专利名称：趋化素样因子－1在器官炎性损伤中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种趋化因子在器官炎性损伤中的用途。具体地说，涉及趋化素样因子-1在检测样品炎性损伤的病理状态、制作器官炎性损伤的动物模型、制备具有治疗器官炎性损伤的CKLF-1抗体和拮抗剂中的用途，尤其是在支气管哮喘气道损伤及重塑和肺纤维化中的用途。
背景技术：
支气管哮喘是严重危害人类健康的慢性疾病，其发病率在全世界范围内不断上升。目前美国的发病人数已达1500万，英国几乎1/7的儿童患有哮喘，而我国约有数千万患者。因此，对哮喘的研究与防治是一项紧迫而艰巨的任务。
在过去的十几年间，哮喘研究的重点放在研究引发气道粘膜炎性浸润的机制上，如免疫活性细胞分泌的各种前炎因子引起的炎性细胞粘附、滚动、趋化、游走、局部浸润、直至呼吸爆发并释放组胺、脂质介质及活性氧等多种炎性介质所造成的炎性损伤。1995年WHO与美国心肺血液研究所在共同制定的纲领性文件“全球哮喘防治战略”中将支气管哮喘明确定义为“多种细胞特别是嗜酸性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞参与的慢性气道炎症，并由此导致气道高反应性及气道阻塞”。该文件还指出“这种气道阻塞通过治疗可部分逆转或自行逆转。”(Global strategy for asthmamanagement and prevention NHLBI/WHO workshop reportthe definitionof asthma in global，1995，6-7)。
但大量临床资料表明某些哮喘病人的临床表现无法用单纯的气道炎症来解释，一些病人即使经规范合理的抗炎治疗，气道阻塞仍不能逆转。如今人们已明白，那些难治病例是因为气道粘膜炎性损伤后的不全或过度修复，包括上皮细胞脱落、粘液细胞增生、粘膜下胶原纤维沉积，平滑肌增生肥大等病变而使得气管管径显著缩小。当炎性分泌物增多、气道平滑肌收缩、粘液腺分泌增加时，气道阻塞加重，因而出现持续的呼吸困难等临床症状，皮质激素亦不能使之逆转。这种气道结构的病理改变被称为“气道重塑”。
支气管哮喘患者的支气管粘膜活检与死亡病例尸解亦证实，伴有显著的气道结构改变是支气管哮喘的病理特征(Redinogton A.E.，et al.Thorax，1997；52310-312)。多年来人们一直试图复制哮喘气道结构变化的动物模型，但迄今为止各类模型多为支气管粘膜的炎性病变。例如，变应性哮喘模型、感染性哮喘模型、职业性哮喘模型等，都只表现出明显的炎性浸润(如嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨嗜细胞、嗜中性粒细胞等在支气管周围的聚集浸润)，但缺少气道上皮严重受损、上皮下胶原沉积、平滑肌增生等病变，因此不能够真实地反映哮喘的病理特征。
一些研究还提示某些免疫活性细胞和细胞因子参与了哮喘的发病过程，因为在哮喘病变组织中检测到多种细胞因子的表达。例如，从支气管哮喘病人外周血单个核细胞、肺泡灌洗液及支气管粘膜活检中检测到高水平表达的细胞因子及其受体(如EGF、TGF-β、GM-CSF、PDGF、ET-1、EGFR)。但由于受体内实验的限制，细胞因子与气道炎症及修复的直接关系，尤其是某单一因子与肺支气管病理变化关系的报道极少。而这些对阐明哮喘的发病机制无疑是非常重要的。
趋化素样因子-1(Chemokine-like factor1，CKLF-1)是一个新发现的趋化因子，其GenBank登录号为AF096895。CKLF-1具有C-C亚家族趋化因子的特点，即位于氨基酸序列N末端的第一和第二个半胱氨酸(Cys)紧密相连，呈Cys-Cys排列，即CC结构。已经发现，多种肿瘤细胞表达CKLF-1，该因子对嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞有趋化作用，并能促进人低密度骨髓细胞增值及集落形成(参见PCT申请PCT/CN00/00026)。
发明概述本发明人根据多年积累的临床资料和实验数据，从众多的细胞因子中选择趋化素样因子-1，进行支气管哮喘病的研究。经过长期研究和大量实验，发明人首次公开了CKLF-1对器官炎性损伤，尤其是对支气管哮喘气道炎性损伤及重塑和肺纤维化的重要作用，并成功地建立了气道炎性损伤及重塑和肺纤维化的动物模型。
本发明一个方面公开了趋化素样因子-1在器官炎性损伤，尤其是在支气管哮喘气道炎性损伤及重塑和肺纤维化中的用途。
本发明涉及通过检测样品中CKLF-1的过量表达，从而确定样品为炎性损伤组织的体外检测方法。
本发明另一个方面公开了利用趋化素样因子-1制作器官炎性损伤的动物模型中的方法，尤其是制作支气管哮喘气道炎性损伤及重塑、肺纤维化动物模型的方法。
本发明再一个方面公开了趋化素样因子-1在制备具有治疗器官炎性损伤作用的抗体和拮抗剂中的用途。
根据本发明的一个方面，公开了趋化素样因子-1对器官炎性损伤，尤其是对支气管哮喘气道炎性损伤及重塑和肺纤维化的作用。
在本发明的一个实施方案中，CKLF-1的导入直接介导了小鼠气道损伤及重塑样改变。例如，导入CKLF-1后2周，小鼠气道上皮细胞明显充血水肿，支气管变形，管腔内可见脱落的上皮及渗出物。随后上皮纤毛消失，杯状细胞增生(支气管哮喘气道上皮表型改变的特征)。6周后小鼠气道上皮结构排列严重紊乱，呈现明显的粘膜皱折，大量上皮细胞脱入支气管腔，基底膜增厚，上皮下胶原沉积，平滑肌增殖。
在实施方案中，CKLF-1的导入还引起小鼠体内的肺纤维化病变。例如引起肺小血管异常，肺泡壁增厚，肺泡上皮细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维细胞聚集增生，肺间质胶原沉积。因此，CKLF-1广泛地参与了支气管肺的炎性损伤与修复过程，亦可能在慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸衰竭的发病中发挥重要作用。
除肺部效应外，发明人还发现CKLF-1可引起肝、脾、肾、睾丸等组织的变性肿胀以及结构改变。故有理由推测CKLF-1对其它组织器官也会产生病理生理效应，即CKLF-1具有致器官炎性损伤的作用。
炎性损伤是指炎细胞积聚活化，释放大量炎性介质所造成的组织细胞损伤，如毛细血管通透性增加，血浆渗出，细胞肿胀变性，功能受阻等等。炎性损伤发生在不同的组织器官既有炎症的一般表现，也有不同的特性。
因此，本发明涉及一种体外检测方法，包括相对于正常对照，通过检测样品中CKLF-1的过量表达而确定样品炎性损伤状态的方法。样品可以是来自有机体的组织或细胞，如肺手术切除组织，肺支气管粘膜组织，外周血单个核细胞等。检测标的物可以是CKLF-1核酸编码序列或CKLF-1蛋白。检测来自宿主的样品中CKLF-1改变水平的分析方法是本领域技术人员公知的。例如，在DNA水平上，可以从样品细胞中获得用于诊断的核酸，基因组DNA可以直接用于检测，或者在分析前用与CKLF-1核酸序列互补的引物进行PCR扩增。在蛋白质水平上的分析方法包括放射免疫测定、竞争结合测定、Western印迹分析、ELASA测定等等。
在本发明的一个优选实施方案中，用CKLF-1特异性引物进行PCR扩增，检测到哮喘患者PBMCs中CKLF-1的表达明显高于非哮喘患者。
根据本发明的再一个方面，公开用CKLF-1制作炎性损伤的动物模型的方法，尤其是制作哮喘气道损伤及重塑和肺纤维化动物模型的方法。
可以用各种已知的方法将CKLF-1导入动物体内，制作炎性损伤的病理模型。例如，可以采用鼻吸、口服、静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下、关节内注射和输注等方法，建立支气管哮喘气道损伤的病理模型。优选注射和吸入途径，更优选雾化吸入途径。
雾化吸入是指借助雾化装置将溶质吸入肺支气管，使溶质直接在肺局部发挥作用。由于抗原的气道吸入是大部分哮喘的始发途径，因此雾化吸入途径非常接近哮喘发生的真实状况。
导入动物体内的CKLF-1可以与药学上可接受的载体或赋形剂一起制成组合物，用于注射或输注的组合物包括无菌水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及临使用前在无菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。用于适于吸入的组合物中，CKLF-1可以被压缩或含于压缩气体如氮气或液化气体推进剂中。
用于制作病理模型的动物可以是除人类以外的哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔等。使用的动物符合国家规定的实验动物标准。
在一个优选实施方案中，发明人采用电脉冲裸基因肌肉注射法，将真核表达质粒pcDI-CKLF1导入小鼠体内，成功地复制出类似于支气管哮喘气道损伤及重塑的小鼠动物模型，表现为大量气道上皮脱落，杯状细胞增生，基底膜增厚，上皮下胶原沉积，平滑肌增殖及肺小血管异常等病变。发明人用该方法同时建立了小鼠肺纤维化的病理模型。
根据本发明的又一个方面，公开了CKLF-1在制备具有治疗器官炎性损伤作用的抗体和拮抗剂中的用途。
根据本发明，CKLF-1可以用于制备和筛选具有治疗器官炎性损伤作用的抗体和拮抗剂。抗体可以是单克隆的或者是多克隆的。拮抗剂包括在一定条件下与CKLF-1结合的寡肽或化合物。拮抗剂可以与CKLF-1结合并在受体位点阻断其活性，或者，可以与CKLF-1受体结合，从而阻止CKLF-1与受体的结合。可以用本领域已知的各种方法制备CKLF-1抗体和拮抗剂。例如，将CKLF-1蛋白注入动物体内，获得CKLF-1抗血清。用人B细胞-杂交瘤技术、EB病毒-杂交瘤技术等制备CKLF-1单克隆抗体。
本发明的优点和特点概述如下首先，首次公开了CKLF-1对器官炎性损伤，尤其是对支气管哮喘气道炎性损伤及重塑和肺纤维化的重要作用。本发明不仅提供了一种新的器官炎性损伤的检测方法，而且为这类疾病的深入研究提供了实验基础。
其次，利用本发明成功地建立了小鼠气道炎性损伤及重塑样模型。该模型克服了以往哮喘研究动物模型的缺陷，具有气道上皮脱落等病变，能够真实地反映哮喘的病理特征，因此为阐明哮喘发病机理，研究和防治哮喘提供了有益工具。
第三，本发明公开的实验资料和结果，对哮喘及相关疾病的研究意义深远。例如，本发明人发现(1)在基础状态下，人气道上皮细胞和外周血单个核细胞(PBMCs)表达CKLF-1；(2)前炎因子TNF-α可以上调人气道上皮细胞CKLF-1的表达；(3)嗜酸性粒细胞在哮喘气道损伤及重塑中未必是不可缺少的因素；(4)嗜中性粒细胞的聚集活化在哮喘样气道损伤及重塑中具有重要意义。
附图简述
图1显示人气道上皮16HBE细胞和外周血单个核胞CKLF-1的表达。
图2显示TNF-α对16HBE细胞CKLF-1表达的影响。
图3A-6B显示CKLF-1对小鼠气道上皮的影响。其中，图3A是导入pcDI空质粒2周后，小鼠(对照组)气道上皮细胞的苏木精-伊红(HE)染色结果(20×)；图3B是导入pcDI-CKLF1质粒2周后，小鼠(实验组)气道上皮细胞的HE染色结果(20×)；图4是导入pcDI-CKLF1质粒3周后，小鼠(实验组)气道上皮细胞的HE染色结果(20×)，图中显示气道上皮杯状细胞增生；图5A是导入pcDI-CKLF1质粒6周后，小鼠(实验组)气道上皮细胞的HE染色结果(20×)；图5B是导入pcDI-CKLF1质粒6周后，小鼠(实验组)气道上皮细胞的HE染色结果(20×)，图中可见明显的气道粘膜皱折；图6A显示导入pcDI空质粒8周后，小鼠(对照组)姬姆萨染色支气管肺泡灌洗液(BALF)中的少量上皮细胞(20×)；图6B显示导入pcDI-CKLF1质粒8周后，小鼠(实验组)姬姆萨染色支气管肺泡灌洗液(BALF)中以集落形式脱落的上皮细胞(20×)；图7显示CKLF-1对小鼠气道基底膜的影响(HE染色，20×)。
图8显示CKLF-1对小鼠气道平滑肌的影响(20×)。
图9A-10B显示CKLF-1对小鼠肺组织的影响。其中，图9A是导入pcDI空质粒2周后，小鼠(对照组)肺组织的HE染色结果(20×)；图9B是导入pcDI-CKLF1质粒2周后，小鼠(实验组)肺组织的HE染色结果(10×)；图10A是导入pcDI空质粒4周后，小鼠(对照组)肺组织Mallory改良染色的结果(40×)；图10B是导入pcDI-CKLF1质粒4周后，小鼠(实验组)肺组织Mallory改良染色的结果(40×)，图中显示胶原纤维。
图11A～11B显示CKLF-1对小鼠肺组织血管的影响。其中，图11A是导入pcDI空质粒4周后，小鼠(对照组)肺组织血管的HE染色结果(20×)；图11B是导入pcDI-CKLF1质粒4周后，小鼠(实验组)肺组织血管的HE染色结果(20×)。
图12A-12B显示CKLF-1对小鼠肺组织巨噬细胞的影响。其中，图12A显示苔盼兰活体注射后对照组小鼠肺组织切片(20×)；图12B显示苔盼兰活体注射后实验组小鼠肺组织切片(20×)。
图13A-13B显示肺组织CKLF-1表达的免疫组化检测。其中，图13A是对照组小鼠肺组织CKLF-1表达的免疫组化检测(40×)；图13B是实验组小鼠肺组织CKLF-1表达的免疫组化检测(40×)。
图14显示正常对照组与哮喘组外周血单个核细胞的CKLF-1表达。
图15A-15B显示正常对照与哮喘患者支气管粘膜CKLF-1蛋白表达的免疫组化检测。其中，图15A是正常对照支气管粘膜CKLF-1蛋白表达的免疫组化检测(苏木素复染，40×)；图15B是哮喘患者支气管粘膜CKLF-1蛋白表达的免疫组化检测，(苏木素复染，40×)。
为了更清楚地理解本发明，现参照以下实施例对其进行说明。实施例对本发明的保护范围没有任何限制意义。优选实施例的描述实施例1.CKLF-1在人气道上皮细胞和外周血单核细胞的表达以及TNFα对人气道上皮细胞中CKLF-1表达的影响为探测CKLF-1是否参与支气管哮喘的发生，须确定CKLF-1是否表达于炎性细胞和气道结构细胞，以及在前炎因子刺激下CKLF-1表达是否发生变化。
本实施例(1)以正常人外周血单个核细胞为炎细胞代表，以正常人气道上皮细胞16HBE为气道结构细胞代表，检测了CKLF-1的表达。(2)检测了前炎因子TNF-α对气道上皮细胞CKLF-1表达的影响。
1.正常人气道上皮细胞株16HBE的培养取正常人气道上皮细胞株16HBE(Southampton)冻存管1支，在37℃水浴迅速冻融，加入含10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的1640培养液。以1×105细胞/ml接种于25cm2培养瓶中，在37℃，5％二氧化碳孵箱内培养。每隔2天换液，待细胞长至基本汇合状态时按照1∶3传代。传代时用0.125％的胰酶消化2分钟，用含血清培养基吹悬细胞后离心。以1×105/ml接种于12孔培养板，用含10％胎牛血清的DMEM培养液继续培养。当细胞80％汇合成片时，吸净上清改用无血清培养基培养。12小时后用1000U/ml TNF-α刺激培养细胞。
2.外周血单个核细胞(PBMCs)的分离从健康受试者抽取外周静脉血3-4毫升，肝素抗凝。用4℃预冷的生理盐水将新鲜血稀释1倍并混匀。将稀释血液加于2毫升淋巴细胞分离液(比重1.077)之上，2000转/分钟，离心20分钟。吸出中层单个核细胞，加入另一试管。加2毫升生理盐水洗涤单个核细胞。4℃，1000转/分钟，离心10分钟。弃上清，加1毫升生理盐水重复洗涤。4℃，2000转/分钟，离心5分钟。弃上清，沉淀即为PBMCs。
3.总RNA提取和cDNA合成按照《基因操作技术》(第一版)(王申五主编，北京医科大学协和医科大学联合出版社出版.1991；46-48)和《分子克隆》(第二版)(J.萨姆布克等著，金冬雁等译.科学出版社出版)中的方法分别提取16HBE、PBMCs总RNA，并在逆转录酶(Promega公司)的作用下合成cDNA，用于检测正常气道上皮细胞和外周血单个核细胞中CKLF-1的表达。
于TNF-α刺激16HBE细胞8、12、20小时后，分别提取细胞总RNA，进行RT-PCR，用于检测TNF-α对气道上皮细胞CKLF-1表达的影响。实验对照组只加DMEM无血清培养液。
4.PCR扩增CKLF-1片段(1)引物CKLF-1扩增引物上游引物5’-ATG GAT AAC GTG CAG CCG AAA AT-3’下游引物5’-CCG CTC GAG TTA CAA AAC TTC TTT TTT TTC-3’β-actin扩增引物上游引物5-`ATG TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG CTG CG-3`，下游引物5-`CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACA TCT GC-3`。
(2)反应体系分别以16HBE细胞、外周血单个核细胞、TNF-α刺激16HBE细胞8、12、20小时后mRNA逆转录的cDNA为模板，进行PCR扩增。
反应体系含有10×PCR缓冲液2.5ul，1.25mM的dNTP 4ul，上游、下游引物各50pmol，模板2ul，Taq DNA聚合酶1U，加灭菌双蒸水至25ul。
以β-actin扩增作为PCR反应的对照。以质粒pcDI-CKLF1(含CKLF-1开放读码框架，构建见下文)扩增出的片段作为CKLF-1的对照。
(3)反应参数预变性94℃变性8分钟，加Taq酶0.8μl，94℃变性2分钟；
循环94℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；延伸72℃7分钟。
5.PCR产物鉴定及定量分析反应结束后，将PCR反应管置4℃冰箱10分钟。随后取6μl反应终产物，于2％琼脂糖凝胶(含溴乙锭0.5μg/ml)，6V/cm恒压下电泳30分钟。取凝胶在紫外线灯下观察，并在UVP暗箱式紫外凝胶图象分析仪上，对凝胶进行摄影记录和荧光亮度测定，并进行相对定量分析。
结果1.CKLF-1在正常人气道上皮细胞和外周血单个核细胞的表达如图1所示，作为PCR对照的反应管扩增出838bp的β-actin片段。用CKLF-1特异性引物，从质粒pcDI-CKLF1中扩增出作为CKLF-1对照的300bp片段(条带B)；同时从16HBE和PBMCs中亦扩增出300bp片段(条带C、D、E)。由图可见，CKLF-1在人气道上皮细胞高表达，在人外周血单个核细胞亦有一定水平的表达。
由于气道上皮细胞不仅具有防御保护和物理屏障的功能，而且具有介导炎症反应的功能。例如在环境因素刺激下，气道上皮细胞活化，分泌大量的粘附分子及细胞因子，这些物质又作用于气道上皮，引发一系列特征性哮喘气道炎症反应。CKLF-1在气道上皮细胞的表达提示该因子可能参与气道的炎症反应。
此外，已经证实哮喘的发生有炎性细胞的参与，炎性细胞分泌的生物活性物质可以介导炎症的发生。CKLF-1表达于炎性细胞(如外周血单个核细胞)提示当哮喘发生、炎细胞聚集于气道粘膜时，炎细胞可能表达并释放CKLF-1，参与哮喘炎症的发生。
2.前炎因子TNF-α对气道上皮细胞CKLF-1表达的影响。
如图2所示，前炎因子TNF-α刺激8小时、12小时后，人气道上皮细胞CKLF-1表达无明显变化；刺激20小时后，人气道上皮细胞的CKLF-1表达水平显著增高。
TNF-α的活化是哮喘发病的重要特征之一。由TNF-α活化而引发一系列前炎因子的分泌，构成作用复杂、效应广泛的细胞因子网络，最终导致哮喘炎症损伤及重塑的特征性反应。本实验发现气道上皮细胞CKLF-1可以被TNF-α活化，则CKLF-1可能通过细胞因子网络参与哮喘的气道炎症反应。发明人还发现前炎因子TNF-α刺激后，CKLF-1的表达并非即刻增强。说明CKLF-1表达的上调依赖于TNF-α的持续作用，或者其表达是受TNF-α刺激后上调的其它细胞因子作用而增强的，即CKLF-1对TNF-α的反应需要经历一定的时段。
综合上述结果，CKLF-1可能参与了哮喘气道炎症及重塑病变。
实施例2.CKLF-1介导的小鼠肺支气管病变用电脉冲裸基因注射法，将CKLF-1导入小鼠体内。观察注入CKLF-1后2至8周小鼠肺支气管的病理变化，以检测单一因子CKLF-1对肺支气管的直接病理作用。
1.质粒(1)质粒构建质粒pcDI将pcDNA3(Invitrogen公司)的BglI-kpnI片段与PcI(Promega公司)的BglI-kpnI片段置换，得到pcDI真核表达质粒。
质粒pcDI-CKLF-1EcoRI酶切PGEM-T-Easy-CKLF-1质粒，释放CKLF-1的ORF片段，连接至经EcoRI酶切并用CIP处理过的pcDI质粒中，再经酶切鉴定得到正向插入的CKLF-1的真核表达质粒pcDI-CKLF-1。
(2)质粒的大量提取与纯化将阳性菌株划板，37℃孵育过夜。挑取单克隆菌落置于3ml LB培养基和抗生素中37℃，200rpm摇8小时，将菌液转移入2000ml含抗生素的LB培养基中，37℃，200rpm摇过夜。质粒提取纯化及内毒素的处理方法和步骤严格按照EndoFree Plasmid Giga Kit(IAGEM-tip10000，Hilden，Germany)操作说明进行。
2.实验动物4-6周龄BALB/c健康小鼠(购自北京大学基础医学院实验动物所)共140只，雌雄各半，随机分为5组(见表1)。每组一半为实验鼠，一半为对照鼠。实验鼠分别为导入pcDI-CKLF-1后2w，3w，4w，6w，8w及相应的对照鼠。本文简称为2w组，3w组，4w组，6w组，8w组及对照组。
表1.CKLF-1转基因实验小鼠分组(只)组别 pcDI-CKLF1 pcDI对照2w组 10 103w组 20 204w组 20 206w组 10 108w组 10 103.CKLF-1基因的体内转移将经过无菌处理的质粒溶解到生理盐水中，调节浓度至1μg/μl，利用微量注射器将100μl(100ug)质粒溶液注射到实验鼠一侧大腿的股四头肌内，对照鼠于相同部位注射pcDI空质粒100ul(100ug)，注射后立即在注射部位插入两根电极，电极由不锈钢针制成，直径0.08mm，长10mm，插入深度5mm，电极间距5mm，电极连接至汤氏基因治疗仪(TS-A)，给予直流方波电脉冲刺激.参数为场强200v/cm，脉冲波宽40ms，刺激频率1Hz，作用时间6秒。然后分期分批颈椎脱臼处死。每组10只小鼠中4-6只用于形态观察，其余作支气管肺泡灌洗。
4.导入CKLF-1后动物的生理指标检测(1)动物的呼吸频率、体重、肺系数的观察记录3，4W组实验鼠与对照鼠的呼吸频率，称量体重后，摘取肺脏称其总重量，再计算肺系数。肺系数为肺重g/体重g×100。
(2)台盼蓝活体注射称取适量台盼蓝粉剂，溶于生理盐水，配成终浓度为1％的台盼蓝水溶液、然后煮沸10分钟灭菌。选取导入CKLF-1后3到4w的小鼠，以无菌手术操作方法，按2-5ml/kg之剂量将灭菌台盼蓝溶液注入小鼠腹腔，48小时后重复注射一次。再经历24小时后处死小鼠，取肺组织，立即固定。
(3)病理光镜标本制备将新鲜肺组织立即投入Bouin溶液中固定48小时以上，分别用70％、80％、90％、95％乙醇脱水12小时，每次脱水期间换液3次。再用无水乙醇脱水2小时，期间换液2次。随后用二甲苯透明45-60分钟，期间换液1次。65℃浸蜡一小时。浸蜡后的组织放入65℃石蜡包埋，4mm连续切片。用HE及改良Mallory染色，进行显微镜观察。
(4)电镜标本制备将新鲜肺组织立即固定于新近配制的4℃2.5％戊二醛溶液中，真空抽出肺内空气，按电镜常规制备标本。半薄切片定位后再行超薄切片。醋酸铀和枸橼酸铅双染色，在日立H-600透射电镜下观察。
(5)支气管肺泡灌洗按分组于第3、4、6、8周颈椎脱臼处死动物，气管切开插管，1640培养液灌洗，每次0.8ml共3次。灌洗液回收率＞80％，行细胞记数。沉淀涂片作HE染色或姬姆萨染色。
(6)灌洗液细胞涂片的制作，细胞计数和分类离心获得的BALF中细胞经沉淀，用1ml生理盐水稀释，取一部分进行计数，算出每毫升的细胞数，进而计算细胞总数；同时涂片，立即用电吹风筒的冷风档迅速吹干玻片，待细胞干燥固定后作HE染色或姬姆萨染色。光学显微镜下进行细胞分类，数500个细胞，计算细胞的百分比，用细胞总数乘以百分比数即得细胞的绝对数。
结果由电脉冲裸基因肌肉注射法导入的CKLF-1，成功地在注射局部获得表达产生相应的蛋白质，CKLF-1蛋白随血液循环到达肺部，从而导致了肺支气管的一系列病变(详见下文)。免疫组化显示的CKLF-1主要表达在气道上皮细胞和上皮下部分间质细胞，亦证实了CKLF-1体内转移的成功。
1.导入CKLF-1小鼠的呼吸频率及体重变化如表2所示，导入CKLF-1 3，4周后的小鼠与对照相比，在笼内活动增多，呼吸频率加快，体重降低。
表2.CKLF-1导入3、4周后小鼠呼吸频率及体重的变化组别 呼吸频率(b/min)n＝8体重(g)n＝32实验组107.8±20.7※ 22.93±1.88※对照组81.7±15.8 26.09±1.57※与对照组相比P＜0.052.CKLF-1对小鼠肺组织重量的影响如表3所示，肉眼观CKLF-1导入3、4周后小鼠与对照相比，肺体积膨大，有些肺组织表面明显充血。肺系数比对照组增加39.2％。
表3.CKLF-1对小鼠肺组织重量的影响组别 例数 肺系数实验组 n＝16 0.78±0.10※对照组 n＝16 0.56±0.07※与对照组相比P＜0.053.CKLF-1对小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞的影响如表4所示，对照组小鼠BALF细胞总数虽比其它资料显示为高，但实验各组细胞总数比对照组显著增高，各实验组均比对照组高200％以上，细胞总数增高至少维持8周。
表4.CKLF-1导入小鼠后BALF细胞总数的变化(×106)组别 对照组实验组3w 4.3±2.2 11.6±3.8※4w 4.5±2.9 10.7±3.5※6w 3.8±2.6 9.9±2.9※8w 3.3±1.7 9.5±3.2※与对照组相比P＜0.01，各实验组间差异无统计学意义。
如表5所示，实验组BALF中细胞的分类表明，大量细胞中以上皮细胞增加为著，为对照组的8.1倍。与对照组相比淋巴细胞及中性粒细胞亦明显增加。但两组均未见嗜酸性粒细胞(Eos)。
表5.CKLF-1导入3周后小鼠BALF细胞学变化(×106)组别 细胞总数 Eos 上皮细胞 L+N对照组4.3±2.2 0 0.8±0.200.7±0.2实验组11.6±3.8※ 0 6.5±2.6※ 2.3±0.7※注L淋巴细胞 N中性粒细胞与对照组相比P＜0.014.对小鼠气道上皮的影响(1)导入CKL-1后2周，小鼠气道上皮细胞充血水肿、脱落如图3A所示，对照组小鼠(注射pcDI空质粒)气道上皮细胞排列较整齐、无脱落，周围肺泡结构及肺血管无明显异常。实验组小鼠(注射pcDI-CKLF1)气道上皮细胞充血水肿，支气管变形，管腔内可见脱落的上皮及渗出物，周围肺组织明显充血水肿(图3B)。
(2)导入CKLF-1后3周，小鼠气道上皮杯状细胞增生如图4所示，小鼠气道上皮杯状细胞增生(支气管哮喘气道上皮表型改变的特征)，大量分泌物、渗出物充溢支气管管腔，管腔明显狭窄。在40×视野下放大增殖的杯状细胞，可见杯状细胞分泌的粘原颗粒。电镜检查可见上皮细胞纤毛几乎脱光。
(3)导入CKLF-1后6周，气道上皮严重受损，结构排列紊乱如图5A所示，平行排列的3个支气管已无正常形态，细胞排列紊乱、细胞连接破坏，大量上皮细胞与基底膜分离，脱落于管腔，几乎堵塞管腔。如图5B所示，平行排列的支气管上皮细胞排列紊乱、脱落。可见明显的气道粘膜皱折(哮喘气道病变的一个重要特征)。
(4)导入CKLF-1后2-8周，肺泡灌洗液中气道上皮细胞脱落导入CKLF-1后2周，肺泡灌洗液中检测到大量脱落的气道上皮细胞。3周后脱落的细胞成片或以集落形式出现直至第8周，脱落细胞以柱状上皮细胞为主。图6A示导入pcDI(对照)8周后，BALF中少量的上皮细胞；图6B示导入pcDI-CKLF1 8周后，BALF中以集落形式脱落的上皮细胞。
5.CKLF-1对小鼠气道基底膜的影响正常情况下，小鼠气道的光镜观察难以见到基底膜。而CKLF-1转入6周后，可见小鼠气道基底膜增厚。图7示变形的支气管，严重受损的上皮。紧贴上皮下的条状粉红色均一结构为基底膜。
6.CKLF-1对小鼠气道平滑肌的影响光镜下观察，正常豚鼠的小支气管周围有明显的平滑肌结构，围绕支气管呈环型排列，而正常小鼠很难见到平滑肌结构。而CKLF-1导入4周后，小鼠支气管平滑肌细胞增殖。图8示变形的支气管，粗大的气管粘膜皱折。粘膜下显著增厚的组织为增殖的平滑肌细胞。
7.CKLF-1对小鼠肺组织的影响导入pcDI后2周，对照组小鼠肺泡结构无明显异常(图9A)；导入pcDI-CKLF1后2周，实验组小鼠肺周边肺泡正常结构消失，肺泡壁增厚，肺泡间隔细胞聚集增生，肺间质充血水肿(图9B)。
导入CKLF-1后3周，小鼠肺泡壁明显增厚，大量免疫活性细胞聚集增生，增多的细胞有肺泡上皮细胞，成纤维细胞，巨噬细胞及嗜中性粒细胞。
Mallory改良染色(可显示胶原纤维)显示与对照组相比(图10A)，导入CKLF-1后4周，小鼠肺间质大量胶原纤维增生(图10B)。
8.KLF1对小鼠肺组织血管的影响与对照组(图11A)相比，导入CKLF-1后4周小鼠支气管上皮受损，基底膜增厚。气管旁肺小血管管壁明显增厚，胶原蛋白沉积，透明样变性(图11B)。
9.CKLF-1对小鼠肺组织巨噬细胞的影响苔盼兰活体注射一定时间后处死小鼠，取肺标本立即固定，常规切片，镜下观察。由图12A和12B可见肺结构支架及巨噬细胞吞噬的兰色颗粒。与对照相比(图12A)，导入CKLF-1的小鼠肺中兰色颗粒明显增多，表明巨噬细胞增生聚集。小鼠肺内苔盼兰颗粒不但数量多且体积大，表明肺组织巨噬细胞数量明显增多且活性增强(图12B)。
10.肺组织CKLF-1表达的免疫组化分析对照组小鼠无特异阳性反应，血管内的黄褐色颗粒为非特异性染色(图13A)；实验组小鼠气道上皮细胞内的黄褐色颗粒为CKLF-1免疫反应强阳性，CKLF-1主要表达在气道上皮细胞和上皮下部分间质细胞的胞质中，细胞核内无特异免疫反应，仍呈兰色(图13B)。
上述结果充分证明CKLF-1导入小鼠体内，直接介导了类似支气管哮喘气道粘膜活检及尸解所见气道损伤及重塑样改变。发明人推测CKLF-1介导气道损伤及重塑的机制在于(1)直接刺激气道上皮细胞、平滑肌细胞等的增殖(直接作用)；(2)作为趋化因子趋化并活化免疫细胞，活化的免疫细胞分泌大量细胞因子，进而引起一系列病变(间接作用)。
除引起气道损伤及重塑样改变，CKLF-1导入小鼠体内尚引起肺泡充血水肿、肺泡壁增厚、肺间质细胞如成纤维细胞、巨噬细胞聚集活化，肺间质胶原沉积，形成纤维化样改变。因此，CKLF-1还参与了肺间质纤维化的发生。
此外，发明人还发现(1)嗜酸性粒细胞(Eos)未必是哮喘气道损伤及重塑中不可缺少的因素。已往的研究认为Eos浸润是哮喘气道炎症的主要特征，本发明人将CKLF-1导入小鼠体内后的2至8周内，支气管肺泡灌洗液始终未见脱落的Eos，支气管肺组织病理切片亦未见粘膜Eos浸润。这些结果提示Eos在气道损伤及重塑中并非不可缺少的因素，仅针对Eos采取治疗措施或许有失偏颇。(2)嗜中性粒细胞是哮喘发病中的重要因素。本发明人证实了CKLF-1的肺内嗜中性粒细胞趋化活性，结合CKLF-1所致肺支气管病变，认为CKLF-1引起的嗜中性粒细胞聚集活化，在CKLF-1介导的哮喘样气道损伤及重塑中具有重要意义。
实施例3.哮喘患者外周血单个核细胞CKLF-1mRNA的表达及支气管粘膜CKLF-1蛋白的检测用RT-PCR方法观察哮喘病人外周血单个核细胞CKLF-1mRNA的表达，用免疫组织化学方法探测哮喘病人支气管粘膜CKLF-1蛋白水平的表达。以通过临床研究验证CKLF-1是否参与哮喘的发病。
1.哮喘病人外周血单个核细胞CKLF-1mRNA的表达(1)实验对象支气管哮喘组男12例，女9例。平均年龄30±7.2岁。入选标准1.符合1997年中华医学会制定的哮喘诊断标准病情轻或中度。2.三周内未使用糖皮质激素或其它抗炎药物。3.近期无呼吸道感染。4.皮肤过敏原测试，两种以上过敏原阳性。5近期喘息发作。
正常对照组21例自愿受试者男11例，女9例，年龄29±8.2岁。无哮喘、过敏性鼻炎及其它过敏疾病，无肿瘤及慢性炎症疾病。
(2)PCR检测CKLF-1的表达从哮喘患者及健康受试者抽取外周静脉血3-4毫升，肝素抗凝。外周血单个核细胞的分离方法如前所述。
提取PBMCs细胞总RNA，逆转录合成cDNA。
以PBMCs逆转录产物作为模板，进行PCR反应。扩增引物、反应体系及参数如前所述。
结果如图14所示，哮喘患者PBMCs的CKLF-1表达水平明显高于健康人。症状期哮喘组CKLF-1/β-actin比值显著高于正常人，分别为0.815±0.103和0.561±0.0862(P＜0.05)(见表6)。
表6.哮喘与对照PBMC的CKLF-1/β-actin比值X±SD组别 例数 CKLF-1/β-actin哮喘组 21 0.815±0.103※对照组 21 0.561±0.0862与对照组相比P＜0.052.哮喘病人支气管粘膜的病理观察及CKLF-1的免疫组化分析(1)实验对象哮喘组男4例，女4例，平均年龄30±7.2岁。入选标准1.符合1997年中华医学会制定的哮喘诊断标准病情中或重度。2.三周内未使用糖皮质激素或其它抗炎药物。3.近期无呼吸道感染排除其它慢性炎症。4.支气管镜检查的前一天进行肺通气功能和组织胺激发实验。
对照组男4例，女2例，年龄29±8.2岁。无哮喘过敏性鼻炎及其它过敏疾病，无肺部肿瘤及炎症感染疾病。因肺内局部阴影需作支气管纤维镜检查的非哮喘患者。
(2)纤维支气管镜检查嘱受试者早晨空腹，术前半小时口服安定2.5mg，阿托品0.3mg，术前30分钟5％利多卡因2ml+0.5％舒喘宁0.5-1ml混合雾化吸入，2％利多卡因局部喷雾麻醉口咽喉部，术前用麻黄素和2％利多卡因处理鼻腔，受试者仰卧，吸入氧气，监测其心率，操作按常规将支气管纤维镜经鼻咽腔插入气管，然后分别在右上叶嵴，右中叶嵴钳取粘膜组织2-3块，放入1％多聚甲醛固定液中固定。
(3)病理观察样本制备将活检肺组织即刻放入10％福尔马林液中固定过夜。70％乙醇2小时→80％乙醇1小时→95％乙醇1小时→95％乙醇1小时→无水乙醇2小时→无水乙醇1.5小时→无水乙醇1.3小时，进行脱水处理。TO生物透明剂(广西松香厂)依次处理30分钟、1小时、30分钟。50℃低温浸蜡1小时。浸蜡后的组织放入60℃石蜡中包埋。4mm连续切片。HE染色，显微镜观察并摄影。
(4)免疫组化取2张石蜡包埋组织切片，二甲苯脱蜡2次各5分钟。90％，80％，70％乙醇水化各5分钟。自来水冲洗2分钟，蒸馏水漂洗2次。置柠檬酸钠缓冲液中于微波炉92-98℃加温1-2分钟，室温冷却。置于3％H2O2漂洗10分钟。加入50μl过氧化物酶阻断剂室温孵育10分钟。PBS漂洗5分钟各3次。加入50μl非免疫性动物血清。室温孵育10分钟，吸取多余液体。
2张玻片分别加入50μl PBS、CKLF-1单克隆抗体，室温孵育60分钟，PBS洗涤3次。加入50μl生物素标记二抗，室温孵育10分钟，PBS洗涤3次。加入50μl链霉素亲和素-过氧化物酶，室温孵育10分钟，PBS洗涤3次。加入100μl新配制DAB液，显微镜下观察染色情况，自来水冲洗5分钟终止反应。苏木素复染。自来水冲洗，自然干燥，用中性树胶封片。
结果1.支气管粘膜活检的组织学观察(1)对照组(健康受试者)正常气道上皮由多种细胞组成，如假复层纤毛柱状上皮细胞、杯状细胞、基底细胞等。尽管上皮的多种细胞排列参差不齐，但所有细胞均紧贴于基底膜之上，仍为一单层细胞(假复层上皮)。靠近顶腔的上皮细胞紧密相连，形成上皮屏障。基底细胞靠近基底膜表面。杯状细胞很少。
(2)实验组(哮喘患者)
纤维支气管镜检查发现，8例哮喘患者的气道粘膜充血水肿，严重者粘膜发白，支气管管径狭窄。2例病人的支气管肺泡灌洗液细胞涂片可见大量气道上皮细胞呈片状脱落。支气管粘膜活检显示患者气道粘膜主要以淋巴细胞、Eos浸润为主，气道上皮细胞破坏，细胞外基质明显增多。其中1例患者气道粘膜无明显Eos浸润，其气道上皮层的纤毛细胞及杯状细胞几乎全部脱落，仅剩少量基底细胞附于基底膜之上；基底膜显著增厚，透明样变性；间质中胶原沉积、大量细胞聚集及平滑肌增生。这些充分表明支气管哮喘是伴有显著气道结构改变的气道炎症。
2.支气管粘膜CKLF-1蛋白表达的免疫组化分析(1)对照组(健康受试者)正常对照上皮纤毛排列整齐形成一完整屏障，未见基底膜结构。CKLF-1免疫反应呈阴性，无特异性显色(图15A)。
(2)实验组(哮喘患者)蛋白免疫组化分析显示CKLF-1mRNA在患者PBMCs(包括单个核细胞和淋巴细胞，以淋巴细胞为主)高表达。8例中的5例患者部分上皮细胞及上皮下间质细胞免疫反应呈阳性。其中1例重症患者的阳性反应最为明显(图15B)。
根据上述结果，认为哮喘患者在细胞水平上至少有淋巴细胞、气道上皮细胞、上皮下间质的成纤维细胞及巨噬细胞处于活化状态，因而使CKLF-1表达水平增高。实验结果显示哮喘患者尤其重症患者的气道上皮及上皮下间质均有高水平CKLF-1蛋白表达，推测CKLF-1有加强间质及平滑肌增殖的作用。作为气道门户的上皮细胞最早接受环境因素的刺激，由此激活上皮下成纤维细胞，启动逐级放大的瀑布样炎症链式反应及炎症损伤后的修复反应。
权利要求
1.一种体外检测方法，包括检测来自宿主的样品中趋化素样因子-1的过量表达，确定样品炎性损伤的病理状态。
2.如权利要求1的方法，其中所述炎性损伤是支气管哮喘气道炎性损伤及重塑和肺纤维化。
3.如权利要求2的方法，其中所述来自宿主的样品是人外周血细胞、肺手术切除组织、肺支气管粘膜组织。
4.一种制作器官炎性损伤的动物模型的方法，包括将趋化素样因子-1导入除人类之外的哺乳动物体内。
5.如权利要求4的方法，其中所述炎性损伤是支气管哮喘气道炎性损伤及重塑和肺纤维化。
6.如权利要求5的方法，其中采用注射的方法将趋化素样因子-1导入动物体内。
7.如权利要求5的方法，其中采用雾化吸入的方法将趋化素样因子-1导入动物体内。
8.如权利要求4-7任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是小鼠。
9.趋化素样因子-1在制备具有治疗器官炎性损伤作用的抗体和拮抗剂中的用途。
10.如权利要求9的方法，其中所述炎性损伤是支气管哮喘气道炎性损伤及重塑和肺纤维化。
全文摘要
本发明公开了趋化素样因子－1在检测样品炎性损伤的病理状态、制作器官炎性损伤的动物模型、制备具有治疗器官炎性损伤的CKLF－1抗体和拮抗剂中的用途，尤其是在支气管哮喘气道损伤及重塑和肺纤维化中的用途。
文档编号G01N33/68GK1420358SQ0113996
公开日2003年5月28日 申请日期2001年11月21日 优先权日2001年11月21日
发明者钟南山, 谭亚夏, 马大龙, 韩文玲, 宋泉声, 陈英玉 申请人:广州呼吸疾病研究所, 北京大学医学部