的显著差异(P > 0. 05).
图17 在C57BL/6J，B6/129S,和TNFR-/-小鼠中进行rMI F攻击后，通过 Langendorff制品测定的心脏功能，证实了 rMI F能体外介导独立于TNF-α信号转导的心脏功能障碍。数据代表着每组6个(C 57BL/6J)，4个(B6/129S)，和4个(TNFR-/-)独立的 Langendorff 实验的平均值。*p < 0. 05.
图18 =LPS和LPS+抗-MIF抗体施用对TNFR-/-小鼠的心脏功能的作用的超声心动图评估。A和B分别代表了处于基线和LPS施用后4小时野生型小鼠中的代表性的M-模式超声心动图。C和D分别说明了在4和48小时LPS+抗-MIF处理的小鼠中的代表性的超声心动图。当在处理前施用抗-MIF抗体时，在LPS攻击的小鼠中观察到了心脏功能的明显保护(FS%)(E)。数据代表着来自在多个时间点监视的3只小鼠的9个心动周期的平均值。< 0. 05.
图19 :LPS攻击后，野生型和TNFR-/-小鼠中的血清细胞因子测定。在Luminex平台上，测试了炎性细胞因子组的=(A)TNF-Q，(B) IL-β，(C) IFN- y , (D)IL_12，(E)IL-IO,= (F) IL-6，(G) GM-CSFdP IL_2，IL_4，IL_5(未显示数据)。将数据表达为3只独立的实验小鼠在每个时间点的血清细胞因子浓度的平均值+/_标准误差。
图20 有或没有抗-MIF预处理(90分钟)，LPS攻击后野生型中的血清细胞因子测定。显示出了受调制的细胞因子(A) IFN-γ和(B) IL-10，如在Luminex平台上所测定的。 将数据表达为3只独立的实验小鼠在每个时间点的血清细胞因子浓度的平均值+/_标准误差。
图21 对比了仅LAD和抗-MIF+LAD，LAD结扎后的心脏功能(缩短分数)。
图22 显示了仅LAD和抗-MIF+LAD，LAD之前的抗-MIF台疗的效果。
图23 显示了几个治疗组在LAD后48小时的心脏功能数据。
图M 显示了以预先的和延迟的抗-MIF台疗，在LAD后48小时的血清肌钙蛋白浓度。
图25 显示了结扎后2周的血清肌钙蛋白I和MIF浓度。
图沈显示了器官⑶74组成性表达和心脏⑶74在LPS攻击后的表达。
图27 显示了几个组在LPS攻击后从t = 0至t = 48小时的超声心动图/缩短分数。
图观显示了 LPS攻击后的血清s⑶74释放。
图四显示了⑶74系列凝胶。也参见表5。
图30 显示了 CD74K0小鼠的冠状动脉血流速度v. LVP，+dP/dt max,如-dP/dt max ο
图31.显示了对照、小分子MI F抑制剂+DMS0/MI和DMS0/MI的结扎后小时v.缩短分数。
发明详述
从下面的发明详述中，可以更充分地明白、同时更好地理解本发明的各种其它目标、特征和附加的优点，除非另有说明，它无意进行限制。
本发明的一个优选的实施方案涉及治疗和生物测定的方法，其涉及作为心脏-衍生的心肌抑制因子的巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)。
本发明的一个优选的实施方案涉及治疗和/或预防与烧伤相关的心脏功能障碍的方法。
本发明的一个优选的实施方案涉及调制MIF作为对心肌梗塞的治疗。
本发明的一个优选的实施方案涉及在心脏功能障碍中TNF-α的调制。
本发明的一个优选的实施方案涉及通过CD74的抑制进行心脏保护的方法。
本发明的一个优选的实施方案涉及用抗-MIF抗体对MIF进行调制。
本发明的一个优选的实施方案涉及用于鉴别能抑制MIF活性的试剂的生物测定。
本发明的一个优选的实施方案涉及抗-MIF抗体对MIF的抑制和伴随的(烧伤后) 心脏功能的恢复。
本发明的一个优选的实施方案涉及通过施用抗-MIF抗体改善烧伤伴随的心脏抑制的方法。
本发明的一个优选的实施方案涉及通过施用抗-MIF抗体改善急性心肌梗塞后的心脏功能。
本发明的一个优选的实施方案涉及一项发现，即来自心脏、肝和脾的MI F释放依赖于TNF-α受体I/II信号转导，因而TNF-α可以是治疗靶物。
本发明的一个优选的实施方案涉及用重组人TNFR:Fc中和TNF-α。
本发明的一个优选的实施方案涉及用一种或多种抗-MIF抗体中和MIF活性。
本发明的一个优选的实施方案涉及TNF-α作为MIF的上游介质的发现。
本发明的一个优选的实施方案涉及一项发现，即⑶74 (MIF受体)在心肌细胞上表达，且是心脏功能障碍的“关键”介质。
本发明的一个优选的实施方案涉及通过用一种或多种抗-CD74单克隆中和抗体抑制CD74受体，抑制MIF和改善心脏保护。
本发明的一个优选的目标涉及治疗和/或预防心脏功能障碍的方法，例如心肌活性的紊乱或抑制。该方法优选地包括施用有效量的组合物，其包含巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)抑制剂。抑制剂可以是抗体。抑制剂可以影响特定的MIF活性，包括酶活性，例如互变异构酶活性或氧化还原酶活性。
本发明的一个优选的实施方案涉及用于鉴别能抑制MIF活性的试剂的试验。该试验优选地包含体外或体内的肌细胞和MIF，在有和没有可抑制MIF活性的试剂存在的情况下。该试验能分析肌细胞活性，使用免疫化学或超声心动描记术等工具，在有MIF和潜在的抑制剂存在的基础上。
本发明的一个优选的实施方案涉及使用该实验来鉴别能抑制MIF活性的试剂的方法，其包括在有可抑制MIF活性的试剂存在的情况下，放置肌细胞和MIF，并检测对肌细胞活性的作用。肌细胞可以是体外或体内的，且可以使用免疫化学或超声心动描记术测量作用。
本发明人已经发现，MIF是心肌功能障碍的诱导物，已知后者能明显助长人败血症的发病率和死亡率。在人患者和动物模型中，与败血症有关的心脏功能障碍的特征在于，双心室扩张，减少的心脏收缩期收缩性，和减少的心脏舒张期松弛。不希望受理论的约束，认为它的发病机理是多因子的，全身和心肌衍生的细胞因子例如肿瘤坏死因子-a (TNF-a) 参与诱导它的发作。
本申请的一个实施方案指向鉴别MIF或其它的心脏衍生的蛋白是否能通过旁分泌或自分泌机理介导败血症和其它心脏病中的心肌功能障碍。小鼠中的心脏基因表达的筛选微阵列分析表明，MIF在心脏中表达，且在脂多糖(LPQ-攻击后受到有差别的调节。考虑到MIF抑制能改善患有实验性败血症的动物的结果的数据，构建了下面的实施例，来验证心肌细胞是否能体内地表达MIF，内毒素攻击是否能改变该表达，和MIF是否对心脏功能具有生理上重要的作用。本文中的几个实施例证实了体内的心脏MIF表达，并确认MIF能在体内亚致死量的内毒素攻击中抑制心脏功能。
MIF在正常的心肌中组成性地表达，且在内毒素攻击后由心肌细胞释放，在攻击后12小时心脏组织水平达到最低点。在本申请中，通过蛋白印迹和免疫组织化学观察到了能支持延迟释放的证据，证实了在第12小时时从心脏和脾组织明显释放，并得到了以下事实的间接支持从第8小时开始、此后持续的心脏保护作用的延迟发生。用抗-MIF单克隆抗体治疗LPS攻击的小鼠，能显著改善体内的心脏功能，如左心室缩短分数的提高所证实的。
为了进一步证实MIF的心肌抑制作用，用含有一定浓度的重组的MIF(rMIF)的溶液，灌注了分离的搏动的小鼠心脏(Langendorff灌注)。灌注rMIF，导致了对心脏收缩和心脏舒张性能的显著抑制。本发明人已经证实，MIF由心肌细胞体内地合成，并在LPS攻击后释放。因而，MIF能直接介导心脏功能障碍，并证实了 MIF作为药理学靶物用于改善败血症和其它心脏病中的心脏功能。
心脏基因表达的微阵列数据表明，MIF也在心脏组织中表达。本文中的几个实施例表明，MIF灌注能直接体外抑制心脏功能；另外，用针对MIF的2种独立的单克隆抗体中的任一种进行治疗，都能减轻后期的心肌抑制。
本发明的另一个优选的实施方案涉及治疗和/或预防烧伤伴随的状况的方法，包括但不限于心脏功能障碍，例如心肌活性的紊乱或抑制。该方法优选地包括施用有效量的组合物，其包含巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)抑制剂。该抑制剂可以抑制MI F活性和/或 MIF生产。该抑制剂优选地是抗体或蛋白。该抑制剂可以影响特定的MIF活性，包括酶活性，例如互变异构酶活性或氧化还原酶活性。该抑制剂可以抑制或阻断MIF活性或心肌组织中的MIF生产。该抑制剂也可以抑制或阻止MIF释放，例如ABC转运蛋白的抑制剂。
本发明的另一个优选的实施方案涉及用于鉴别能抑制MIF活性或生产的试剂的试验。该试验包含体外或体内的肌细胞，和可能包含MIF，在有和没有能抑制MIF活性或MIF 生产的试剂存在的情况下。该试验将分析肌细胞活性，使用免疫化学或超声心动描记术等工具，在有MIF和潜在的抑制剂存在的基础上。
本发明的一个实施方案在预防/治疗方法和诊断试验中，利用了 MIF在烧伤伴随的心脏功能障碍中的作用。使用鼠烧伤模型(40% TBSA)，本发明人鉴别出了烧伤后8小时组成性的心脏MIF显著减少O. 1倍)，如通过蛋白印迹分析所测定的。在烧伤后4小时，血清MIF达到最大O. 2倍增加)。这些特征与烧伤后从心脏和全身来源的预形成的细胞质储存的MIF释放相一致。如在本文的实施例中观察到的，为了确定MIF在烧伤后的心脏功能障碍中的作用，用抗-MIF中和单克隆抗体预处理了小鼠。从烧伤后4小时开始(并且持续至 48小时)，只有烧伤的小鼠表现出了受抑制的左心室缩短分数百分比(FS% )38. 6+/-1. 8% (假操作的FS% 56. 0+/-2.6% )。抗-MIF处理的小鼠在烧伤后表现出了延迟的改善的心脏功能，到M小时完全恢复功能。这表明，细胞因子MIF能介导晚期的烧伤伴随的心脏功能障碍，还表明，MIF是用于治疗烧伤伴随的心脏功能障碍以及其它MIF介导的并发症(例如与烧伤相关的ARDS)的药理学靶物。
烧伤后，MIF在4小时最大释放到血清中(图9)；组织释放到8小时达到最大(心脏和脾)(图7&8)。当用抗体中和MIF时，到12小时心脏功能显著改善，且到M小时完全改善，这证实了 MIF调制作为烧伤后体内心脏功能障碍的介质(图12)。
在烧伤的小鼠模型中，已经证实LPS能通过它与Tlr-4 (toll-样受体4)的相互作用和与IRAK-I的相互作用，介导相关的心脏功能障碍。由于几种潜在的与烧伤相关的损害，它们包括肠局部缺血，细菌易位，和提高的肠渗透性，认为LPS的来源是肠-衍生的。不希望受理论的约束，认为炎性因子的生产和释放能通过肠有关的淋巴组织变成全身性的。
在亚致死量的内毒素中毒小鼠模型(％ig/kg LPS)中，发现MIF能在体内介导晚期心脏抑制作用。还通过Langendorff试验测得，重组的MIF能以独立于LPS的方式体外地诱导即时的心脏抑制。关于烧伤，本发明的-个实施方案与在内毒素中毒模型中得到的观察相比，适当地具有几个优点。首先，与LPS攻击(8小时)相比，MIF在烧伤模型的更早时间点G小时，图7)释放，且全身的MIF浓度的增加明显更高(2. 2倍增加(图9) vs. 1. 5 倍)。其次，如通过超声心动描记术测得，与内毒素中毒模型相比，心脏功能障碍的程度在烧伤模型中不那么大。关于烧伤，与在4小时时的内毒素中毒模型(67.2FS%-31. 1FS% /67. 2FS%)中的53. 7%相比，本发明人理想地在4小时使缩短分数百分比(心输出量的估计值)从基线降低38% (56. 2FS% -34. 8FS% /56. 2FS% )0根据本发明的一个实施方案的MIF抑制，导致了到M小时完全的心脏保护(图12)，这在内毒素中毒模型中直到48小时才出现，虽然在内毒素中毒模型中在8小时就首次观察到了明显的保护，而在烧伤模型中直到12小时才观察到。这表明，MIF在与烧伤相关的心脏功能障碍中起更大的作用。最后，测得心脏MIF mRNA水平的增加在烧伤中到8小时就显著增加(图10)，而在内毒素中毒模型中直到48小时才增加。尽管已经证实烧伤的心脏作用与肠衍生的LPS相关，有效的损伤比内毒素中毒模型更复杂，因为它涉及皮肤和肠，且是更加生理上相关的疾病过程。
MIF的中和导致了心脏保护，从12小时开始，而早在4小时，就在烧伤的小鼠中鉴别出了明显的心脏功能障碍(图12)。TNF-α，IL-I β，IL-6，和IL-10由心肌细胞分泌， TNF-α和IL-Ιβ是心肌抑制的主要介质。本发明预想它们在发生在MIF介导的心脏功能障碍之前的早期心脏功能障碍中的作用。由于在通过超声心动描记术观察到的抗-MIF治疗的保护作用(12小时)之前(8小时)，MIF局部地从心脏释放出来，本发明预期，MIF在该模型中在更晚的时间点(烧伤后12-48小时)观察到的心脏功能障碍中起显著作用。在 10种全身地研究的其它细胞因子(图9)中，在烧伤后只调制全身的IL-6和IL-12。在前 12小时，全身的IL-12水平显著降低，如已经在手术后的败血症患者中报道的。将该THl细胞因子的降低假设为已经在烧伤中鉴别出的对感染的受损的先天性免疫反应会降低败血症的存活率的一种机理。
已经证实，严重烧伤能造成血浆和心脏丙二醛(MDA)水平的显著增加，它是由组织中的氧化应激产生的脂质过氧化作用的主要产物。另外，已经证实抗氧化剂治疗能减少烧伤中的炎性细胞因子的释放，将炎性反应与增强的氧化应激相关联。以前的研究已经证实，在氧化应激后，从心肌细胞分泌MIF，不希望受理论的约束，这可能是释放MIF的一种机理。H2A启动的氧化应激能导致ERK1/2信号转导途径和蛋白激酶C的活化，其中的后者似乎负责MIF的分泌。因此，心脏中氧化应激的增加，可能会启动预形成的MIF的心脏释放， 这能触发MIF的释放(图7和8)和上调它的转录(图10)，以补充心肌细胞的储存。
大部分细胞因子具有紧密受控的表达，其在刺激后被上调。但是，MIF能以实质性的量预形成存在，且它的表达不仅依赖于重新蛋白合成，而且还来自预先存在的储存，后者由涉及ABC转运蛋白的分泌机理控制。MIF基因不编码N-末端信号序列，后者的作用是将它移位到内质网中。MIF主要位于细胞溶质中的小囊泡中和核中，其被夹断，并且被释放到细胞外。因此，坏死性细胞损伤会导致预先储存的MIF的释放。不希望受理论的约束，由于以前的研究已经清楚地证实，我们的模型中的烧伤包含皮肤坏死，MIF释放可以从皮肤的坏死细胞直接释放，因为已经在皮肤中鉴别出了 MIF，且其定位于表皮的基层。
除了预形成的MIF的坏死性释放以外，已经证实损伤的表皮和成纤维细胞能增加 MIF的表达和分泌。例如，在特应性皮炎中，MIF受到上调，且在该疾病的病理生理学中起关键作用。已经证实，体内地总体UVB暴露能增加MIF生产，表明它参与组织损伤。受损的表皮和培养的成纤维细胞也能增加MIF的表达，这积极地有助于伤口愈合过程。与内毒素中毒模型相比，在该烧伤模型中，由于烧伤的皮肤释放出的MIF等因素，MIF的全身水平可以更迅速地和急剧地增加(在烧伤模型中到4小时增加2. 2倍，而在内毒素中毒模型中到8 小时增加1.5倍)。
已经证实和假设，MIF在ARDS和败血症的肺并发症中起作用。已经证实，抗-MIF 治疗能减少与败血症有关的急性肺损伤中的肺嗜中性粒细胞积累。MIF在肺泡毛细管内皮中和来自ARDS患者的浸润巨噬细胞中表达。已经证实，MIF表达能与TNF-α形成放大环， 有效地将严重的炎症与ARDS中的这2种细胞因子相联系。由于ARDS是烧伤的重要且普遍的并发症，本发明包括抗-MIF治疗，其可以用于除心脏保护适应症外的其它情况，并严重地影响结果。
在细胞因子中，MIF是独特的，因为它具有多种酶活性，包括氧化还原酶和互变异构酶活性。已经证实，抑制它的互变异构酶活性，能对抗已知的MIF活性，例如它的糖皮质激素超越活性。已经为抗-MIF治疗有效的疾病开发出了 MIF互变异构酶活性的药理学抑制剂，例如败血症，哮喘，特应性皮炎，和急性呼吸道综合征(ARDS)。
细胞因子MIF在与烧伤相关的晚期心脏功能障碍中起显著作用。MIF自身是直接的心脏抑制剂，且从心脏中延迟释放。MIF的延迟释放和能潜在地抑制MIF的活性的抑制剂的开发，使MIF成为疾病的潜在靶物，例如与涉及它的心肺作用的发病率和死亡率有关的烧伤。
在本发明的另一个实施方案中，本发明人已经发现，LPS攻击后，从心脏、肝和脾的 MIF释放依赖于TNF受体I/II信号转导。另外，本发明人鉴别出了 MIF独立于TNF受体I/ II信号转导的向血清中的释放。没有TNF受体信号转导，MIF水平似乎稍稍延迟(12-M小时，与在野生型中8小时相比)和轻微增加(1. 7-2. 3倍基线，与在野生型小鼠中1. 5倍增加相比)。另外，TNF受体I/II缺陷的小鼠(TNFR-/-)中的独立于TNF受体的MI F释放足以在LPS攻击后至少M小时介导心脏功能障碍，尽管以前已经在野生型小鼠中鉴别出了缺少组织MIF释放。在TNFR-/-小鼠中鉴别出了早期的心脏功能障碍，不希望受理论的约束，认为可能是由于本发明人已经鉴别出其在该模型中高度表达的已知的介质(IL-Ιβ，IL-6)， 以及其它的潜在介质(例如IL-18以及其它的介质)。在分离的心脏(Langendorf prep) 中，测得MIF能直接在TNFR-/-和野生型小鼠中以相同的程度诱导立即的(在20分钟内) 心脏功能障碍(心脏收缩期和心脏舒张期)。但是，在TNFR-/-小鼠中LPS诱导的心脏功能障碍到48小时通过抗体中和MIF完全除去，表明TNF受体介导的独立的MIF释放能在内毒素中毒模型中诱导显著的晚期心脏功能障碍( 和48小时)。
细胞因子MIF在许多细胞类型中组成性地表达，包括淋巴细胞、巨噬细胞和脑垂体前叶。许多组织也含有MIF，包括心脏，肺，肝，肾上腺，脾，肾，皮肤，肌肉，胸腺，皮肤，和睾丸。最近，已经在LPS刺激的单核细胞中描述了分泌机理。经典蛋白分泌的抑制剂例如莫能菌素或布雷菲德菌素A不能抑制MI F的分泌，这暗示着非-经典的蛋白输出途径。当施用ABCAl (ATP结合盒Al)转运蛋白的抑制剂(优降糖和probenicide)时，不会发生MIF 分泌。MIF主要位于胞质中的小囊泡和核中，它们被夹断并释放到细胞外侧。已经证实，该非-经典的、泡囊-介导的分泌途径是分泌其它重要的炎性介质例如HMGBl的机理，已经证实HMGBl在炎性疾病、尤其是败血症中起显著作用。在本发明中，首次描述了 MIF分泌对几种组织中的TNF-α信号转导的依赖性。
MIF具有许多生物活性，包括糖皮质激素拮抗性质，催化性质，其通过共激活剂 JAB1/CSN5和细胞表面蛋白CD74/Ii链调节。炎性刺激(例如内毒素(LPS)和肿瘤坏死因子)后，产生MIF的特异性的分泌，以及激素例如ACTH和血管紧张肽II。除了免疫细胞以外，内分泌细胞和一些上皮细胞也能分泌MIF。分泌是由于MIF表述和重新合成的增强以及从预先存在的储存进行释放的诱导；以前已经在心脏中证实了这二者。
已经报道，野生型小鼠LPS攻击后12小时，心脏MIF最大地释放。LPS攻击后，野生型小鼠中的血清MIF水平在8小时达到最大释放，这与心脏功能障碍的早期保护相对应。当在LPS攻击后通过Enbrel 预处理或在TNFR-/-小鼠中抑制TNF-α信号转导时，MIF 水平更晚地且略微更高地达到顶峰，表明TNF- α具有对血清MIF水平的一些控制，但是不能抑制MIF释放。当用抗-MIF中和抗体预处理野生型小鼠并进行LPS攻击(％ig/kg)时， 在第4小时时观察到了初期的严重心脏功能障碍，其与单独施用LPS的小鼠相同。但是， 在8小时时观察到了初次明显的保护，一直升高直到48小时，这时与对照动物的心脏功能没有显著的差异。由于MIF在分离的野生型心脏中具有几乎立即的且直接的心脏作用，认为MIF在心脏功能中起作用，与它的延迟释放相平行。但是，在本发明中，已经证实MIF的非-心脏释放也可以对体内功能有显著作用(M和48小时)。与野生型小鼠(最大MIF 释放在8小时)相比，当封闭了 TNF-α信号转导(12-M小时)时，这些作用比以前描述的 (初次保护在8小时)发生得更晚，且与全身的MIF释放的延迟平行。
认为早期的心脏功能障碍可以归因于几种已经证实能介导败血症(和LPS)有关的心脏功能障碍的细胞因子，例如TNF-α，IL-Ιβ，和IL-18。已经报道了内毒素血症中心肌的TNF-a水平和收缩功能障碍之间在时间上的不一致性。LPS有关的心肌功能障碍在TNF-α水平恢复到基线之前不会发生的这些发现与其它发现相矛盾，后者已经报道 TNF-α中和后免受LPS诱导的心脏功能障碍的保护。这些发现和其它发现已经导致了假设，即TNF-α是LPS诱导的下游介质的增加所必需的，例如IL-I β，IL_6，IL-18，以及其它的尚未鉴别出的因子。本发明人证实了，TNF信号转导能介导MIF在内毒素血症模型中的一些(来自心脏、肝、脾的MIF分泌)但不是全部作用。
其它研究人员已经研究了 TNF-a信号转导的标记作用，尤其是关于内毒素血症模型中的细胞因子IL-18。在TNF-a敲除的(-/-)小鼠中进行LPS攻击后，心脏中的IL-18 水平没有显著变化，而野生型小鼠的IL-18水平表现出了显著增加。当中和IL-18时，该研究证实，能减轻LPS诱导的心脏功能障碍，IL-18似乎对组织TNF- α，IL-I β，以及ICAM-I/ VCAM-I水平具有下游作用。该研究集中在心肌中IL-18的心肌生产和释放，没有研究IL-18 的非-心脏来源。认为在TNR- α对组织(心脏)生产/释放IL-18的依赖性方面，该研究类似于本发明人的。
同样地，注意到以前的一项研究是重要的，该研究鉴别了 LPS攻击后TNF-a抑制对心肌细胞因子mRNA表达以及血浆细胞因子水平的作用。TNF的抑制能在2小时部分地、 但是显著地减少IL-I β，ILUPMCP-l的血浆水平，但是对MIF，TNF，IL-10，或IL-12则不能；相反地，抗-TNF预处理在该较早的时间点能显著减少IL-I β的心肌表达，但是对其它细胞因子(包括MIF)则不能。由于本发明人已经证实，MIF在2小时以后才表现出释放 (在12小时达到峰值)，本发明人首次描述了 TNF独立性的和TNF依赖性的MIF途径，其在该以前的研究中与IL-I β，IL-6，和MCP-I平行。这些是重要的发现，因为已经证实这些细胞因子中的大多数能直接介导心脏功能障碍。
尽管在该研究中LPS攻击后TNFR-/-小鼠的心脏功能障碍(18. 2 % (45. 9-27. 7FS% )不象在我们以前的研究中从野生型小鼠测得的结果36. 7% (67. 3-30. 6) 一样重大，抑制是显著的。由于已经将多种细胞因子归于LPS攻击后的早期心脏功能障碍， 我们在TNFR-/-模型中测定了血清细胞因子水平。与野生型小鼠相比，TNF-α的水平急剧增加，但是，没有功能受体(TNF受体I或TNF受体I I)，它的作用并未介导观察到的早期的心脏功能障碍。但是，除了最近描述的其它的细胞因子(例如IL-Ιβ)以及尚未描述的其它介质以外，在4小时清楚地观察到了 IL-I β和IL-6的增加(分别超过野生型小鼠 31. 2和8.5倍)，且可能促成早期的心脏功能障碍。以前已经描述了 TNF-α信号转导在调节TNF-α分泌中的作用。但是，本发明人已经首次证实，TNF-α受体信号转导能通过负反馈机制调节IL-li3，IL-12，和I L-10，并正调节IFN-Y (图19)。同样地，LPS攻击后，缺乏 IL-6的小鼠具有增强的IL-I β和TNF-α表达，本发明人预期，心脏IL-6能通过负反馈机制抑制促炎性介质(包括它自身)的表达。
TNF-α信号转导通过2种受体进行TNF_a受体1和2。这2个途径具有分歧的信号转导途径。TNF-a和受体1的相互作用能激活几种信号转导途径，包括NF-kB，而 TNF-α受体不能。为了研究2种可能的TNF受体中的哪一个负责抑制心脏中的MIF释放， 本发明人攻击了小鼠，其中IkB在心脏中的过表达导致了几乎完全的NF-kB抑制。通过蛋白印迹分析，本发明人证实了在测试的所有时间点，都没有以与TNFR-/-小鼠相同的方式发生释放(未显示数据，与图2A相同)。这些小鼠具有与野生型相同的循环TNF-α (因为 NF-kB抑制是心脏特异性的)。另外，与野生型小鼠类似，这些小鼠能在血清中表达MIF。 因此，本发明预期，TNF受体1可介导来自心脏的在野生型小鼠中观察到的组织释放。由于在LPS攻击后，在前48小时的过程中，echo完全保护了该心脏的表型(未显示数据)，本发明人预期，循环MIF需要上游NF-kB介导的蛋白作为信号(TNF- α，IL-I β )，或者MIF能通过NF-kB自身介导它的作用。
当用MIF中和抗体预处理时，会减弱野生型小鼠中LPS攻击后的IL-10和IFN- γ 的释放(图20)。由于MI F具有延迟的释放，它们可能是受影响的细胞因子，由于它们与 MI F在时间上的关系是它们在释放MIF后发生(图13)。这些发现表明，在内毒素攻击后， MIF活性在IL-10和IFN-Y释放中起显著作用，尽管它可能不是用于它们的释放的唯一信号。令人感兴趣地在TNFR-/-小鼠中发现(图19C)，也抑制了 IFN- γ释放，使TNF和MIF 都成为它的释放所必需的。同样地，在硫酸葡聚糖-诱导的结肠炎的模型中，抗-MIF抗体明显抑制了 IFN- Y。当与IFN- γ 一起(而不是没有IFN- y )施用TNF- α和LPS时，已经证实了在心肌细胞中iNOS的表达。由于iNOS自身在LPS有关的心脏功能障碍的调节途径中起作用，这些细胞因子途径是复杂的，且可能密切地相互作用。
为减少败血症和败血症性休克的发病率和死亡率而抑制TNF-α的尝试以前在临床上已经失败，即使在小鼠中的临床前研究能够针对内毒素攻击进行保护。本发明人已经发现，在LPS攻击之前抑制TNF- α信号转导，能抑制组织的MIF分泌，尽管血清MIF释放不受影响。另外，当在LPS攻击之前即刻或之后(而不是90分钟前)施用Enbrel时，偶发地发生MIF的组织释放(未显示数据)，可以用其解释该治疗的另外下游MIF作用。不希望受理论的约束，这些发现表明了抗-TNF- α治疗可能由于MIF作用而不起效的机理。
尽管在没有活感染的情况下，该LPS攻击研究不能直接外推到败血症-诱导的心肌功能障碍，重要的是注意到了，已经证实MIF在活体的多种微生物腹膜炎模型(CLP)中是生理上有关的。当将MIF中和抗体施用给TNF-α-/-小鼠(对CLP损害特别敏感)时，MIF 在15小时时对致死率有保护性(在第9天时，与只有CLP时的0%相比，在MIF中和的小鼠中是62%存活率)。同样地，在野生型小鼠中，MIF中和抗体的保护性持续9天(实验的终点)，这时有81%存活，与31%相比，即使在损害后多达4. 5小时时施用抗体(61%存活率， 与5%相比)。因此，本发明人预期针对败血症-诱导的心肌功能障碍的抗-MIF治开。
由于封闭重要的上游介质例如TNF-α，能延迟且部分地未影响MIF释放，它可以代表一种好的治疗靶。为此，可以药理学上地干预能介导它的一些生物功能的MIF的互变异构酶活性的抑制。此外，近来的释放的非-经典的分泌机理也是治疗的潜在靶物。但是， 重要的是意识到已知的败血症中其它明显靶物(HMGBl)以及没有描述的靶物仍然存在。因此，重要的是理解所有这些介质的治疗性发明的作用。
本发明人已经证实，MIF在LPS诱导的心脏功能障碍中起显著的作用，认为它有助于败血症过程中的心肌功能障碍。因为认为TNF-α是LPS诱导的心脏功能障碍中的重要的标记细胞因子，已经研究了体内阻断TNF-α信号转导途径对MIF诱导的心脏功能障碍的作用。通过抑制TNF-α信号转导，可以轻微增加和延迟MIF的血清浓度和时间分布(最大增加12-24小时(TNF- α信号转导抑制，1. 7-2. 3倍基线，vs. 8小时，在野生型中(1. 5倍增加))。与以前在野生型小鼠中观察到的在12小时时延迟的最大释放不同，抑制TNF-α信号转导后，LPS攻击后不会发生预形成的MIF从心脏、肝和脾的释放。心脏MIF mRNA的RNA 印迹分析揭示，LPS攻击后的转录没有显著变化。当将重组的MIF应用到分离的TNFR-/-心脏(Langendorff制品)时，检测到了与野生型小鼠相同的心脏功能的显著降低，表明MIF 信号转导是TNF-α。LPS攻击后的TNFR-/-小鼠的超声心动描记术证实了，在48小时后最低限度地改善的早期心脏功能障碍(缩短分数％降低了 18. 2% )。当用单克隆抗体中和 MIF时，到M小时心脏功能显著改善，到48小时完全恢复，表明MIF在晚期LPS相关的心脏功能障碍中起作用，尽管缺少组织释放。该研究首次证实了，从心脏和其它组织的MIF释放依赖于TNF信号转导，且LPS攻击后缺少TNF信号转导不会影响MIF的血清释放，并且其足以介导心脏功能障碍。
巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是多能的细胞因子，在败血症(严重感染)过程中对心脏功能具有直接的和明显毒害的作用。本发明的一个实施方案在小鼠模型中证实，MIF 活性的抑制可以显著地改善急性心肌梗塞后的心脏功能(见图21-2 。该改善在几小时内明显，且在实验过程中持续(1周)。非常可能的是，MIF的调制会减少梗塞面积和其它病理学参数。心脏功能的改善程度是显著的，且与其它免疫靶物例如TNF-α相比基本上过量了至少10倍。
在本发明之前，还没有能靶向心脏功能障碍和急性心肌组织损伤的化合物/细胞因子介质的心肌梗塞治疗。当前的技术目标是，通过治疗例如ΤΡΑ，使梗塞最小化。一旦施用了 TPA或类似的治疗，除了标准的inotropes (多巴酚丁胺)或机械装置(主动脉内球囊泵)外，就没有能预防心原性休克/衰竭的药物治疗。这里预期阻断MI F的治疗与TPA或球囊血管成形术同时施用，进一步改善短期的和长期的心脏功能，并潜在地使梗塞面积最小化。
本发明的一个实施方案解决了急性心肌梗塞后的急性和慢性心脏功能障碍的问题。本发明使得提供一类独特的治疗成为可能，因为它能调制免疫介质，即MIF。不希望受理论的约束，认为本发明可以直接减少梗塞面积。没有等同的治疗能保持长期的心脏功能。 关于短期的功能，根据本发明调制MIF活性，能使对主动脉内球囊泵和其它机械装置的需求最小化。从 Cytokine Pharma Science, Inc.，King of Prussia，PA，可以得到合适的单克隆抗-MIF抗体。
本发明的另一个实施方案涉及对CD74的抑制，以保护与严重疾病有关的心脏功能障碍，例如败血症，外伤，急性MI，和充血性心力衰竭。尽管已经在循环免疫细胞和抗原呈递细胞(结合MHC II类)上描述了⑶74，在本发明之前，尚未报道⑶74在心脏(以及其它器官)中存在。更重要的是，以前没有证实在生理或疾病过程中⑶74对心脏功能的功能作用。尽管已经证实，⑶74能体外地介导MIF活性，这尚未得到独立的证实，且限于成纤维细胞和白细胞。
可以得到合适的抗-人⑶74抗体，例如，从BD Biosciences (产品目录号 555538(克隆M-B741 ；纯化的格式；同种型小鼠IgG2a, κ ；W. S. NoV CD74. 4 ；反应性人)和 555612(克隆LN 2 ；纯化的格式；同种型小鼠IgG1, κ ；W. S. No V CD74. 3 ；反应性人)
本发明使得抗-细胞因子治疗(包括抗-MIF)在心脏病中的应用成为可能。在败血症模型中使用抗-TNF治疗的初步实验未能起效。另外，MIF(即推定的受CD74抑制封闭的细胞因子)是较晚产生的细胞因子，且在我们的急性MI的模型中，在损害后增加了数周， 允许在任何时间进行干预。
在急性MI和败血症早期的心脏功能障碍是与这些疾病中的每一种有关的高发病率和致死率的原因。本发明人预期，可以增强性能和潜在地降低与每一种相关的发病率的细胞因子治疗。
心脏病中的大多数治疗性干预已经集中在再灌注(MI)或in0tr0peS(MI和败血症)。通过本发明的一个实施方案，用CD74受体(推定的MI F的受体)干预，可以减弱急性和慢性心原性损伤，并改善存活率/结果。
LPS攻击后，MIF从心肌细胞分泌出来，并直接介导晚期发作的(> 6小时)心脏功能障碍。在免疫细胞中，确定CD74是MIF受体，通过ERK1/2细胞内信号转导途径发挥作用。为了确定CD74是否能介导败血症中的MIF-诱导的心脏功能障碍，本发明人进行了下述攻击1)用LPS攻击野生型小鼠(C57BL/6) ；2)用抗-CD74单克隆中和抗体预处理的野生型小鼠；并用LPS攻击，和3)用LPS(^ig/kg)攻击⑶74敲除的小鼠。进行连续的超声心动描记术，并确定缩短分数(FS% )。在M小时，与对照(FS%= 58士 )相比，在施用LPS 的野生型小鼠中观察到了显著的功能障碍(FS%= 31. 6 士 3.3%)。在抗-⑶74抗体处理的和CD74敲除的用LPS攻击的小鼠中，与单独施用LPS的野生型小鼠相比，心脏功能显著改善(FS%分别是49士3. 6%和53. 3士2. 4%，D<0. 05)。由于从未记载在心脏中表达⑶74， 本发明人进行了免疫印迹和组织化学，这证实了 CD74组成性地存在于心脏细胞膜上和细胞溶质中；且在LPS攻击后受到实质性调节(在12小时几乎没有-> 4倍减少)。本发明人证实，⑶74在心肌细胞上表达，且是心脏功能障碍的关键介质。
本发明的另一个实施方案涉及，通过使用一种或多种可溶性MIF受体或MIF 受体拮抗剂，抑制MIF活性。作为一个实施例，对于抗-TNF α治疗，REMICADE 或 INFLIXIMAB (抗体TNF α )和ENBREL 或ETANERCEPT (可溶性TNF-受体)是合适的。该方法包括，给需要的对象施用一种或多种可溶性MIF受体和/或MIF受体拮抗剂，其量能有效地治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，或其组合。
本发明的另一个实施方案涉及小分子MIF抑制剂(有时称作"MIF拮抗剂"或"异巧悉唑啉化合物")在下述方面的应用治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性紊乱，治疗和/或预防有此需要的对象中的心肌活性抑制，治疗和/或预防有此需要的对象中烧伤伴随的心脏功能障碍，治疗和/ 或预防有此需要的对象中急性心肌梗塞后的心脏功能障碍，治疗和/或预防有此需要的对象中的心脏抑制，或其组合。
在下面的化学式中，使用在取代基上的上标来标识取代基的名称(例如，“R2" 用于指命名为R2的取代基)，而使用下标来列举取代基发生在该分子位置的次数(例如，“&〃或〃(R)2"都用于指2个简称作〃 R"的取代基)。
用于本文的方法中的合适的小分子MIF抑制剂具有下式I :
其中Rh独立地是，R，卤素，N3, CN，0H，NRR'，或SH ;R和R'独立地是，H或C1^烧基；
X 是 R，商素，N3，CN，0R，NRR'，SH，= 0，= CH2，或 A ；
A是取代的或未取代的芳香环；
Y 是 R，NRR'，NRR"或(CH2)n-A ；
Z 是 R，OR，OR"，NRR'，NRR"，或 A;
R"是饱和的或不饱和的、直链或支链C2-C18 ；且
η 是 0 或 1。
优选地，式I化合物是含有对羟苯基-异唑啉的化合物，其中R，R1^4, X和Y中的每一个是H或-CH2-A,且Z是OR。更优选地，式I化合物是(R) _3_ (4-羟苯基)-4，5- 二氢-5-异^if唑啉乙酸的酯、尤其是它的甲酯(在本文中有时称作"IS0-1 “或"CPSI" 或"CPSI-26")，后者也称作对羟苯酚-异唑啉甲酯。更优选地，该化合物是 2- {3- (4-羟基-苯基)-4，5- 二氢-异巧悉唑-5-基} -3-苯基-丙酸的酯，尤其是它的甲酯(称作〃 IS0-2")。
用于本文的方法中的其它合适的小分子MIF抑制剂具有下式II或III
权利要求
1.有效量的至少一种抗-MIF抗体在制备用于治疗或预防对象中的心脏功能障碍或心脏抑制的药物中的用途方法。
2.权利要求1的用途，其中所述的心脏功能障碍选自心肌活性的紊乱，心肌活性的抑制，和其组合。
3.有效量的至少一种抗-MIF抗体在制备用于治疗或预防对象中的烧伤伴随的心脏功能障碍或烧伤伴随的心脏抑制的药物中的用途。
4.权利要求3的用途，其中所述的烧伤伴随的心脏功能障碍选自心肌活性的紊乱，心肌活性的抑制，和其组合。
5.有效量的至少一种抗-MIF抗体在制备用于改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能或心脏抑制的药物中的用途。
6.有效量的至少一种抗-TNFR抗体和有效量的至少一种抗-MIF抗体在制备用于治疗或预防急性心肌梗塞后对象中的心脏功能障碍或心脏抑制的药物中的用途。
7.有效量的组合物在制备用于治疗或预防对象中的烧伤伴随的心脏功能障碍或心脏抑制的药物中的用途，其中所述的组合物包含至少一种抗-MIF抗体和至少一种药学上可接受的载体。
8.有效量的组合物在制备用于改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能或心脏抑制的药物中的用途，其中所述组合物包含至少一种抗-MIF抗体和至少一种药学上可接受的载体。
9.有效量的组合物在制备用于治疗或预防急性心肌梗塞后对象中的心脏功能障碍或心脏抑制的药物中的用途，其中所述组合物包含至少一种抗-TNFR抗体，至少一种抗-MIF 抗体，和至少一种药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明的涉及作为心脏衍生的心肌抑制因子的巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的治疗和生物测定方法。在一个实施方案涉及药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种抗-MIF抗体；和至少一种药学上可接受的载体。本发明的另一个实施方案涉及药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种抗-CD74抗体；和至少一种药学上可接受的载体。本发明的另一个实施方案涉及药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种抗-TNFR抗体；治疗有效量的至少一种抗-MI F抗体；和至少一种药学上可接受的载体。本发明的其它实施方案涉及治疗或预防心脏功能障碍、心脏抑制、烧伤伴随的心脏功能障碍、改善急性心肌梗塞后对象中的心脏功能、和鉴别MIF抑制剂的方法。
文档编号C07K16/24GK102499984SQ201110370579
公开日2012年6月20日 申请日期2004年8月30日 优先权日2003年8月29日
发明者B·吉罗, M·威利斯, T·西莱克, V·德拉克鲁兹 申请人:巴克斯特保健股份有限公司, 巴克斯特国际有限公司, 得克萨斯大学体系董事会