专利名称：趋化因子α－2的制作方法
技术领域：
本发明部分地涉及新鉴定的多聚核苷酸和多肽；所述多聚核苷酸和多肽的变体和衍生物；用于制备所述多聚核苷酸和多肽及其变体和衍生物的方法；所述多肽的激动剂和拮抗剂；以及所述多聚核苷酸、多肽、变体、衍生物、激动剂和拮抗剂的用途。具体地说，就此而言，本发明涉及下文称为CKα-2的人趋化因子α-2的多聚核苷酸和多肽。
背景技术：
控制各种细胞迁移和“通行”的能力受一亚组因子或蛋白质的控制，在这些因子和蛋白质中，趋化因子是其中的一类。
趋化因子(也称为intercine细胞因子)是结构和功能相关性趋化细胞因子中的一个亚家族。这些分子的大小为8-10kd。一般说来，在氨基酸水平上，趋化因子有20％-70％的同源性，而且其特征在于有四个可形成两个二硫键的保守半胱氨酸残基。依据前两个半胱氨酸残基的排列形式，可将趋化因子分成两个亚家族α和β。在α亚家族中，所述前两个半胱氨酸被一个氨基酸隔开，因此，将其称为“C-X-C”亚家族。在β亚家族中，所述两个半胱氨酸在相邻的位置上，因此将其称为“C-C”亚家族。到目前为止，已经在人中鉴定了该家族的至少8个不同的成员。
intercine细胞因子有许多功能，一个品质(hallmark)特征是其具有引发不同类型细胞(包括单核细胞、嗜中性细胞、T淋巴细胞、嗜碱细胞和成纤维细胞)趋化性迁移的能力。许多趋化因子有促炎活性并与炎症反应过程中的多个步骤有关。这些活性包括刺激组氨酸释放、溶酶体酶和白三烯释放、提高靶免疫细胞与内皮细胞的粘附、增强补体蛋白质的结合，诱导粒细胞粘附分子和补体受体的表达，以及呼吸爆发(burst)。除其与炎症有关外，已经表明有些趋化因子还有其它活性。例如，巨噬细胞炎性蛋白1(MIP-1)能够抑制造血干细胞增殖，血小板因子-4(PF-4)是内皮细胞生长的强抑制剂，白细胞介素-3(IL-3)促进角质形成细胞的增殖，而GRO是黑色素瘤细胞的自分泌生长因子。
就所述各种生物活性而言，人们毫不怀疑趋化因子与许多生理学和疾病状态包括淋巴细胞通行、伤口愈合、造血调节和免疫疾病如过敏反应、哮喘和关节炎有关。
“C-C”分枝的成员对下列细胞有作用可破坏寄生虫以降低寄生虫性感染及在呼吸系统的呼吸道中引起慢性炎症的嗜酸细胞；可抑制脊椎动物中肿瘤形成的巨噬细胞；以及可释放在过敏性炎症中起作用的组氨酸的嗜碱细胞。但是，一个分枝的成员可能会对正常应答另一个趋化因子分枝的细胞有影响，因此，各分枝的各成员没有一成不变的作用。
尽管C-C分枝的成员主要作用于单核细胞，C-X-C分枝的成员主要作用于嗜中性细胞，但基于这样的准则，无法将一种独特的趋化剂特性赋予一种趋化因子。来自某一家族的一些趋化因子具有另一家族的一些特征。
本发明多肽含有“C-X-C”区的保守半胱氨酸残基，并含有与已知趋化因子同源的氨基酸序列。
显然，仍需要能够调节不同类型细胞的迁移并在机能障碍和疾病中发挥作用的因子。因此，需要能够鉴定并表征调节细胞特别是免疫系统细胞的迁移并在机能障碍或疾病的预防、缓解或校正中能够发挥作用的所述因子。
发明综述为了这些及其它目的，本发明的目的之一是提供多肽，特别是通过与
图1(SEQ ID NO:2)和图2(SEQ ID NO:3)所列氨基酸序列以及其它蛋白质如图3和4中所列中国仓鼠GRO蛋白质(SEQ ID NO:4)的已知氨基酸序列之间的同源性，而鉴定为新的CKα-2的多肽。
此外，本发明的另一目的是提供编码CKα-2的多聚核苷酸，特别是编码本文命名为CKα-2的多肽的多聚核苷酸。
在本发明此方面特别优选的实施方案中，所述多聚核苷酸含有编码图1和图2所示序列(SEQ ID NO:1)中人CKα-2多肽的区域。
根据本发明的所述方面，提供了编码由人cDNA表达的成熟多肽的分离的核酸分子，所述人cDNA包含于1996年1月2日保藏的ATCC97400中。
根据本发明的所述方面，还提供了编码人CKα-2多肽的分离的核酸分子，包括mRNA、cDNA、基因组DNA，在本发明所述方面的其它实施方案中，还提供了生物学、诊断、临床或治疗中有用的变体，其类似物或衍生物，或其片段，包括变体、类似物和衍生物的片段。
本发明所述方面特别优选的实施方案包括人CKα-2的天然等位基因变体。
本发明的目的之一是提供了CKα-2多肽，特别是人CKα-2多肽，所述多肽可用于治疗目的，如治疗和/或预防肿瘤、慢性感染、白血病、T细胞介导的自身免疫性疾病、寄生虫感染、牛皮癣、哮喘、过敏反应，调节血细胞生成，刺激生长因子活性，抑制血管生成并促进伤口愈合。
根据本发明的所述方面，提供了本文命名为CKα-2的人源新多肽及其在生物学、诊断或治疗中有用的片段、变体和衍生物，这些片段的变体和衍生物，以及上述产物的类似物。
本发明该方面特别优选的实施方案包括人CKα-2基因的天然等位基因编码的人CKα-2的变体。
本发明的另一目的是提供生产前述多肽、多肽片段、变体和衍生物、这些变体和衍生物的片段，以及上述产物的类似物的方法。在本发明该方面优选的实施方案中，提供了生产前述CKα-2多肽的方法，这些方法包括在可表达宿主中人CKα-2多肽的条件下，培养宿主细胞，然后回收所表达的多肽，所述宿主细胞中含有以表达方式掺入到其中的外源-衍生的编码人CKα-2的多聚核苷酸。
根据本发明的另一目的，提供了含前述多肽和多聚核苷酸的产物、组合物，以及将前述多肽和多聚核苷酸用于特别是研究、生物学、临床和治疗目的的工艺和方法。
根据本发明该方面特定的优选实施方案，提供了特别用于下列工作的产物、组合物和方法通过确定CKα-2多肽或编码CKα-2的mRNA评估细胞中CKα-2的表达；测定CKα-2基因中的遗传变异和畸变，如缺陷；将CKα-2多肽或多聚核苷酸施用给生物体以增强CKα-2功能或纠正CKα-2功能异常。
根据本发明此方面和其它方面的特定优选实施方案，提供了可与人CKα-2序列杂交的探针。
在本发明该方面其它优选的实施方案中，提供了抗CKα-2多肽的抗体。在其中特别优选的实施方案中，抗体与人CKα-2有高度的选择性。
根据本发明的另一方面，提供了CKα-2激动剂。优选的激动剂是模拟CKα-2并与CKα-2-结合分子或受体分子结合，引发或增强CKα-2诱导的反应的分子。另外优选的激动剂是与CKα-2或CKα-2多肽或与其它CKα-2活性调节剂相互作用，从而提高或增强CKα-2的一种或一种以上的作用的分子。
本发明另一方面还提供了CKα-2拮抗剂。优选的拮抗剂是模拟CKα-2以便与CKα-2受体或结合分子结合但不引发CKα-2诱导的一种或一种以上反应的分子。其中优选的拮抗剂是与CKα-2结合或相互作用以便抑制CKα-2的一种或一种以上的作用或者抑制CKα-2表达以治疗由CKα-2介导的疾病或功能异常的分子。
本发明的另一方面是提供了用于体外施用于细胞，离体(ex vivo)施用于细胞或体内施用于细胞或者施用给多细胞生物体的含有CKα-2多聚核苷酸或CKα-2多肽的组合物。在本发明该方面特别优选的实施方案中，所述组合物含有CKα-2多聚核苷酸以便在待治疗疾病的宿主生物体中表达CKα-2多肽。在这方面特别优选的是在待治疗与CKα-2异常内源活性相关之功能异常的人患者中表达CKα-2多肽。
从下列描述中，本发明的其它目的、特征和优点对本领域技术人员就会变得显而易见。但是，应理解下列描述和具体实施例尽管描述了本发明的优选实施方案，但仅仅是说明性的。在阅读了下列描述和本发明公开的其它部分后，在本发明所公开精神和范围内的各种改变和修饰对于本领域技术人员来说都将是显而易见的。
附图描述下列附图描述了本发明的某些实施方案。它们仅是说明性的，并不对本发明公开的内容构成限制。
图1描述了人CKα-2的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)和从SEQ IDNO:1中第43-45位的AUG密码子开始的推断的人CKα-2蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。该蛋白质有一约28个氨基酸残基(划线部分)的推测的前导序列，推断的分子量为约10千道尔顿(kDα)。
图2描述了人CKα-2的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)和从SEQ IDNO:1中第79-81位的AUG密码子开始的推断的人CKα-2蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。该蛋白质有一约16个氨基酸残基(划线部分)的推测的前导序列，推断的分子量为约8.6kDa。
图3说明了SEQ ID NO:2的CKα-2与中国仓鼠GRO多肽(SEQID NO:4)的氨基酸序列间的相似性。
图4说明了SEQ ID NO:3的CKα-2与中国仓鼠GRO多肽(SEQID NO:4)的氨基酸序列间的相似性。
图5描述了用标明的技术推断的SEQ ID NO:2所示CKα-2的结构和功能特征，作为氨基酸序列的函数。
优选实施方案的详细描述提供下列说明性解释以便有利于理解本文特别是实施例中常用的特定术语。提供这些解释仅是为了方便理解，并不构成对本发明的限制。
术语DNA的“消化”指用仅作用于所述DNA中特定序列的限制酶催化切割所述DNA。本文所指的各种限制性酶是市售的，而且它们的反应条件、辅因子以及使用所需的其它要求是已知的并对本领域技术人员来说是常规的。
为了进行分析，通常在约20μl反应缓冲液中，将1μg的质粒或DNA片段用约2单位酶消化。为了分离用于质粒构建的DNA片段，通常在成比例的较大体积中，用20-250单位的酶消化5-50μgDNA。用于特定限制酶的适宜缓冲液和底物用量描述于标准实验室手册，如下文参考的那些，而且供应商也有具体说明。
在37℃保温约1小时是常用的，但可根据标准方法、供应商的说明和反应的特点相应地改变条件。消化后，可利用本领域技术人员熟知的方法，通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析反应产物，纯化片段。
术语“遗传元件”一般指含有编码多肽之区域或调节所述多肽在宿主细胞中的转录或翻译或对于所述多肽的表达比较重要的其它过程的区域的多聚核苷酸，或者是含有编码多肽的区域以及与其有效相连的调节表达的区域的多聚核苷酸。
可将遗传元件包含在作为附加元件复制的载体内；即作为物理上独立于宿主细胞基因组的分子。可将其包含于微型染色体中，如在真核细胞内通过氨甲喋呤筛选扩增已转染的DNA的过程中产生的那些微型染色体中。也可将遗传元件包含在宿主细胞基因组内，它们不是以其天然状态存在于宿主细胞内的，而是经各种操作如分离、克隆后，以纯DNA或在载体中等形式导入宿主细胞。
术语“分离的”指从其天然状态“通过人手”改变了的，即如果是天然的，那它已被改变或从其源环境中取出，或这两种情况兼而有之。例如，按照本文所用的该术语，在活动物体内以天然状态存在的天然多聚核苷酸或多肽不是“分离的”，但与其天然状态共存物质分开的相同多聚核苷酸或多肽就是“分离的”。例如，就多聚核苷酸而言，术语分离的指将其与其天然存在的染色体和细胞分开。
作为分离的一部分或分离后，可将这类多聚核苷酸与其它多聚核苷酸如DNA相连用于诱变，以形成融合蛋白，并用于例如在宿主中增殖或表达。可将所述分离的多聚核苷酸单独或与其它多聚核苷酸如载体相连导入培养的或全生物体内的宿主细胞中。导入培养的或全生物体内的宿主细胞后，按照本文所用的该术语，这类DNA仍是分离的，因为它们不是天然形式或在天然环境中。相似地，所述多聚核苷酸和多肽可以存在于非天然存在的组合物如培养基制剂中、用于将多聚核苷酸或多肽导入如细胞内的溶液中，用于化学或酶促反应的组合物或溶液中，并且仍将这些分离的多聚核苷酸或多肽保持在本文所用术语的意义内。
术语“连接”指在两个或多个多聚核苷酸(常常是双链DNA)之间形成磷酸二酯键的过程。用于连接的技术是本领域熟知的，用于连接的方法描述于标准实验室手册和参考文献中，如Sambrook等，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989)和Maniatis等，146页，如下文引入的。
术语“寡核苷酸”指相对短的多聚核苷酸。该术语常常指单链脱氧核糖核苷酸，但也可指单链或双链核糖核苷酸，RNA:DNA杂合体和双链DNA等。
寡核苷酸如单链DNA探针寡核苷酸经常用化学方法如应用于自动寡核苷酸合成仪上合成的那些方法进行合成。但是，也可用各种其它方法，包括体外重组DNA介导的技术以及通过在细胞和生物体内表达DNA等方法来制备寡核苷酸。
首先，化学合成的DNA通常没有5’磷酸基。这类寡核苷酸的5’末端不能作为通过连接反应形成磷酸二酯键的底物，在所述连接反应中使用常用于形成重组DNA分子的DNA连接酶。在需要连接这些寡核苷酸时，可通过标准技术如使用激酶或ATP的那些技术加上一个磷酸基。
化学合成的寡核苷酸的3’末端通常带有一个游离的羟基，在存在连接酶如T4 DNA连接酶的情况下，该3’末端可很容易地与另一多聚核苷酸如另一寡核苷酸的5’磷酸基形成磷酸二酯键。正如熟知的，如果需要的话，在连接前通过除去后一多聚核苷酸的5’磷酸基，可选择性地抑制该反应。
根据本领域技术人员熟悉的标准命名法，本文通常用小写字母p和/或之后跟有大写字母和/或数字来命名术语“质粒”。
本文公开的起始质粒是市售的，公众可非限制性地得到的，或者可通过熟知的常规应用、公开的方法利用可得到的质粒构建而成。本发明可用的许多质粒和其它克隆和表述载体是本领域技术人员熟知并很容易得到的。此外，技术人员可很容易构建适用于本发明的任何数量的其它质粒。根据本发明公开的内容，对于本领域技术人员而言，本发明中这些质粒以及其它载体的特性、构建和用途是显而易见的。
术语“多聚核苷酸”通常指任何多聚核糖核酸或多聚脱氧核糖核酸，它们可以是未被修饰的RNA或DNA或者是已被修饰的RNA或DNA。因此，例如，本文所用的多聚核苷酸尤其指单链和双链DNA，作为单链和双链区域的混合物的DNA，单链和双链RNA，以及作为单链和双链区域的混合物的RNA，含有可以是单链、或通常是双链或单链-和双链区域的混合物的DNA和RNA的杂合分子。另外，本文所用的多聚核苷酸也可指含RNA或DNA或同时含有RNA和DNA的三链区域。这类区域中的链可以来自相同的分子或不同的分子。所述区域可包括所有一种或多种分子，但通常仅涉及一些分子的某个区域。具三螺旋区域的分子之一通常是寡核苷酸。
如本文所用，术语多聚核苷酸包括上述含一个或多个修饰碱基的DNA或RNA。因此，本文术语“多聚核苷酸”也指出于稳定性或其它原因而带有修饰骨架的DNA或RNA。此外，含有不常用碱基如肌苷或修饰的碱基如三苯甲基化碱基(仅举两例)的DNA或RNA也是本文所用术语意义上的多聚核苷酸。
可以理解为了本领域技术人员已知的多种有用目的，对DNA和RNA可进行各种修饰。本文所用术语多聚核苷酸包括多聚核苷酸的化学、酶学或代谢修饰形式，以及作为病毒和细胞(尤其包括简单和复杂细胞)特征的DNA和RNA的化学形式。
本文所用术语“多肽”包括下文所述所有多肽。多肽的基本结构是熟知的，并在本领域的许多教科书和其它文献中作了描述。在本发明中，本文所用的该术语指含有通过肽键在线性链中彼此相连的两个或多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所运用，该术语指短链或长链两种情况，短链在本领域中通常指诸如肽、寡肽和寡聚物等，长链在本领域中通常指许多类型的蛋白质。
可以理解多肽常含有一般被称为20种天然氨基酸的20种氨基酸以外的氨基酸，而且可通过天然方法如加工和其它翻译后修饰，或者是本领域熟知的化学修饰技术，对给定多肽中的许多氨基酸，包括末端氨基酸进行修饰。甚至多肽中天然进行的常规修饰也很多，在此不能一一列举，但在基础性教材和更详细描述的专论以及许多研究文献中作了详细描述，这对于本领域技术人员是熟知的。在本发明多肽中可能存在的已知修饰的一些例子有乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、类脂或类脂衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基作用、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧基化、糖基化作用、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫化、转运RNA介导的将氨基酸加到蛋白质上如精氨酸化，以及遍在蛋白化。
这类修饰是本领域技术人员熟知的，而且在科学文献中已有很详细的描述。在大多数基础教科书如Creghhton,T.E.，蛋白质结构和分子特性，第二版，W.H.Freeman and Company，纽约(1993)中详细描述了几种特别常规的修饰如糖基化、类脂连接、硫化、谷氨酸残基的γ羧基化、羟基化和ADP核糖基化。这方面还有许多综述，如由Wold.F.，“翻译后的蛋白质修饰展望和前景”，《蛋白质翻译后的共价修饰》，Johnson,B.C.编，科学院出版社，纽约(1983),1-12页；Seifer等“蛋白质修饰物和非蛋白质辅因子的分析”，《酶学方法》，182:626-646(1990)和Rattan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.63:48-62(1992)提供的那些综述。
正如熟知和上述提到的，应理解多肽不总是完全线性的。例如，多肽可以由于遍在蛋白化而具有分枝；也可以是环状的(同时带有或不带有分枝)，这通常是翻译后事件的结果，这些事件包括天然加工事件和因非天然的人为操作而发生的事件。通过非翻译的天然方法和完全合成法可以合成环状多肽、具分枝的多肽和具分枝的环状多肽。
修饰可发生在多肽内的任何位置，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。事实上，通过共价修饰而发生的多肽中氨基或羧基或者这两种基团的阻断普遍存在于天然和合成多肽中，这类修饰也可存在于本发明多肽中。例如，大肠杆菌中生产的多肽在蛋白水解加工前，其氨基末端残基几乎总是N-甲酰甲硫氨酸。
多肽中发生的修饰常常是其制备方法的结果。例如，对于通过在宿主中表达克隆基因而生产的多肽来说，其中的修饰的性质和程度主要决定于宿主细胞的翻译后修饰能力和该多肽的氨基酸序列中存在的修饰信号。例如，正如熟知的，通常在细菌宿主如大肠杆菌中不发生糖基化。因此，当需要糖基化时，应在可发生糖基化的宿主通常是真核细胞中表达多肽。昆虫细胞中常常进行与哺乳动物细胞相同的翻译后糖基化作用，鉴于此原因，已经建立了昆虫细胞表达系统以有效表达特别是具有天然糖基化方式的哺乳动物蛋白。相似的考虑也适用于其它修饰。
可以理解，在给定多肽的数个位点，可以存在相同或不同程度的相同类型的修饰。另外，一个给定多肽中可以含有多种类型的修饰。
总之，如本文所用的，术语多肽包括所有这类修饰，特别是在通过在宿主细胞中表达多肽而合成的多肽中存在的那些修饰。
如此术语在本文所运用的那样，术语多聚核苷酸或多肽的“变体”是分别不同于标准多聚核苷酸或多肽的多聚核苷酸或多肽。在下文和本发明公开的其它地方更详细描述了此意义上的变体。
多聚核苷酸变体是在核苷酸序列上与另一多聚核苷酸-标准多聚核苷酸不同的变体。通常，这些差异是有限的，因而标准和变体的核苷酸序列在总体上是非常相似的，并在许多区域中是相同的。如下文所述，变体的核苷酸序列中的改变可以是沉默的，即它们不改变由该多聚核苷酸编码的氨基酸。当改变仅限于这类沉默改变时，变体将编码与标准序列有相同氨基酸序列的多肽。再如下文所述，变体的核苷酸序列中的改变可以改变由标准多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如下文所述，这类核苷酸改变可以产生标准序列编码的多肽内的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。
多肽变体是在氨基酸序列上不同于标准多肽的变体。通常这些差异是有限的，以使标准和变体的序列在总体上是非常相似的，并在许多区域中是相同的。变体和标准多肽可以因一个或多个取代、添加、缺失、融合和截短(可以以任何组合存在)而在氨基酸序列上有所不同。
本文所用术语“受体分子”指可与本发明CKα-2多肽特异性结合或相互作用的分子，不仅包括优选的典型受体，而且包括可与本发明多肽特异性结合或相互作用的其它分子(也分别称为“结合分子”和“相互作用分子”，以及“CKα-2结合分子”和“CKα-2相互作用分子”)。本发明多肽与这类分子(包括受体分子，或结合分子，或相互作用分子)之间的结合对于本发明多肽是独有的(这是非常优选的)，或者对于本发明多肽是高度特异性的(这是较优选的)，或者对于包括本发明多肽在内的一组蛋白质是高度特异性的(这是优选的)，或者对于至少一组中包括本发明多肽的数组蛋白质是特异性的。受体还可以是非天然的，如可与本发明多肽特异性结合的抗体和抗体衍生的试剂。
本发明涉及如下文更详细描述的新CKα-2多肽和多聚核苷酸等。具体地说，本发明涉及新的人CKα-2多肽和多聚核苷酸，所述新的人CKα-2与中国仓鼠GRO的氨基酸序列同源。本发明特别涉及具有图1和图2所示核苷酸和氨基酸序列的CKα-2多肽，以及保藏克隆中的人cDNA的CKα-2核苷酸序列和氨基酸序列。图1和图2是通过测定保藏克隆的人cDNA序列而得到的。因此，当这些序列之间存在任何差异时，以保藏克隆的序列为准，对图1和图2序列的任何参考包括对保藏克隆的人cDNA序列的参考。
本发明一方面提供了一种分离的多聚核苷酸，该多聚核苷酸编码具有图1和图2的推断氨基酸序列的CKα-2多肽。
利用本文提供的信息，如图1或图2中所列的多聚核苷酸序列，通过标准克隆和筛选方法，如将来自以人组织细胞为原料的mRNA用于克隆cDNA的那些方法，可以得到编码CKα-2多肽的本发明多聚核苷酸。作为本发明的说明，图1和图2所列的多聚核苷酸是在来自人6周龄胚胎的细胞的cDNA文库中发现的。
如对保藏克隆中编码CKα-2的人cDNA的测序结果所示，本发明的人CKα-2多肽与趋化因子家族的其它蛋白质在结构上是相关的。将由此得到的cDNA序列列在图1和图2，该cDNA序列含有2个可能的开放阅读框架。图1中所示的一个开放阅读框架编码一个具有约111个氨基酸残基的蛋白质(SEQ ID NO:2)，该蛋白质的推测分子量为约10kDa，并含有约28个氨基酸的推断前导序列。该蛋白质与已知蛋白质(图3)中的中国仓鼠GRO(SEQ ID NO:4)的同源性最大。图1的完整CKα-2蛋白质与中国仓鼠GRO(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列有约32％的同一性和约50％的相似性。
图2中所示的第二个开放阅读框架编码约99个氨基酸残基的蛋白质(SEQ ID NO:3)，该蛋白质的推测分子量为约8.6kDa，并含有约16个氨基酸的推断前导序列。该蛋白质与已知蛋白质(图4)中的中国仓鼠GRO(SEQ ID NO:4)的同源性最大。
已经表明，在利用不同AUG密码子的基础上，许多真核mRNA可编码一个以上的转录本。在真核细胞中，以AUG密码子作为翻译起始点的选择是由该密码子相对于mRNA分子5’末端帽的位置以及该密码子周围的核苷酸同时决定的。如果第一个AUG密码子很不适于转录的起始，那么许多核糖体会跳过该密码子并继续前进到该mRNA分子中的另一AUG密码子。结果，从同一mRNA分子可产生多个翻译产物。编码本发明CKα-2多肽的cDNA就可能是从这种mRNA分子产生的。此外，推测产生了SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的两个翻译产物。这些产物的推断的前导序列的长度有所不同。
本发明的多聚核苷酸可以是RNA形式如mRNA，或DNA形式包括如通过克隆得到的或通过化学合成技术生产的或通过它们的组合方法生产的cDNA和基因组DNA。该DNA可以是双链的或单链的。单链DNA可以是编码链(也称为有义链)，也可以是非编码链(也称为反义链)。
编码所述多肽的编码序列可能与图1和图2所示多聚核苷酸的编码序列相同。它也可以是具有不同序列的多聚核苷酸，该多聚核苷酸由于遗传密码的简并性也可编码图1和图2的DNA的多肽。
编码图1和图2多肽的本发明多聚核苷酸可包括但不限于成熟多肽本身的编码序列；编码成熟多肽的编码序列和其它编码序列，如编码前导和分泌序列诸如前-或原-或前原-蛋白质序列的那些编码序列；带有或不带有前述的其它编码序列的成熟多肽的编码序列和其它非编码序列(该非编码序列包括下述序列但不限于这些内含子和非编码5’和3’序列，如在转录、mRNA加工-包括剪切和多聚腺苷酸化信号中起作用如结合核糖体和稳定mRNA的被转录但不被翻译的序列；编码其它氨基酸的其它编码序列，如提供其它功能的那些编码序列。因此，例如，可将所述多肽与有利于融合蛋白纯化的标记序列如肽融合。在本发明该方面的某些优选实施方案中，该标记序列是六组氨酸肽，如在pQE载体(Qiagen,Inc.)中提供的标记。其中许多标记序列是市售的。例如如Gentz等，美国国家科学院院报，86:821-824(1989)中所述，六-组氨酸的存在可方便地纯化融合蛋白。HA标记对应于流感血凝素蛋白来源的表位，在诸如Wilson等，细胞，37:767(1984)对其已有描述。
根据前述，本文所用术语“编码多肽的多聚核苷酸”包括含有编码本发明多肽特别是具有图1和图2所示氨基酸序列的人CKα-2多肽的序列的多聚核苷酸。该术语包括含有编码所述多肽的单个连续区(或多个不连续区，如由内含子所中断)以及其它区域(也可含有编码和/或非编码序列)的多聚核苷酸。
本发明还涉及上述编码具有图1和图2的推测氨基酸序列的多肽片段、类似物和衍生物的多聚核苷酸的变体。所述多聚核苷酸变体可以是天然变体如天然存在的等位基因变体，或可以是未知天然存在的变体。所述多聚核苷酸的这类非天然变体可通过诱变技术包括应用于多聚核苷酸、细胞或生物体的那些技术来制备。
就此而言，其中变体是因核苷酸取代、缺失或添加而与前述多聚核苷酸有所不同的变体。所述取代、缺失或添加可涉及一个或多个核苷酸。这些变体可以在编码区或非编码区或这两种区中同时有所改变。在编码区的改变可产生保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。
本发明该方面特别优选的实施方案是编码具有图1和图2所示CKα-2氨基酸序列的多肽的多聚核苷酸；其变体、类似物、衍生物和片段，以及这些变体、类似物和衍生物的片段。
该方面还特别优选的是编码CKα-2变体、类似物、衍生物和片段、以及这些片段的变体、类似物和衍生物的多聚核苷酸，它们含有图1和图2的CKα-2多肽的氨基酸序列，其中一些、几个、5-10、1-5、1-3、2、1个氨基酸残基或无氨基酸残基以任何组合发生了取代、缺失或增加。其中特别优选的是沉默取代、添加和缺失，它们不改变CKα-2的特性和活性。该方面还特别优选的是保守取代。最佳是编码具有图1和图2的氨基酸序列而不带有取代的多肽的多聚核苷酸。
本发明其它优选的实施方案是与编码具有图1和图2所示氨基酸序列的CKα-2多肽的多聚核苷酸至少有70％相同的多聚核苷酸，以及与这类多聚核苷酸互补的多聚核苷酸。或者，最佳的是含有一个与编码保藏克隆的人cDNA的CKα-2多肽的多聚核苷酸有至少80％相同的区域的多聚核苷酸和与该多聚核苷酸互补的多聚核苷酸。在这方面，与所述多聚核苷酸至少90％相同的多聚核苷酸是特别优选的；在这些特别优选的多聚核苷酸中，有至少95％相同的那些是极其优选的。此外，在至少95％相同的多聚核苷酸中，有至少97％相同的那些是高度优选的，其中有至少98％和至少99％相同的那些是特别高度优选的(其中有99％相同的多聚核苷酸更为优选)。
此外，在该方面特别优选的实施方案是编码基本保持了与图1和图2的人cDNA编码的成熟多肽相同的生物学功能或活性的多肽的多聚核苷酸。
本发明还涉及可与本文上述序列杂交的多聚核苷酸。在这方面，本发明特别涉及在严紧条件下可与本文上述多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸。如本文所用，术语“严紧条件”指只有在序列间至少有95％、优选至少有97％同一性时才发生杂交。
如本文就本发明多聚核苷酸检测而进行的讨论，例如，本发明上述多聚核苷酸可用作cDNA和基因组DNA的杂交探针以分离编码CKα-2多肽的全长cDNA和基因组克隆以及分离与人CKα-2基因有高度相似性的其它基因的cDNA和基因组克隆。这类探针通常含有至少15个碱基。优选地，这类探针含有至少30个碱基，也可以含有至少50个碱基。
例如，可以通过利用已知DNA序列合成一寡核苷酸探针以进行筛选，分离CKα-2基因的编码区。然后可以用与本发明基因的序列互补的序列的标记寡核苷酸筛选人cDNA、基因组DNA或mRNA文库以确定探针所杂交的文库成员。
如特别在本文有关多聚核苷酸检测中所讨论的，可以将本发明的多聚核苷酸和多肽用作研究试剂和材料以探索人类疾病的治疗和诊断方法。
所述多聚核苷酸也可编码含有成熟蛋白加上其它氨基或羧基末端氨基酸或成熟多肽内的氨基酸(例如当成熟形式有不止一条多肽链时)的多肽。这类序列可以在从前体到成熟形式的蛋白质加工中起作用，可以便于进行蛋白质运输，可以延长或缩短蛋白质的半衰期或者可便于进行蛋白质的分析或生产操作等。正如通常在原位的情况下，通过细胞酶可使其它氨基酸脱离成熟蛋白。
具有成熟形式多肽与一种或多种原序列融合的前体蛋白可能是所述多肽的无活性形式。当除去原序列时，通常可激活这种失活前体。在活化前可除去部分或所有原序列。通常将这类前体称为蛋白原。
总之，本发明多聚核苷酸可编码成熟蛋白、成熟蛋白加前导序列(也可称为前蛋白)、含有一个或多个原序列(该原序列不是前蛋白的前导序列)的成熟蛋白的前体，或前原蛋白(它是蛋白原的前体，含有一个前导序列和一个或多个原序列，这些序列通常在生产活性和成熟形式多肽的加工步骤中会被除去)。
如上所述，含人CKα-2 cDNA的保藏物已保藏在美国典型培养物保藏中心。也如上所述，本文将cDNA保藏物称为“保藏的克隆”或“保藏克隆的cDNA”。该保藏的克隆于1996年1月2日保藏于美国典型培养物保藏中心，12301 Park Lawn Drive,Rockville，马里兰20582，美国，保藏号为ATCC 97400。该保藏物是含全长CKα-2 cDNA的pBluescript SK(-)质粒(Stratagene,La Jolla,CA)，保藏后也称为“PF250”。
根据有关用于专利程序的微生物保藏的国际公认的布达佩斯条约进行了保藏。在专利授权后，所述菌株是不可取消的，并对公众的发放没有限制或条件。该保藏仅仅是为了方便本领域技术人员，并不表明实施发明需要保藏(如35U.S.C§112所要求的那样)。在与本文序列的任何描述有任何冲突时，以该保藏物中所含的多聚核苷酸序列以及由其编码的多肽的氨基酸序列为准。制备、使用或销售该保藏物均需获得许可，但此处并不授予这种许可。
本发明还涉及含有图1和图2的推断的氨基酸序列的人CKα-2多肽。
本发明还涉及这些多肽的片段、类似物和衍生物。当指图1和图2的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本保持了与所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。因此，类似物包括可通过裂解蛋白原部分以产生活性成熟多肽从而可被激活的蛋白原。
本发明多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。在某些优选的实施方案中，它是重组多肽。
图1和图2多肽的片段、衍生物或类似物可以是下述情况(ⅰ)用保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)取代了其中一个或多个氨基酸残基的多肽，这类取代的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码所编码，或(ⅱ)其中一个或多个氨基酸残基含有取代基的多肽，或(ⅲ)其中成熟多肽与另一化合物如可提高该多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)相融合的多肽，或(ⅳ)其中成熟多肽与额外的氨基酸(如前导或分泌序列或可用于纯化成熟多肽或蛋白原序列的序列)相融合的多肽。根据本文的教导，这类片段、衍生物和类似物是在本领域技术人员的理解范围内。
在此方面本发明特别优选的实施方案包括含有图1和图2所示CKα-2的氨基酸序列的多肽，其变体、类似物、衍生物和片段，这些片段的变体、类似物和衍生物。或者，在该方面本发明特别优选的实施方案是含有由保藏克隆中的cDNA编码的CKα-2多肽的氨基酸序列的多肽，其变体、类似物、衍生物和片段，以及这些片段的变体、类似物和衍生物。
优选的变体是因保守氨基酸取代而与标准不同的变体。这类取代是由特征类似的另一氨基酸取代多肽中某一特定氨基酸。通常，视为保守取代的是脂族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之间一个对另一个的置换，羟基残基Ser和Thr的互换，酸性残基Asp和Glu的交换，酰胺残基Asn和Gln之间的取代，碱性残基Lys和Arg的交换以及芳香族残基Phe与Tyr之间的置换。
优选以分离的形式提供本发明多肽和多聚核苷酸，并优选将其纯化至具均一性。
本发明的多肽包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的多肽(特别是成熟多肽)以及与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3多肽有至少70％相似性(优选至少70％同一性)的多肽，更优选与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3多肽有至少90％相似性(更优选至少90％同一性)的多肽，甚至更优选与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3多肽有至少95％相似性(甚至更优选至少95％同一性)的多肽，还包括这类多肽的区段，其中所述多肽的所述区段通常含有至少30个氨基酸，优选至少50个氨基酸。
正如本领域所知，两个多肽间的“相似性”是通过将一个多肽的氨基酸序列和其保守氨基酸取代与另一个多肽的序列进行比较而确定的。
可利用本发明多肽的片段或区段通过肽合成生产相应的全长多肽；因此，可将这些片段用作生产全长多肽的中间产物。可将本发明多聚核苷酸的片段或区段用于合成本发明的全长多聚核苷酸。
本发明此方面优选的实施方案还包括含有下列片段的多肽CKα-2的片段，特别是含有图1和图2所示氨基酸序列或含有由保藏克隆所编码的CKα-2蛋白质的氨基酸序列的CKα-2片段，以及图1和图2或由保藏克隆所编码的CKα-2蛋白质的变体和衍生物的片段。就此而言，片段是含有与前述CKα-2多肽和其变体或衍生物的部分氨基酸序列而非全部氨基酸序列完全相同的氨基酸序列的多肽。作为本发明多肽片段的代表性例子，它们可以是有约30至约111个氨基酸的那些片段。
这类片段可以是“游离状态的”，即不是其它氨基酸或多肽的部分或不与其它氨基酸或多肽融合，也可以是被包含在较大多肽内(它们形成该多肽一部分或一个区域)。当包含在较大的多肽内时，此处所讨论的片段最好是形成一连续区域。然而，单个较大多肽内可含有数个片段。例如，某些优选实施方案涉及的本发明CKα-2多肽的片段被包含在将于宿主中表达、并含有与CKα-2片段的氨基末端融合的异源前多肽区和原多肽区以及在该片段羧基末端融合的其它区域的前体多肽。因此，本文此意义上所说的片段是指融合多肽或融合蛋白中衍生于CKα-2的该区段或多个区段。
本文中，“大约”包括具体列举的范围以及在任一极值或同时在两个极值上多或少一些、数个、5、4、3、2或1个氨基酸的较大和较小范围。例如，本文中“约30个氨基酸”，指具有30个氨基酸加上或减去一些、数个、5、4、3、2或1个氨基酸至111个氨基酸加上或减去一些、数个、5、4、3、2或1个氨基酸的多肽片段，即宽到30个氨基酸减去一些氨基酸至111个氨基酸加上一些氨基酸的范围，窄到30个氨基酸加上一些氨基酸至111个氨基酸减去一些氨基酸的范围。
在这方面，高度优选的是列举的范围在任一极值点或同时在两个极值点加上或减去5个氨基酸。特别高度优选的是列举的范围在任一极值点或同时在两个极值点加上或减去3个氨基酸。特别特别高度优选的是列举的范围在任一极值点或同时在两个极值点加上或减去1个氨基酸，或者列举的范围不再有增加或丢失。在这方面所有片段中最高度优选的是约30至约111个氨基酸的片段。
本发明特别优选的片段包括CKα-2的截短突变体。截短突变体包括具有图1和图2或保藏克隆的氨基酸序列或其变体或衍生物的CKα-2多肽，但不包括含有氨基末端的连续残基序列(即连续区、部分或区段)的缺失、或含有羧基末端的连续残基序列缺失，或者是如在双截短突变体中两个连续残基序列的缺失(一个含有氨基酸末端，另一个含羧基末端)。范围大小以“大约”给出的片段是截短片段的优选实施方案，通常这些截短片段是片段中特别优选的。
本发明此方面，还优选具有CKα-2结构或功能特征的片段。就此而言，本发明优选的实施方案包括含有CKα-2的α螺旋和α螺旋形成区(“α区”)、β折叠和β折叠形成区(“β区”)、转角(turn)和转角形成区(“转角区”)、卷曲和卷曲形成区(“卷曲区”)、亲水区、疏水区、α两亲区、β两亲区、柔性(flexible)区、表面形成区和高抗原性指数区的片段。
在这些方面，图5中列出了某些优选区，它们包括但不限于通过分析图1和图2中所列氨基酸序列而鉴定出的前述类型的区域。如图5所列，这类优选区域包括Garnier-Robson α区、β区、转角区和卷曲区，Chou-Fasman α区、β区和转角区，Kyte-Doolittle亲水区和疏水区，Eisenberg α和β两亲区，Karplus-Schulz柔性区，Emini表面形成区和Jameson-Wolf高抗原性指数区。
在此方面高度优选的片段包括组合了多种结构特征(如上述所列的一些特征)的CKα-2区的那些片段。就此而言，由图1的约第30至111位残基(SEQ ID NO:2中的氨基酸2至83)和由图2的约第18至99位残基(SEQ ID NO:3中的氨基酸6至83)所定义的区域是特别高度优选的区域，这些区域的特征均在于具有转角区、亲水区、柔性区、表面形成区和高抗原性指数区的氨基酸组成的高度特征。如上所述，这类区域可包含于较大的多肽内，或者它们本身可以是本发明优选的片段。可以理解本段中所用的术语“约”具有上述一般说明片段时所指的含义。
另外优选的区域是可介导CKα-2活性的那些区域。在这方面最高度优选的是具有CKα-2的化学、生物学或其它活性的片段，包括具有相似活性或有所提高的活性或降低了不想要的活性的那些片段。在这方面高度优选的是含有与相关多肽如图3和图4所列相关多肽(包括中国仓鼠GRO)在序列上，或位置上，或在序列和活性区域上都具有同源性的区域。在这些片段中特别优选的是如上述的截短突变体。
可以理解本发明还涉及编码前述片段的多聚核苷酸、与编码这些片段的多聚核苷酸可杂交的多聚核苷酸(特别是在严紧条件下可杂交的那些多聚核苷酸)，以及可用于扩增编码这些片段的多聚核苷酸的多聚核苷酸如PCR引物。其中优选对应于上述所讨论的优选片段的那些多聚核苷酸。
本发明还涉及含本发明多聚核苷酸的载体，用本发明载体经遗传工程方法加工的宿主细胞以及通过重组技术生产本发明多肽的方法。
可用遗传工程方法加工宿主细胞以掺入多聚核苷酸并表达本发明多肽。例如，利用众所周知的感染、转导、转染、转位和转化技术可将多聚核苷酸导入宿主细胞。可将所述多聚核苷酸单独导入或与其它多聚核苷酸一起导入。这类其它多聚核苷酸可以被独立导入、共导入或与本发明多聚核苷酸连在一起导入。
因此，例如利用用于在如哺乳动物细胞中共转染和筛选的标准技术，可将本发明多聚核苷酸与编码选择性标记的另一独立多聚核苷酸一起转染到宿主细胞中。在这种情况下，所述多聚核苷酸通常可以被稳定地掺入到宿主细胞基因组中。
或者，可将所述多聚核苷酸与含有用于在宿主中扩增的选择性标记的载体相连。可通过前述技术将载体构建体导入宿主细胞。通常，可将质粒载体作为沉淀物如磷酸钙沉淀物、或者带电荷类脂复合物中的DNA导入。也可以用电穿孔方法将多聚核苷酸导入宿主。如果载体是病毒，可将其体外包装或导入包装细胞中，然后将已包装的病毒转导到细胞中。根据本发明，适用于制备多聚核苷酸及将多聚核苷酸导入细胞的多种技术是熟知的，而且对于本领域技术人员来说是常规的。这些技术在上述列举的Sambrook等编著的书中作了详细描述，该书是详述这些技术的许多实验室手册的例子。
根据本发明的这一方面，载体可以是诸如质粒载体、单链或双链噬菌体载体、单链或双链RNA或DNA病毒载体。通过有关将DNA和RNA导入细胞的熟知技术，可将这类载体作为多聚核苷酸、优选作为DNA而导入细胞。在噬菌体和病毒载体的情况下，通过有关感染和转导的熟知技术这类载体可以而且优选作为包装的或壳体化病毒而导入细胞。病毒载体可以是有复制能力的，或是复制缺陷型的。在后一情况下，病毒扩增通常仅在互补宿主细胞中发生。
在某些情况下，载体中优选的是可用于表达本发明多聚核苷酸和多肽的那些载体。通常这类载体含有可有效用于宿主中表达并与待表达多聚核苷酸有效相连的顺式作用控制区。适宜的反式作用因子可由宿主、互补载体提供或在导入宿主后由载体本身提供。
在此方面的某些优选实施方案中，载体可保证特异性表达。这种特异性表达可以是诱导型表达，或是仅在特定类型的细胞中进行的表达，或同时是诱导型的和细胞特异性的。在诱导型载体中特别优选的是可通过易于操作的环境因素如温度和营养添加剂而被诱导表达的载体。适用于本发明此方面的多种载体(包括用于原核和真核宿主的组成型和诱导型表达载体)是本领域熟知的，并可由本领域技术人员按常规使用。
可将工程化宿主细胞在常规营养培养基中培养，该培养基可以已被改进而适合于特别是激活启动子、筛选转化子或扩增基因。以前与所选择的用于表达的宿主细胞一起使用的培养条件如温度、pH等也适用于表达本发明的多肽，这对本领域技术人员来说是显而易见的。
多种表达载体可用于表达本发明多肽。这类载体包括染色体、附加体和病毒衍生的载体，如衍生于细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒如杆状病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒(pseudorabies virus)和逆转录病毒的载体，以及衍生于其组合的载体，如衍生于质粒和噬菌体遗传元件的那些载体(如粘粒和噬菌粒)，所有这些载体均可用于本发明此方面的表达。通常，适于在宿主中保持、增殖或表达多聚核苷酸以表达多肽的任何载体均可用于此方面的表达。
可通过各种熟知和常规技术中的任何一种将适当的DNA插入载体中。总之，通过用一种或多种限制内切酶切割DNA序列和表达载体，然后用T4 DNA连接酶将这些限制性片段连接在一起，可以将用于表达的DNA序列与表达载体相连。可用于此目的的限制和连接方法对技术人员是熟知的和常规的。这方面的适当载体，以及对技术人员来说也是熟知和常规的用于构建表达载体的其它方法在本文其它地方例举的Sambrook等的书中作了详细的描述。
表达载体中的DNA序列与适宜的表达控制序列(包括如指导mRNA转录的启动子)有效相连。这类启动子的代表包括噬菌体λPL启动子，大肠杆菌lac、trp和tac启动子，SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTRS的启动子，在此仅列举几个熟知的启动子。应理解未提及的很多启动子也适宜应用于本发明这一方面，它们是熟知的，而且本领域技术人员根据本文的讨论和实施例可很容易地使用它们。
总之，表达构建体应含有用于转录起始和终止的位点，并在被转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。由该构建体表达的成熟转录本的编码部分可在待翻译多肽的起始点含有起始翻译的AUG，在其末端的适宜位置含有终止密码子。
另外，该构建体可含有调节并引发表达的控制区。通常根据许多常用的实践方法，这类区域可通过控制转录如阻遏物结合位点和增强子等发挥作用。
用于增殖和表达的载体通常含有选择性标记。这类标记也适用于扩增，或者所述载体可含有用于此目的的其它标记。就此而言，表达载体优选含有一个或多个选择性标记基因以便为转化宿主细胞的筛选提供表型特征。优选的标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，以及用于培养大肠杆菌和其它细菌的四环素或氨苄青霉素抗性基因。
通过适用于表达所需多肽的各种熟知技术，可将含本文其它部分所述的适宜DNA序列以及适宜启动子和其它适宜控制序列的载体导入适宜宿主中。适宜宿主的代表性例子包含细菌细胞如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞如酵母细胞；昆虫细胞如果蝇S2细胞和Spodoptera Sf9细胞；动物细胞如CHO、COS和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞。用于各种表达构建体的宿主是熟知的，而且根据本发明的公开，本领域技术人员能够很容易选择用于表达本发明此方面多肽的宿主。
更具体地说，本发明还包括含上述的一种或多种序列的重组构建体，如表达构建体。所述构建体含有载体如质粒或病毒载体，其中已插入了本发明的序列。该序列可以是正向或反向插入。在此方面的某些优选实施方案中，该构建体还含有与该序列有效相连的调节序列，包括如启动子。许多适宜的载体和启动子是本领域技术人员熟知的，而且有许多市售载体也可用于本发明。
为了举例，列举了下列市售载体。载体中优选用于细菌的载体是pQE70、pQE60和pQE-9(可购自Qiagen)；pBS载体，Phagescript载体，Bluescript载体，pNH8A,pNH16a,pNH18A,pNH46A(可购自Stratagene)；和ptrc99a,pKK223-3,pKK233-3,pDR540,pRIT5(可购自Pharmacia)。优选的真核载体包括可购自Stratagene的PWLNEO,pSV2CAT,pOG44,pXTI和pSG；以及可购自Pharmacia的pSVK3,PBPV,PMSG和PSVL。列出这些载体仅仅是为了说明本领域技术人员可以得到许多市售和熟知的载体用于本发明的这一方面。应理解任何适用于在宿主中诸如导入、保持、增殖或表达本发明多聚核苷酸或多肽的质粒或载体均可用于本发明的这一方面。
利用含有缺失启动子区的报道转录单位如氯霉素乙酰转移酶(cat)转录单位可以从任何所需基因中选择出启动子区，该报道转录单位在可用于导入候选启动子片段(即可能含有启动子的片段)的限制位点的下游。正如所熟知的，在载体中cat基因上游的限制位点导入含启动子片段后可产生CAT活性，该活性可用标准CAT检测法来检测。适用于此目的的载体是熟知的并很容易得到。两种这类载体是pKK232-8和pCM7。因此，用于表达本发明多聚核苷酸的启动子不仅包括熟知并很容易得到的启动子，还包括利用报道基因通过前述技术很容易得到的启动子。
适用于表达本发明多聚核苷酸和多肽的已知细菌启动子包括大肠杆菌lacI和lacZ启动子，T3和T7启动子，gpt启动子，λPR、λPL启动子，以及trp启动子。适用于此方面的已知真核启动子包括CMV立即早期启动子，HSV胸苷激酶启动子，早期和晚期SV40启动子，逆转录病毒LTRS的启动子如劳氏肉瘤病毒(RSV)的那些启动子，以及金属硫蛋白基因启动子，如小鼠金属硫蛋白-I基因启动子。
在宿主细胞中用于表达的适宜载体和启动子的选择方法是熟知的方法，表达载体的构建、将所述载体导入所述宿主并在所述宿主中进行表达所必需的技术是本领域的常规技术。
本发明还涉及含上述构建体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是高等真核细胞如哺乳动物细胞，或低等真核细胞如酵母细胞，或者所述宿主细胞可以是原核细胞如细菌细胞。
通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子类脂介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法可将所述构建体导入宿主细胞。这类方法描述于许多标准实验室手册，如Davis等，分子生物学中的基础方法(1986)。
可按常规方法利用宿主细胞中的构建体以产生由重组序列编码的基因产物。或者，可通过常规肽合成仪合成本发明的多肽。
在适宜启动子的控制下，可在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达成熟蛋白质。也可利用衍生于本发明的DNA构建体的RNA，通过无细胞翻译体系生产所述蛋白质。Sambrook等，分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，(1989)描述了用于原核和真核宿主的适宜克隆和表达载体。
通常，重组表达载体可含有复制起点，用于指导下游结构基因的转录的衍生于高度表达的基因的启动子，用于与载体接触后分离含载体的细胞的选择性标记。适宜的启动子包括衍生于编码糖酵解酶如3-磷酸甘油激酶(PGK)、α因子、酸性磷酸酶和热休克蛋白质等的基因的启动子。选择性标记包括大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和啤酒酵母的trpl基因。
通过将增强子序列插入到载体中可提高高等真核生物对编码本发明多肽的DNA进行的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10-300bp，它们在给定类型的宿主细胞中可提高启动子的转录活性。增强子的例子包括位于复制起点第100-270bp处的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点后的多形瘤增强子和腺病毒增强子。
通常可利用标准技术将编码本发明多肽的异源结构序列的本发明多聚核苷酸插入到载体中以便将其与用于表达的启动子有效相连。多聚核苷酸的插入位置应能确保转录起始位点大约位于核糖体结合位点的5’侧。核糖体结合位点应在可起始待表达多肽的翻译的AUG的5’侧。通常，再没有从起始密码子(通常是AUG)开始的并位于核糖体结合位点和所述起始AUG之间的其它开放阅读框架。另外，通常在所述多肽的末端应有一翻译终止密码子，并且在被转录区3’末端还有一多聚腺苷酸化信号以及一转录终止信号。
为了将被翻译的蛋白质分泌到内质网腔、周质间隙或细胞外环境中，可将适宜的分泌信号掺入到待表达的多肽中。这些信号对该多肽可以是内源的，或可以是异源的。
可将该多肽以修饰的形式如融合蛋白进行表达，该多肽不仅可含有分泌信号，还可含有其它异源功能区。因此，例如可将其它氨基酸特别是酸性氨基酸区加到所述多肽的N末端以便提高其在宿主细胞中、纯化过程或随后的处理和贮存过程中的稳定性和持久性。另外，还可将区域加到该多肽中以便有利于纯化。在所述多肽的最后制备前可除去这类区域。将肽部分加到多肽中以便引起分泌或外泌，提高稳定性并有利于纯化等技术是本领域的熟悉和常规技术。
用于增殖、保持或表达本发明多聚核苷酸和多肽的适宜原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。假单胞杆菌、链霉菌和葡萄球菌属的各个种也是这方面的适宜宿主。此外，技术人员已知的许多其它宿主也可用于该目的。
作为非限制性实例的代表，用于细菌的有效表达载体可含有衍生于市售质粒的选择性标记和细菌复制起点，所述市售质粒含有熟知克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传元件。所述商业化载体包括诸如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden)和GEM1(Promega Biotec,Madison,WI,USA)。可将这些pBR322“骨架”部分与适宜的启动子和待表达的结构基因组合在一起。
转化适宜的宿主株系并使其生长到适宜的细胞密度后，若所选的启动子是可诱导型的，则通过适宜的方法(例如温度变化或暴露于化学诱导剂)将其诱导，并将细胞再培养一段时间。然后通常通过离心收集细胞，经物理或化学方法破碎细胞，再将所得的粗提取物进行进一步纯化。
可通过任何简便方法，包括冻融循环、声处理、机械破碎，或使用细胞裂解剂等破碎用于表达蛋白质的微生物细胞，本领域技术人员熟知这类方法。
也可将各种哺乳动物细胞培养体系用于表达。哺乳动物表达体系的例子包括Gluzman等，细胞23:175(1981)描述的猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系。能够表达相容载体的其它细胞系包括诸如C127、3T3、CHO、HeLa、人肾293和BHK细胞系。
哺乳动物表达载体应含有复制起点、适宜的启动子和增强子，以及表达必需的任何必需核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和表达所必需的5’侧非转录序列。在本发明此方面的某些优选实施方案中，将衍生于SV40剪接位点的DNA序列以及SV40多聚腺苷酸化位点用作这类必需的非转录遗传元件。
通过熟知的方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析等可从重组细胞培养物中回收并纯化CKα-2多肽。最优选将高效液相层析(HPLC)用于纯化。若在分离和/或纯化过程中多肽发生了变性时，可通过用于重新折叠蛋白质的熟知技术再产生活性构象。
本发明多肽包括天然纯化的产物，化学合成方法获得的产物和从原核或真核细胞包括诸如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞通过重组技术生产的产物。根据重组生产方法中所用的宿主，本发明多肽可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。另外，本发明多肽还可以含有一个已被修饰的起始甲硫氨酸残基，在某些情况下这是宿主介导的过程的结果。
根据本发明可将CKα-2多聚核苷酸和多肽用于各种应用中，特别是利用了CKα-2的化学和生物学特性的那些应用中。其它的应用包括诊断以及治疗细胞、组织和生物体失调。通过下列讨论进一步说明本发明的这些方面。
本发明还涉及CKα-2多聚核苷酸在检测互补多聚核苷酸的用途，如用作诊断试剂。对与功能失调有关的CKα-2突变形式的检测可提供一种诊断工具，该诊断工具可增加或定义对因CKα-2表达不足、表达过量或表达改变而引起的疾病或疾病敏感性的诊断。通过各种技术可在DNA水平检测在人CKα-2基因中携带突变的个体。诊断用核酸可从患者细胞(如来自血液、尿、唾液、组织活检和尸检材料的细胞)中获得。可将基因组DNA直接用于检测，或者可在分析前将其用PCR酶促扩增。PCR(Saiki等，自然，324:163-166(1986))。可以以相同的方式使用RNA或cDNA。作为例子，可以使用与编码CKα-2的核酸互补的PCR引物以鉴定并分析CKα-2的表达和突变。例如，通过与正常基因型比较，扩增产物大小的变化可检测出缺失和插入。通过将扩增的DNA与放射性标记的CKα-2 RNA或放射性标记的CKα-2反义DNA序列杂交，可鉴定出点突变。通过RNase A消化或熔点温度的差异，可将精确匹配的序列与错配的双螺旋区分开。
通过直接DNA测序可揭示出标准基因和带有突变的基因之间的序列差异。另外，可将克隆的DNA片段用作探针以检测特异性DNA片段。通过适当使用PCR或其它扩增方法，可大大提高这类方法的灵敏度。例如，可将测序引物与双链PCR产物或通过改进的PCR产生的单链模板分子一起使用。序列测定是通过利用放射性标记的核苷酸的常规方法或利用荧光标记的自动测序方法完成的。
通过检测在含有或不具变性剂的凝胶中DNA片段电泳迁移率的改变可完成基于DNA序列差异的遗传检测。通过高分辨率凝胶电泳可观察到小序列缺失和插入。可以在变性甲酰胺梯度凝胶上区别不同序列的DNA片段，其中根据其特异性的熔解或部分熔解温度，不同迁移率的DNA片段被阻滞于凝胶中的不同位置(参见例如Myers等，科学，230:1242(1985))。
通过核酸酶保护试验，如RNase和S1保护或化学裂解方法也可以揭示出特定位置的序列变化(例如，Cotton等，美国国家科学院院报，85:4397-4401(1985))。
因此，通过诸如杂交、RNase保护、化学裂解、直接DNA测序或利用限制酶(例如限制片段长度多态性(RFLP))和基因组DNA的Southern印迹等方法可完成特定DNA序列的检测。除更常规的凝胶电泳和DNA测序外，也可以通过原位分析检测突变。
本发明的序列对于染色体的鉴定也具有一定价值。所述序列特异地导向一人个体染色体上的特定位置并可与其杂交。此外，目前仍需要鉴定染色体上特定位点的方法。目前没有多少以实际序列数据(重复多态性)为基础的染色体标记(marking)试剂可用于标记染色体位置。根据本发明，DNA对染色体的作图是将那些序列与疾病相关基因相联系时的首要步骤。
在此方面的某些优选实施方案中，利用了本文公开的cDNA克隆CKα-2基因的基因组DNA。这可通过利用各种熟知的技术和文库(通常是市售的)来完成。为了达到这一目的，利用熟知技术，可将基因组DNA用于原位染色体作图。通常，根据染色体作图的常规方法，可能需要累试(trial and error)以鉴定出可获得良好原位杂交信号的基因组探针。
另外，在一些情况下，通过从cDNA制备PCR引物(优选15-25bp)，可将序列作图到染色体上。利用基因3’非翻译区的计算机分析可快速筛选出在基因组DNA中跨越不超过1个外显子的引物，因而使扩增过程复杂化。然后利用这些引物对含人个体染色体的体细胞杂合体进行PCR筛选。只有含对应于引物的人基因的那些杂合体可以产生扩增片段。
体细胞杂合体的PCR作图是一种快速的将具体DNA定位到具体染色体上的方法。通过本发明，使用相同的寡核苷酸引物，以相似的方法利用来自特定染色体的片段组或大基因组克隆库可以完成亚定位(sublocalization)。可类似地用于作图到染色体上的其它作图策略包括原位杂交，利用标记的流式分选染色体进行的预筛选以及通过杂交构建染色体特异性cDNA文库的预筛选。
可以用cDNA克隆与中期染色体扩展(spread)的荧光原位杂交(FISH)提供精确的一步染色体定位。该技术可利用短至50或60的cDNA。有关该技术的综述参见Verma等，人类染色体基础技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。
一旦某个序列已被作图到精确的染色体位置上，就可将该序列在染色体上的物理位置与遗传图谱数据联系起来。这类数据可见于例如V.McKusic，《人的孟德尔遗传》，通过约翰·霍普金斯大学，Welch医学图书馆联机得到。然后通过连锁分析(物理上相邻基因的共遗传)鉴定已作图到相同染色体区的基因和疾病之间的关系。
接着，有必要确定受影响和未受影响个体之间cDNA或基因组序列的差异。如果在一些或所有受影响个体中观察到突变，而在任何正常个体中均未发现突变，那么该突变就可能是所述疾病的病因。
就目前物理作图和遗传作图技术的分辨率而言，精确定位于疾病相关染色体区的cDNA可能是50-500个可能的致病基因中的一个(这里假设作图分辨率为1兆碱基，每20kb为一个基因)。
本发明还涉及诊断分析如检测细胞和组织中CKα-2蛋白质水平的定量和诊断分析，包括确定正常和异常水平。因此，例如根据本发明，通过检测与正常对照组织相比、CKα-2蛋白质过量表达的诊断试验可检测诸如肿瘤的存在。可用于确定来自宿主的样品中的蛋白质如本发明CKα-2蛋白质的水平的检测技术是本领域技术人员熟知的。这类分析方法包括放射性免疫测定、竞争结合试验、Western印迹分析和ELISA试验。这些测定中通常优选ELISA。ELISA试验最初包括制备CKα-2特异性抗体，优选单克隆抗体。另外，通常还要制备可与单克隆抗体结合的报道抗体。报道抗体则与检测试剂如放射性、荧光或酶试剂(在本实施例中是辣根过氧化物酶)相连。
为了完成ELISA，从宿主中取样，然后在可结合该样品中蛋白质的固相支持物如聚苯乙烯盘上保温。然后通过与非特异性蛋白质如牛血清白蛋白保温覆盖盘上游离的任何蛋白质结合位点。接着，将单克隆抗体在盘中保温，在此过程中，所述单克隆抗体与附着于聚苯乙烯盘的任何CKα-2蛋白质结合。用缓冲液洗掉未结合的单克隆抗体。将与辣根过氧化物酶连接的报道抗体置于盘中，在此期间该报道抗体与任何结合于CKα-2的单克隆抗体结合。然后洗掉未结合的报道抗体。再将用于检测过氧化物酶活性的试剂，包括比色底物加到盘中。通过一级和二级抗体与CKα-2相连的固定的过氧化物酶产生了有颜色的反应产物。在给定时间内产生的颜色量说明了样品中存在的CKα-2蛋白质的量。通常通过参照标准曲线获得定量分析结果。
可以使用竞争试验，其中将附着于固相支持物的CKα-2特异性抗体和标记的CKα-2以及来自宿主的样品穿过固相支持物，检测到的固相支持物结合的标记量与样品中的CKα-2量相关。
可将这些多肽、其片段或其其它衍生物或类似物或表达它们的细胞作为免疫原以产生针对它们的抗体。这些抗体例如可以是多克隆或单克隆抗体。本发明还包括嵌合的单链和人源化抗体以及Fab片段，或Fab表达文库的产物。可将本领域已知的各种方法用于生产这类抗体和片段。
通过直接将该多肽注射到动物中或给动物(优选非人体)施用该多肽，可产生抗相应于本发明的序列的多肽的抗体。然后将所得抗体与多肽本身结合。通过这种方法，至少可以用仅编码多肽一个片段的序列产生结合整个天然多肽的抗体。然后可以用所述抗体从表达多肽的组织中分离所述多肽。
可以利用该抗体分离或鉴定表达所述多肽的克隆，或者通过与用于分离和/或纯化的固相支持物结合，经亲和层析纯化本发明多肽。
为了制备单克隆抗体，可以使用可通过连续细胞系培养物生产抗体的任何技术。这方面例子包括杂交瘤技术(Kohler,G.和Milstein,C.，自然256:495-497(1975))，三瘤(trioma)技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，今日免疫学，4:72(1983))和生产人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等，《单克隆抗体和癌症治疗》，Alan R.,Liss,Inc.(1985),77-96页)。
可改变用于生产单链抗体的技术(美国专利4946778)以生产抗本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。另外，可以用转基因小鼠或其它生物如其它哺乳动物表达抗本发明的免疫原性多肽产物的人源化抗体。
可以利用上述抗体，通过抗体与固相支持物的结合，然后将待纯化的所述多肽过柱进行亲和柱层析并回收所述纯化多肽，从而分离本发明多肽。
因此，还可利用CKα-2等抑制骨髓干细胞的集落形成，以用作癌症化疗和白血病的辅助保护性治疗。
还可利用CKα-2抑制表皮角质形成细胞增殖以治疗牛皮癣，该疾病的特征在于角质形成细胞的过度增殖。
还可利用CKα-2通过刺激宿主防卫细胞如细胞毒T细胞和巨噬细胞的侵染和活化并通过抑制肿瘤的血管形成来治疗实体瘤。利用CKα-2，还可通过对杀微生物白细胞的吸引和激活，提高宿主对耐药性慢性和急性感染如分枝杆菌感染的防御能力。
还可利用CKα-2通过抑制IL-2的生物合成来抑制T细胞增殖，以治疗T细胞介导的自身免疫性疾病和淋巴细胞白血病。
还可利用CKα-2通过碎片清除(debris clearing)和结缔组织促炎性细胞的募集反应以及其对TGFβ介导的过度纤维变性的控制来刺激其它伤口愈合。还可利用CKα-2通过同样途径治疗纤维变性性疾病，包括肝硬变、骨关节炎和肺纤维变性。
CKα-2还可提高嗜酸细胞的存在水平，所述嗜酸细胞在杀死侵入组织的寄生虫幼虫(如在血吸虫病、旋毛虫病和蛔虫病中)方面具有显著功能。
还可利用CKα-2通过调节各种造血祖细胞的活化和分化从而调节血细胞生成，如化疗后从骨髓中释放成熟白细胞。
本发明还提供了鉴定结合CKα-2的分子如受体分子的方法。通过本领域技术人员已知的许多方法，如配基淘选和FACS分类可鉴定出编码结合CKα-2的蛋白质如受体蛋白质的基因。这类方法在许多实验室手册如Coligan等，现代免疫学方法，1(2)第5章(1991)中都有描述。
例如可利用表达克隆达到该目的。为了达到这一目的，从对CKα-2有反应的细胞中制备多聚腺苷酸化RNA，从所述RNA制备cDNA文库，将所述文库分成若干组，然后将各组逐个转染到不与CKα-2反应的细胞中。然后将转染细胞暴露于CKα-2。(通过各种熟知的技术包括标准放射性碘化法或包含位点特异性蛋白质激酶的识别位点可标记CKα-2。)接触后，固定细胞并确定CKα-2的结合。可在玻璃载玻片上方便地完成这些方法。
从文库组中鉴定出可产生结合CKα-2的细胞的cDNA。从这些阳性组制备亚组，按上述转染到宿主细胞中并进行筛选。用重复的亚分组和再筛选过程，可以分离一个或多个编码推测的结合性分子如受体分子的克隆。
或者可将标记的配基与细胞提取物如膜或膜提取物光亲和相连，所述细胞提取物是从表达与配基结合的分子如受体分子的细胞中制备的。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离交联的物质，并将其对X射线胶片曝光。切下含配基-受体的标记复合物，分解为肽片段，然后进行蛋白质微测序。利用从微测序得到的氨基酸序列设计特异性或简并性寡核苷酸探针以筛选cDNA文库，从而鉴定出编码推测的受体分子的基因。
还可利用本发明多肽评估细胞或无细胞制品中CKα-2结合性分子如受体分子的CKα-2结合能力。
本发明还提供了筛选化合物以鉴定出能够提高或阻断CKα-2对细胞的作用如其与CKα-2结合性分子(如受体分子)的相互作用的化合物的方法。激动剂是可提高CKα-2天然生物学功能或以与CKα-2类似的方式起作用的化合物，而拮抗剂则可降低或消除这类功能。
例如可从表达结合CKα-2的分子(如CKα-2调节的信号或调节途径的分子)的细胞制备细胞区室，如其膜或制品(如膜制品)。在不存在或存在可能是CKα-2激动剂或拮抗剂的候选分子的条件下，将所述制品与标记的CKα-2一起保温。标记配基结合的减少反映了候选分子结合结合性分子的能力。无偿结合(即不诱导CKα-2对CKα-2结合性分子的结合作用)的分子极有可能是良好的拮抗剂。结合良好并可引发与CKα-2相同或相近作用的分子是激动剂。
例如，在候选分子与细胞或适宜的细胞制品相互作用后，确定第二信使系统的活性，然后与CKα-2或引发与CKα-2相同作用的分子的作用进行比较，可以测量潜在激动剂和拮抗剂的CKα-2样作用。在这方面有用的第二信使系统包括但不限于AMP鸟苷酸环化酶，离子通道或磷酸肌醇水解第二信使系统。
CKα-2拮抗剂检测法的另一例子是竞争性试验，该试验在适宜竞争性抑制检测的条件下，将CKα-2和潜在拮抗剂与膜结合的CKα-2受体分子或重组CKα-2受体分子结合。可通过如放射性标记CKα-2以便可精确确定与受体分子结合的CKα-2分子的量，从而评估所述潜在拮抗剂的效力。
潜在拮抗剂包括与本发明多肽结合并由此抑制或消除其活性的小有机分子、肽、多肽和抗体。潜在的拮抗剂还可以是在结合性分子如受体分子上结合相同位点而不诱导CKα-2所诱导的活性、由此通过阻止CKα-2的结合而抑制CKα-2的作用的小有机分子、肽、多肽如密切相关蛋白质或抗体潜在的拮抗剂包括可结合并占据多肽结合位点从而抑制与细胞结合分子如受体分子的结合，以致于抑制正常生物学活性的小分子。小分子的例子包括但不限于小的有机分子、肽或肽样分子。
其它潜在的拮抗剂包括反义分子。通过反义DNA或RNA或通过三螺旋的形成，可用反义技术控制基因表达。反义技术在下列文献有讨论如Okano，神经化学杂志，56:560(1991)；寡核苷酸作为基因表达的反义抑制剂，CRC出版社，Boca Raton,FL(1988)。三螺旋的形成在下列文献中有讨论如Lee等，核酸研究，6:3073(1979)；Cooney等，科学，241:456(1988)；和Dervan等，科学，251:1360(1991)。这些方法均依据多聚核苷酸与互补DNA或RNA的结合。例如，可以利用编码本发明成熟多肽的多聚核苷酸的5’编码区设计约10-40个碱基对长的反义RNA寡核苷酸。设计一DNA寡核苷酸与该基因中参与转录的区域互补，由此抑制转录和CKα-2的生产。反义RNA寡核苷酸可在体内与mRNA杂交并阻断所述mRNA分子翻译成CKα-2多肽。还可将上述寡核苷酸传递到细胞中以便在体内表达反义RNA或DNA，从而抑制CKα-2的生产。
例如在某些自身免疫性和慢性炎症和感染性疾病中，可以利用所述拮抗剂抑制巨噬细胞和其前体、嗜中性细胞、嗜碱细胞、B淋巴细胞和一些T细胞亚型如激活的和CD8细胞毒T细胞以及天然杀伤细胞的趋化性和活化。自身免疫性疾病的例子包括多发性硬化症和胰岛素依赖性糖尿病。
还可利用所述拮抗剂通过抑制单核吞噬细胞的募集反应和活化来治疗感染性疾病，包括硅肺、结节病、特发性肺纤维变性等。还可利用所述拮抗剂通过抑制嗜酸细胞的生产和迁移来治疗特发性嗜酸细胞过多综合症。也可利用所述拮抗剂通过抑制巨噬细胞的迁移和本发明的人趋化因子多肽的生产来治疗内毒素性休克。
还可利用所述拮抗剂通过抑制动脉壁上的单核细胞侵入来治疗动脉粥样硬化。
还可利用所述拮抗剂通过抑制趋化因子诱导的肥大细胞和嗜碱细胞的脱粒作用和组胺的释放来治疗组胺介导的过敏反应和免疫疾病包括晚期过敏反应、慢性荨麻疹和特应性皮炎。也可以治疗IgE介导的过敏反应如过敏性哮喘、鼻炎和湿疹。
还可利用所述拮抗剂通过抑制单核细胞向伤口区的吸引来治疗慢性和急性炎症。还可利用其调节正常肺巨噬细胞种群，这是因为慢性和急性炎症性肺疾病与肺中单核吞噬细胞的汇集有关。
还可利用所述拮抗剂通过抑制单核细胞向病人关节内滑液的吸引来治疗类风湿性关节炎。单核细胞的涌入和活化在退化性和炎性关节病的发病机制中均有重要作用。
还可利用所述拮抗剂干扰主要由IL-1和TNF引起的有害级联作用，该拮抗剂可抑制其它炎症细胞因子的生物合成。通过这种方法，可利用所述拮抗剂抑制炎症。还可利用所述拮抗剂抑制由趋化因子诱导的前列腺素依赖性发烧。
还可利用所述拮抗剂治疗骨髓不足，例如再生障碍性贫血和骨髓增生异常综合症。
还可利用所述拮抗剂通过抑制肺中嗜酸细胞的累积来治疗哮喘和过敏。还可利用所述拮抗剂治疗作为哮喘肺显著特征的上皮下基膜纤维变性。
如下文所述，可将所述拮抗剂与可药用载体一起用于组合物中。
本发明还涉及含上述多聚核苷酸或多肽或激动剂或拮抗剂的组合物。因此，可将本发明多肽与用于细胞、组织或生物体的非无菌或无菌载体如适宜给个体施用的药用载体一起使用。例如，这类组合物可含有介质添加剂或治疗有效量的本发明多肽以及可药用载体或赋形剂。这类载体包括但不限于盐、缓冲的盐、右旋糖、水、甘油、乙醇及它们的组合物。所述制剂应适合给药方式。
本发明还涉及含有填充了一种或多种前述本发明组合物的成分的一个或多个容器的药物包和试剂盒。这些容器可附有管理药物或生物产品的生产、使用或销售的政府机构规定的反映生产、使用或销售机构对该人用产品许可的介绍。
可将本发明的多肽和其它化合物单独使用或与其它化合物如治疗化合物联用。
可将所述药物组合物以任何有效、方便的方式给药，包括例如通过局部、口腔、肛门、阴道内、静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、鼻内或真皮内等途径给药。
通常将药物组合物以治疗或预防具体适应症的有效量给药。总之，将该组合物以至少约10μg/kg体重的量施用。在大多数情况下，可将其以每天不超过约8mg/kg体重的量施用。在大多数情况下，优选剂量为每天约10μg/kg体重至约1mg/kg体重。可以理解，对于各种治疗方式和适应症，可根据该适应症类型、其严重程度、给药途径、并发症等通过标准方法确定最佳剂量。
在通常称为“基因治疗”的治疗方式中，根据本发明可通过体内表达所述多肽而使用CKα-2多聚核苷酸、多肽、多肽类激动剂和拮抗剂。
因此，例如可通过离体(ex vivo)编码多肽的多聚核苷酸如DNA或RNA对来自患者的细胞进行改造，然后将工程化细胞提供给需用所述多肽治疗的患者。例如利用含编码本发明多肽的RNA的逆转录质粒载体，可离体改造细胞。这类方法是本领域熟知的，而且根据本文的教导，其在本发明中的应用是显而易见的。
同样，通过本领域已知的方法，可在体内改造细胞以便体内表达多肽。例如，如上所述，可改造本发明多聚核苷酸以使其在复制缺陷型逆转录载体中表达。然后分离逆转录病毒表达构建体，并将其导入包装细胞。用含编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒质粒载体转导包装细胞以使该包装细胞此时可生产含所需基因的感染性病毒颗粒。可将这些生产者细胞施用给患者以便在体内改造细胞并在体内表达所述多肽。根据本发明的教导，施用本发明多肽的这些和其它方法对于本领域技术人员是显而易见的。
衍生本文上述逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于Moloney鼠白血病病毒、脾坏死病毒、逆转录病毒如劳氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽类白血病病毒、gibbon ape白血病病毒、人免疫缺陷性病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒。在一实施方案中，逆转录病毒质粒载体衍生于Moloney鼠白血病病毒。
所述载体包括一个或多个启动子以表达多肽。可以使用的适宜的启动子包括但不限于逆转录病毒LTR；SV40启动子以及Miller等(生物技术，7:980-990(1989))所述的人巨细胞病毒(CMV)启动子或其它任何启动子(如细胞启动子，如真核细胞启动子，包括但不限于组蛋白启动子、RNA聚合酶Ⅲ启动子和β肌动蛋白启动子)。可以使用的其它病毒启动子包括但不限于腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。根据本文教导，适宜启动子的选择对于本领域技术人员是显而易见的。
将编码本发明多肽的核酸序列置于适宜启动子的控制下。可以使用的适宜启动子包括但不限于腺病毒启动子如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子，呼吸道合胞病毒(RSV)启动子；诱导型启动子如MMT启动子，金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ApoA1启动子；人珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子如单纯疱疹胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTR(包括本文上述的修饰的逆转录病毒LTR)；β肌动蛋白启动子以及人生长激素启动子。启动子还可以是控制编码所述多肽的基因的天然启动子。
利用逆转录病毒质粒载体转导包装细胞系以形成生产者细胞系。可转染的包装细胞系的例子包括但不限于PE501、PA317、Y-2、Y-AM、PA12、T19-14X,VT-19-17-H2、YCRE、YCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和DAN细胞系，上述细胞系描述于Miller,A.人基因治疗，1:5-14(1990)中。可以通过本领域已知的任何方法将载体转导到包装细胞中。这类方法包括但不限于电穿孔、利用脂质体以及磷酸钙沉淀。在另一种方法中，可将逆转录病毒质粒载体包被到脂质体中，或与类脂偶联，然后施用给宿主。
生产者细胞系将产生感染性逆转录病毒载体颗粒，所述病毒颗粒中含有编码所述多肽的核酸序列。然后可利用所述逆转录病毒载体颗粒在体外或体内转导真核细胞。已发生转导的真核细胞将表达编码所述多肽的核酸序列。可以转导的真核细胞包括但不限于胚胎干细胞、胚胎癌性细胞以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质细胞、内皮细胞以及支气管上皮细胞。
通过下列实施例进一步描述本发明。提供这些实施例仅仅是为了参考具体实施方案说明本发明。这些举证，尽管说明了本发明的某些特定方面，但并不限制本发明公开的范围。在前述词汇部分解释了本文所用的术语。
除特别详细描述外，所有实施例均用标准方法完成，这些方法对本领域技术人员是熟知和常规的。除非特别说明，下列实施例中给的所有部分或量均以重量计。按标准实验室手册如Sambrook等，分子克隆实验室手册第2版；冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989)(本文称为“Sambrook”)可完成下列实施例中的常规分子生物学技术。
除非特别说明，实施例中均利用了Sambrook和许多其它文献如Goeddel等，核酸研究，8:4057(1980)中描述的琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)标准技术完成下列实施例中片段的大小分离。
除非特别说明，此处均利用了标准缓冲液、保温温度和时间、约等摩尔量的待连接DNA片段和每0.5μgDNA约10单位T4 DNA连接酶(“连接酶”)来完成连接。
实施例1用细菌表达并纯化人CKα-2利用特异于图1所示成熟形式人CKα-2蛋白质(SEQ ID NO:2)氨基酸羧基末端序列以及特异于该基因3’侧的载体序列的PCR寡核苷酸引物，扩增编码由保藏的多聚核苷酸编码的人CKα-2蛋白质的DNA序列。将含有有利于克隆的限制位点的其它核苷酸分别加到5’和3’序列。
5’寡核苷酸引物的序列如下5’CCC GCA TGC CCG CGC GTG TGG ACG GG3’(SEQ IDNO:5)，其中含有下划线的SphⅠ限制位点。
3’引物的序列如下
5’CCC GGA TCC CTA TTC TTC GTA GAA CCT3’(SEQ IDNO:6)，其中含有下划线的BamHⅠ限制位点。
这些限制位点适宜于细菌表达载体pQE-9中的限制酶位点，在这些实施例中，将所述细菌表达载体用于细菌表达。(Qiagen,Inc.9259Eton Avenue,Chatsworth,CA 91311)。pQE-9编码氨苄青霉素抗生素抗性(Amp)并含有一个细菌复制起点(ori)，一个IPTG诱导型启动子，一个核糖体结合位点(“RBS”)和一个6-His标记以及一些限制酶位点。
用SphⅠ和BamHⅠ消化扩增的人CKα-2 DNA和载体pQE-9，然后将消化的DNA连接在一起。将CKα-2 DNA插入到经限制切割的载体中，使CKα-2编码区置于该载体的IPTG诱导型启动子的下游并与之有效相连，而且CKα-2编码区与适当放置以用于翻译CKα-2的起始AUG读框一致。
利用标准方法将连接混合物转化到感受态大肠杆菌中。这类方法描述于Sambrook等，分子克隆实验室手册第2版；冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989)。在完成本文的说明性实施例的过程中，使用了含多拷贝质粒pREP4的大肠杆菌菌株M15/rep4，该质粒表达lac阻遏物并赋予卡那霉素抗性(Kan)。该菌株可从Qiagen购买，它仅是可适宜于表达CKα-2的众多菌株中的一株。
通过在存在氨苄青霉素的条件下其在LB平板上的生长能力来鉴定转化体。从抗性菌落中分离质粒DNA，然后通过限制分析确定克隆DNA的同一性。
在补加了氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的LB培养基中的液体培养基内将含所需构建体的克隆培养过夜(“O/N”)。
以约1∶100至1∶250的稀释度，用O/N培养物接种大量培养基。培养细胞至600nm处的光密度(OD600)为04.-0.6。然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM，以通过失活lacI阻遏物来诱导从lac阻遏物敏感型启动子开始的转录。随后将细胞再培养3-4小时。然后用标准方法离心收集细胞并将其破碎。利用常规收集技术从破碎的细胞中纯化包涵体，将包涵体中的蛋白质溶解到8M脲中。将含溶解蛋白质的8M脲溶液在2X磷酸缓冲盐溶液(PBS)中过PD-10柱，由此除去脲，更换缓冲液并再折叠蛋白质。通过进一步的层析步骤纯化蛋白质以除去内毒素。然后，将其过滤除菌。以95微克/毫升的浓度将已过滤除菌的蛋白质贮存于2X PBS中。
实施例2在杆状病毒表达系统中克隆并表达人CKα-2利用对应于该基因5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物扩增编码图1(SEQ ID NO:2)所示并由保藏克隆编码的全长人CKα-2蛋白质的cDNA序列。
该5′引物的序列如下5’GCC GGA TCC GCC ATC ATG TCC CTG CTC CC 3’(SEQ IDNO:7)，其中含有下划线的BamHⅠ限制性酶位点。按下述，插入表达载体后，编码人CKα-2的扩增片段的5’末端提供了一有效的信号肽。按Kozak,M.，分子生物学杂志，196:947-950(1987)所述，真核细胞中翻译起始的有效信号被恰当置于所述构建体的载体部分。
3’引物的序列如下5’CGC GTC TAG ACT ATT CTT CGT AGA ACC T3’(SEQ ID NO:8)，其中含有下划线的XbaⅠ限制位点。
用市售试剂盒(“Geneclean”,BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca.)从1％琼脂糖凝胶中分离扩增的片段。然后用BamHⅠ和Asp718消化该片段，再在1％琼脂糖凝胶上纯化。本文将该片段称为F2。
通过标准技术，如在Summers等，杆状病毒载体和昆虫细胞培养方法指南，Texas Agricultural Experimental Station BulletinNo.1555(1987)所述的技术，在杆状病毒表达系统中使用载体pRG1表达CKα-2蛋白。该表达载体含有苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)的强多角体蛋白启动子，其后为方便的限制位点。将猿猴病毒40(“SV40”)的多聚腺苷酸化位点用于有效的多聚腺苷酸化作用。为了易于筛选重组病毒，按与多角体蛋白启动子相同的方向插入大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因，其后是多角体蛋白基因的多聚腺苷酸化信号。多角体蛋白序列两侧是病毒序列，所述病毒序列可用于与野生型病毒DNA进行细胞介导的同源重组，以便产生表达克隆的多聚核苷酸的活病毒。
技术人员应能理解可用许多其它杆状病毒载体如pAC373,pVL941和pAcIM1代替pRG1，只要按需要构建后可提供位于适当位置的转录、翻译、运输等信号，如读框内AUG和信号肽。这类载体描述于Luckow等，病毒学，170:31-39等。
通过本领域已知的常规方法，利用限制酶XbaⅠ和BamHⅠ消化质粒，然后利用牛肠磷酸酶将其去磷酸化。用市售试剂盒(“Geneclean”，BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca.)从1％琼脂糖凝胶中分离DNA。本文将该载体命名为V2。
利用T4 DNA连接酶将片段F2和去磷酸化的质粒V2连在一起。用连接混合物转化大肠杆菌HB101细胞，然后铺在培养基平板上。用XbaⅠ和BamHⅠ消化来自每个菌落的DNA，然后经凝胶电泳分析消化产物，鉴定出含带有人CKα-2基因的质粒的细菌。通过DNA测序确定克隆片段的序列。本文将该质粒命名为pBacCKα-2。
利用Felgner等，美国国家科学院院报，84:7413-7417(1987)所述的脂转染法，将5μg质粒pBacCKα-2与1.0μg市售线性化杆状病毒DNA(“BaculoGoldTM杆状病毒DNA”,Pharmingen,San Diego,CA)共转染。在含50μl无血清的Grace’s培养基(Life Technologies Inc.,Gaithersburg,MD)的微滴定板的无菌孔中，将1μg BaculoGoldTM病毒DNA与5μg质粒pBacCKα-2混合。此后，加入10μl Lipofectin及90μlGrace’s培养基，混合并在室温保温15分钟。然后将转染混合物滴加到接种于含1ml无血清的Grace’s培养基的35mm组织培养平板上的Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711)中。将该平板前后摇动以混合新加的溶液。然后将平板在27℃保温5小时。5小时后，从平板中除去转染溶液，并加入补加了10％胎牛血清的1ml Grace’s昆虫培养基。将平板放回到培养箱中，在27℃继续培养4天。
4天后，按上文列举的Summers和Smith所述收集上清液并进行噬斑试验。利用含“Blue Gal”(Life Technologies Inc.,Gaithersburg)的琼脂糖凝胶很容易鉴定并分离出表达gal的克隆，所述克隆产生蓝色噬斑。(这种“噬斑试验”的详细说明可参见Life Technologies Inc.,Gaithersburg提供的昆虫细胞培养和杆状病毒学使用者指南，9-10页)。
系列稀释后4天，将病毒加到细胞中。适当保温后，用Eppendorf取液器的吸头挑出蓝色噬斑。然后将含重组病毒的琼脂重悬在含200μlGrace’s培养基的Eppendorf管中。通过短暂离心除去琼脂，然后用含重组杆状病毒的上清液感染接种于35mm培养皿上的Sf9细胞。4天后，收集这些培养皿中的上清液，然后将其贮存于4℃。通过包括限制作图和测序等DNA分析，鉴定出含适当插入的CKα-2的克隆。本文将其命名为V-CKα-2。
在补加了10％热失活FBS的Grace’s培养基中培养Sf9细胞。以约2(约1-约3)的感染复数(MOI)，利用重组杆状病毒V-CKα-2感染细胞。6小时后，除去培养基，并换成无甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900Ⅱ培养基(可从Life Technologies Inc.,Gaithersburg得到)。42小时后，加入5μCi35S-甲硫氨酸和5μCi35S-半胱氨酸(可从Amersham得到)。将细胞再培养16小时，然后通过离心收集细胞并裂解细胞，再通过SDS-PAGE和放射自显影观察标记的蛋白质。
实施例3在COS细胞中表达CKα-2通过将编码图1(SEQ ID NO:2)所示CKα-2的cDNA克隆到表达载体pcDNA/Amp(可从Invitrogen Inc.得到)中来制备表达质粒CKα-2HA。
表达载体pcDNAⅠ/amp含有(1)用于在大肠杆菌和其它原核细胞中有效增殖的大肠杆菌复制起点；(2)用于筛选含质粒的原核细胞的氨苄青霉素抗性基因；(3)用于在真核细胞中增殖的SV40复制起点；(4)CMV启动子，多接头，SV40内含子和一个多聚腺苷酸化信号，它们的排列方式使得通过多接头中的限制位点，可将cDNA方便地置于CMV启动子的表达控制下，并与SV40内含子和多聚腺苷酸化信号有效相连。
将编码完整CKα-2前体和与其3’末端读框一致地融合的HA标记的DNA片段克隆到载体的多接头区以便由CMV启动子指导重组蛋白质的表达。HA标记对应于Wilson等，细胞，37:767(1984)描述的衍生于流感血凝素蛋白的表位。HA标记与靶蛋白的融合使得利用识别HA表位的抗体可以很容易检测重组蛋白质。
质粒的构建策略如下。与上述有关用于在大肠杆菌和草地夜蛾中表达CKα-2的表达载体构建的方法比较相似，利用含有方便的限制位点的引物，扩增保藏克隆的CKα-2cDNA，为了便于所表达的CKα-2的检测、纯化和表征，引物之一含上述血凝素标记(HA标记)。
适宜的引物包括在本实施例中使用的下列序列。5’引物含有划线的BamHⅠ位点，其序列如下5’AAA GGA TCC ATG TCC CTG CTC CCA CGC CGC3’(SEQ IDNO:9)。
3’引物含有划线的XbaⅠ位点，其序列如下5’CGC TCT AGA TCA AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGGGTA TTC TTC GTA GAA CCT GCG3’(SEQ ID NO:10)。
利用BamHⅠ和XbaⅠ消化PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAⅠ/Amp，然后将它们连接起来。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株SURE(可从Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA得到)中，将转化的培养物铺在氨苄青霉素培养基平板上，然后将其保温以便于氨苄青霉素抗性菌落的生长。从抗性菌落中分离质粒DNA，然后通过限制分析及凝胶大小分离确定CKα-2编码片段的存在。
为了表达重组CKα-2，如上述，通过例如Sambrook等，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989)所述的DEAE-DEXTRAN，利用表达载体转染COS细胞。
在使载体表达CKα-2的条件下培养细胞。
利用例如Harlow等，抗体实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1988)所述的方法，通过放射性标记和免疫沉淀检测CKα-2-HA融合蛋白的表达。为了达到该目的，转染后2天，通过在含35S-半胱氨酸的培养基中培养8小时来标记细胞。收集细胞和培养基，洗涤细胞，然后按Wilson等所述(同上文)，利用含去污剂的RIPA缓冲液裂解细胞，该缓冲液含有150mM NaCl,1％NP-40,0.1％SDS,1％NP-40,0.5％DOC,50mM TRIS,pH7.5。利用HA-特异性单克隆抗体从细胞裂解产物和培养基中沉淀蛋白质。然后用SDS-PAGE凝胶和放射自显影分析沉淀的蛋白质。在细胞裂解产物中发现了预期大小的表达产物，而在阴性对照中未发现这种产物。
实施例4CKα-2表达的组织分布利用Sambrook等(同上文)所述的方法等方法，进行Northern印迹分析以检测CKα-2在人组织中的表达水平。利用RNAzolTMB系统(Biotecx Laboratories,Inc.6023 South Loop East.Houston,TX77033)分离总细胞RNA样品。
从组织样品中分离了约10μg的总RNA。在强变性条件下，通过1％琼脂糖凝胶经电泳对RNA进行大小分离。将RNA从凝胶上印迹到尼龙滤膜上，然后处理该滤膜以便与可检测的标记多聚核苷酸探针杂交。
作为检测编码CKα-2的mRNA的探针，将保藏克隆中cDNA插入片段的编码区的反义链标记至具高比活性。利用Stratagene的Prime-It试剂盒，通过引物延伸法标记该cDNA。按供应商推荐的标准反应方法，用50 ng cDNA完成反应。利用得自5-Prime-3-Prime,Inc.ofArapahoe Road,Boulder,CO80303的Select-G-50柱，通过柱层析从其他标记的反应组分中纯化出标记的多聚核苷酸。
在65℃，小体积的7％SDS、0.5MNaPO4、pH7.4中将标记的探针在1,000,000cpm/ml的浓度下与该滤膜杂交过夜。
此后，排掉探针溶液，用0.5xSSC、0.1％SDS在室温将该滤膜洗涤两次，然后在60℃洗涤2次。然后将滤膜干燥并在-70℃利用增感屏对胶片进行曝光。
放射自显影表明CKα-2的mRNA在小肠中很丰富。
实施例5人CKα-2的基因治疗表达通过皮肤活检从人体获得成纤维细胞。将所得的组织置于组织培养基中，并将其分成小块。将小组织块放在湿的组织培养瓶表面，每个瓶中约放10块。将该培养瓶底朝上，紧紧封好，在室温放置过夜。在室温下24小时后，将培养瓶倒置(组织块仍固定在培养瓶底部)，加入新鲜培养基(如Harm’s F12培养基，含10％FBS、青霉素和链霉素)。然后将该组织在37℃培养约一周。此时，加入新鲜培养基并随后每隔数天更换一次。再培养2周后，出现单层成纤维细胞。利用胰酶消化该单层细胞并将其等分到若干个较大培养瓶中。
利用限制酶消化基因治疗用载体以克隆待表达片段。用牛肠磷酸酶处理消化的载体以抑制自连接。在琼脂糖凝胶上分级分离去磷酸化的线性载体并将其纯化。
分离能够表达活性CKα-2的人cDNA。如有必要，可修饰该片段的末端以便克隆到载体中。例如，可利用DNA聚合酶处理5’突出末端以产生平头末端。可利用S1核酸酶除去3’突出末端。利用T4 DNA连接酶可将接头与平头末端连接起来。
将等量的Moloney鼠白血病病毒线性骨架与CKα-2片段混合在一起并用T4 DNA连接酶连接。利用连接混合物转化大肠杆菌，然后将细菌铺在含卡那霉素的琼脂上。卡那霉素表型和限制性分析结果证明该载体含有适当插入的基因。
在含10％牛血清(CS)、青霉素和链霉素的Dulbecco’s ModifiedEagle’s培养基(DMEM)中，在组织培养中培养包装细胞生长至铺满密度。通过标准方法，将含CKα-2基因的载体导入包装细胞。从包装细胞中收集含CKα-2基因的感染性病毒颗粒，该包装细胞现在称为生产者细胞。
将新鲜培养基加至生产者细胞中，在适当的保温期后，从铺满生产者细胞的平板上收集培养基。将含感染性病毒颗粒的培养基通过Millipore滤器过滤以除去分离的生产者细胞。然后用经过滤的培养基感染成纤维细胞。除去成纤维细胞次铺满平板中的培养基，并迅速用经过滤的培养基代替。该培养基中可含有Polybrene(Aldrich)以利于转导。适当保温后，除去培养基并用新鲜培养基代替。如果病毒效价高，那么基本上可感染所有成纤维细胞，并不需要选择。如果效价低，就需要使用含有选择性标记如neo或his的逆转录病毒载体以筛选出已转导的细胞用于扩增。
然后，将工程化成纤维细胞单独或在微载体珠如Cytodex3珠上培养至长满后，再注射到大鼠中。注入的成纤维细胞生产CKα-2产物，该蛋白质的生物学作用被传递给宿主。
显然，可以用除前述和实施例以外的方法实施本发明。从上述教导看，本发明可以有许多修饰和改变，因此它们在所附权利要求的范围内。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人Human Genome Sciences,Inc.
9410 Key West AvenueRockville,Maryland 20850美国申请人/发明人Ni,JianGentz,Reiner LSu,Jeffrey YLi,Haodong(ⅱ)发明题目趋化因子α2(ⅲ)序列数10(ⅳ)通信地址(A)收件人Sterne,Kessler,Goldstein & Fox,P.L.L.C.
(B)街道1100 New York Ave.,Suite 600(C)城市华盛顿(D)州特区(E)国家美国(F)邮编20005-2934(ⅴ)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0,#1.30版(ⅵ)目前的申请资料(A)申请号待定(B)申请日与此同时
(C)分类号(ⅶ)在现中请资料(A)申请号US 60/013,653(B)申请日1996年3月19日(ⅷ)代理人/代理资料(A)姓名Steffe,Eric K.
(B)登记号36,688(C)文献/文档号1488.085PC01(ⅸ)通讯资料(A)电话202-371-2600(B)传真202-371-2540(2)SEQ ID NO:1的资料(Ⅰ)序列特征(A)长度461个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构两种(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置43..375(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置79..375(ⅸ)特征(A)名称/关键词信号肽(B)位置43..126(ⅸ)特征
(A)名称/关键词成熟肽(B)位置127..375(ⅸ)特征(A)名称/关键词信号肽(B)位置79..126(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:ACGAGCTCCG GGCCGCCGCT CCGACGGGCC AGCGCCCTCC CC ATG TCC CTG CTC 54Met Ser Leu Leu-28 -25CCA CGC CGC GCC CCT CCG GTC AGC ATG AGG CTC CTG GCG GCC GCG CTG 102Pro Arg Arg Ala Pro Pro Val Ser Met Arg Leu Leu Ala Ala Ala Leu-20 -15 -10CTC CTG CTG CTG CTG GCG CTG TAC ACC GCG CGT GTG GAC GGG TCC AAA 150Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Tyr Thr Ala Arg Val Asp Gly Ser Lys-5 1 5TGC AAG TGC TCC CGG AAG GGA CCC AAG ATC CGC TAC AGC GAC GTG AAG 198Cys Lys Cys Ser Arg Lys Gly Pro Lys Ile Arg Tyr Ser Asp Val Lys10 15 20AAG CTG GAA ATG AAG CCA AAG TAC CCG CAC TGC GAG GAG AAG ATG GTT 246Lys Leu Glu Met Lys Pro Lys Tyr Pro His Cys Glu Glu Lys Met Val25 30 35 40ATC ATC ACC ACC AAG AGC GTG TCC AGG TAC CGA GGT CAG GAG CAC TGC 294Ile Ile Thr Thr Lys Ser Val Ser Arg Tyr Arg Gly Gln Glu His Cys45 50 55CTG CAC CCC AAG CTG CAG AGC ACC AAG CGC TTC ATC AAG TGG TAC AAC 342Leu His Pro Lys Leu Gln Ser Thr Lys Arg Phe Ile Lys Trp Tyr Asn60 65 70GCC TGG AAC GAG AAG CGC AGG TTC TAC GAA GAA TAGGGTGAAA AACCTCAGAA 395Ala Trp Asn Glu Lys Arg Arg Phe Tyr Glu Glu75 80GGGAAAAACTC CAAACCAGTT GGGAGACTTG TGGCAAAGGA ACTTTGCAGA TTAAAAAAAA455AAAAAA461(2)SEQ ID NO:2的资料(Ⅰ)序列特征(A)长度111个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Ser Leu Leu Pro Arg Arg Ala Pro Pro Val Ser Met Arg Leu Leu-26 -25 -20 -15Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Tyr Thr Ala Arg Val-10 -5 1Asp Gly Ser Lys Cys Lys Cys Ser Arg Lys Gly Pro Lys Ile Arg Tyr5 10 15 20Ser Asp Val Lys Lys Leu Glu Met Lys Pro Lys Tyr Pro His Cys Glu25 30 35Glu Lys Met Val Ile Ile Thr Thr Lys Ser Val Ser Arg Tyr Arg Gly40 45 50Gln Glu His Cys Leu His Pro Lys Leu Gln Ser Thr Lys Arg Phe Ile55 60 65Lys Trp Tyr Asn Ala Trp Asn Glu Lys Arg Arg Phe Tyr Glu Glu70 75 80(2)SEQ ID NO:3的资料(Ⅰ)序列特征(A)长度99个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:Met Arg Leu Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Tyr-16 -15 -10 -5Thr Ala Arg Val Asp Gly Ser Lys Cys Lys Cys Ser Arg Lys Gly Pro1 5 10 15Lys Ile Arg Tyr Ser Asp Val Lys Lys Leu Glu Met Lys Pro Lys Tyr20 25 30Pro His Cys Glu Glu Lys Met Val Ile Ile Thr Thr Lys Ser Val Ser35 40 45Arg Tyr Arg Gly Gln Glu His Cys Leu His Pro Lys Leu Gln Ser Thr50 55 60Lys Arg Phe Ile Lys Trp Tyr Asn Ala Trp Asn Glu Lys Arg Arg Phe65 70 75 80Tyr Glu Glu(2)SEQ ID NO:4的资料(Ⅰ)序列特征(A)长度98个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型不相关(D)拓扑结构不相关(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Ala Pro Pro Thr Arg Arg Leu Leu Asn Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Met Ala Thr Ser His Gln Pro Ser Gly Thr Val Val Ala Arg20 25 30Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Lys Thr Leu Pro Arg Val Asp Phe Glu35 40 45Asn Ile Gln Ser Leu Thr Val Thr Pro Pro Gly Pro His Cys Thr Gln50 55 60Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asp Gly Gln Glu Val Cys Leu Asn65 70 75 80Pro Gln Ala Pro Arg Leu Gln Lys Ile Ile Gln Lys Leu Leu Lys Ser85 90 95Pro Ser(2)SEQ ID NO:5的资料(Ⅰ)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:CCCGCATGCCCGCGCGTGTG GACGGG 26(2)SEQ ID NO:6的资料(Ⅰ)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:CCCGGATCCC TATTCTTCGT AGAACCT27(2)SEQ ID NO:7的资料(Ⅰ)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:GCCGGATCCG CCATCATGTC CCTGCTCCC 29(2)SEQ ID NO:8的资料(Ⅰ)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:CGCGTCTAGA CTATTCTTCG TAGAACCT 28(2)SEQ ID NO:9的资料(Ⅰ)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:AAAGGATCCA TGTCCCTGCT CCCACGCCGC 30(2)SEQ ID NO:10的资料(Ⅰ)序列特征(A)长度57个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:CGCTCTAGAT CAAGCGTAGT CTGGGACGTC GTATGGGTATTCTTCGTAGA ACCTGCG 5权利要求
1．一种分离的核酸分子，其含有与选自由下述组成之组的一个序列至少95％相同的核苷酸序列的多聚核苷酸(a)编码含SEQ ID NO:2中约-28位至约83位氨基酸的多肽的核苷酸序列；(b)编码含SEQ ID NO:3中约-16位至约83位氨基酸的多肽的核苷酸序列；(c)编码含SEQ ID NO:2中约1位至约83位氨基酸的多肽的核苷酸序列；(d)编码具有ATCC 97400中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(e)编码具有ATCC 97400中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列的成熟CKα-2多肽的核苷酸序列；(f)与(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中任一核苷酸序列互补的核苷酸序列；和(g)含有(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中任一核苷酸序列内至少30个连续核苷酸的核苷酸序列；
2．权利要求1的核酸分子，其中所述多聚核苷酸含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
3．权利要求1的核酸分子，其中所述多聚核苷酸含有SEQ ID NO:1内编码具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CKα-2多肽的核苷酸序列。
4．权利要求1的核酸分子，其中所述多聚核苷酸含有SEQ ID NO:1内编码具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的成熟CKα-2多肽的核苷酸序列。
5．权利要求1的核酸分子，其中所述多聚核苷酸含有ATCC 97400中所含cDNA克隆的核苷酸序列。
6．权利要求1的核酸分子，其中所述多聚核苷酸含有编码CKα-2多肽的核苷酸序列，该CKα-2多肽含有由ATCC 97400中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列。
7．权利要求1的核酸分子，其中所述多聚核苷酸含有编码成熟CKα-2多肽的核苷酸序列，该CKα-2多肽含有由ATCC 97400中所含cDNA克隆编码的氨基酸序列。
8．一种分离的核酸分子，其含有在严紧杂交条件下，与含有与权利要求1的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)中核苷酸序列相同的核苷酸序列的多聚核苷酸能杂交的多聚核苷酸，所述能杂交的多聚核苷酸在严紧杂交条件下，与具有仅由A残基或仅由T残基组成的核苷酸序列的多聚核苷酸不能杂交上。
9．制备重组载体的方法，包括将权利要求1的分离的核酸分子插入到载体中。
10．通过权利要求9的方法生产的重组载体。
11．制备重组宿主细胞的方法，包括将权利要求10的重组载体导入宿主细胞中。
12．通过权利要求11的方法生产的重组宿主细胞。
13．生产CKα-2多肽的重组方法，包括在可表达所述多肽的条件下培养权利要求12的重组宿主细胞，然后回收所述多肽。
14．一种分离的CKα-2多肽，其含有与选自由下述组成之组的一个序列至少95％相同的氨基酸序列(a)SEQ ID NO:2中约-28位至约83位氨基酸；(b)SEQ ID NO:3中约-16位至约83位氨基酸；(c)SEQ ID NO:2中约1位至约83位氨基酸；(d)含有由ATCC 97400所含cDNA克隆所编码的氨基酸序列的CKα-2多肽的氨基酸序列；(e)含有由ATCC 97400所含cDNA克隆所编码的氨基酸序列的成熟CKα-2多肽的氨基酸序列。
15．权利要求14的分离的多肽，其是在重组宿主细胞中生产的或包含在重组宿主细胞中。
16．权利要求14的分离的多肽，其中所述重组宿主细胞是哺乳动物细胞。
17．抗权利要求14的多肽的抗体。
18．权利要求14的多肽的活性的激动剂或拮抗剂。
19．对需要CKα-2的患者进行治疗的方法，包括给患者施用治疗有效量的权利要求14的多肽。
20．对需要抑制CKα-2多肽的患者进行治疗的方法，包括给患者施用治疗有效量的权利要求14的多肽的活性的拮抗剂。
21．诊断与权利要求14的多肽的表达相关的疾病或疾病敏感性的方法，包括确定编码所述多肽的核酸序列中的突变。
22．一种诊断方法，包括分析来自宿主的样品中权利要求14的多肽的存在。
23．鉴定可结合并激活或抑制权利要求14的多肽的受体的化合物的方法，包括(a)在一定条件下，将在其表面上表达所述多肽的受体的细胞与待筛选化合物接触以结合受体，所述受体与能够提供因化合物与所述受体结合而产生的可检测信号的第二组分相关；以及(b)通过检测因化合物与受体的相互作用而产生的信号存在与否，确定所述化合物是否结合并激活或抑制该受体。
全文摘要
公开了人趋化因子α－2多肽和编码这类趋化性细胞因子的DNA(RNA)以及通过重组技术生产这类多肽的方法。还公开了将这类趋化性细胞因子用于治疗白血病、肿瘤、慢性炎症、自身免疫性疾病、纤维变性疾病、伤口愈合和牛皮癣的方法。还公开了抗这类趋化性细胞因子的拮抗剂及其作为治疗剂治疗类风湿性关节炎、自身免疫性疾病和慢性和急性炎症和感染性疾病、过敏反应、不依赖于前列腺素的发烧以及骨髓不足的用途。还公开了检测与核酸序列中的突变和所述多肽浓度的改变有关的疾病的诊断方法。还公开了鉴定编码所述趋化性细胞因子的多聚核苷酸中的突变及检测宿主中所述多肽水平的改变的诊断方法。
文档编号A61P17/00GK1217024SQ97194149
公开日1999年5月19日 申请日期1997年3月19日 优先权日1996年3月19日
发明者倪健, R·L·根兹, J·Y·苏, 李浩东 申请人:人类基因组科学公司