柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联方法及其产物的制作方法

专利名称：：柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联方法及其产物的制作方法
技术领域：
：本发明在广义上隶属于蛋白质修饰和水溶性多聚体偶联蛋白、多肽及其突变体或类似物领域；较为具体地表述是，本发明涉及一种柱层析聚乙二醇蛋白氮末端点特异性偶联的新方法，以及利用该方法所获得的一类聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子偶联化合物(PEG-rhG-CSF)及其作为一类具药学上长效、高效、低免疫原性特征的蛋白质化合物长效制剂的应用。
背景技术：
：重组人粒细胞集落朿lj激因子(recombinanthumangranulocytecolonystimulatingfactor,rhG-CSF)可促进骨髓粒系袓细胞增值和分化，增加外周血成熟中性粒细胞的数目与活性，大剂量rhG-CSF尚可动员骨髓各系祖细胞释放入血。因此，自1992年批准上市以来，rhG-CSF主要应用于临床治疗因肿瘤或急性白血病化疗所致的粒细胞减少症、骨髓和外周血干细胞移植、以及慢性、原发性粒细胞减少症等，并取得了良好的疗效和安全性。但rhG-CSF的血浆半衰期较短，仅为34小时，需要每天应用，连续应用7-14天，给治疗和病人带来诸多不便。RoyerGI等于1977年(USP4002531)公布了聚乙二醇醛基衍生物(aldehydederivativeofamonoalkylpolyethyleneglycol)偶联蛋白质赖氨酸和氮末端(N-terminal，N-末端)氨基的方法，并首次证明，这种PEG化修饰细菌天门冬酰胺酶(Asparaginase)和尿激酶(Uricase)可显著降低该酶的免疫原性、增加其体内的稳定性和活性，并能延长血浆衰期，故具有重要的药理学和临床应用的价值。DavisFF等于1977年申请的专利(USP4，179，337)更为详尽地描述了各种可与蛋白质或酶偶联的PEG分子特征，及其上述药理学性质。由于蛋白或多肽序列中常常含有多个赖氨酸，故Royer和Davis等所描述的方法常常会形成PEG蛋白的混合物，如一个蛋白分子连接14个不等的PEG分子。这显然不易实现新药分子生产的质量可控性要求。因此，后来人们一直致力于点特异性聚乙二醇化(Site-specificPegylation)技术的研发。早在1989年Kuga等的工作业已证实，敲除rhG-CSFN-末端11个氨基酸并不影响rhG-CSF的体外活性，说明rhG-CSFN-末端远离分子的活性位点，因此，rhG-CSFN-末端是PEG分子定点偶联的理想位点之一。有多种策略可实现PEG与rhG-CSFN-末端的点特异性偶联，其中包括1)WetzelR等(1)1990年提出的通过控制pH值实现多肽N-末端alfa氨基的高选择性偶联；2)GaertnerHF等〔2)1996年描述了各种可以选择性偶联蛋白N-末端氨基的PEG活性基团，并在白介素-8、G-CSF等分子上应用；3)ChangTK等(3〕1994年发现枯草杆菌酶(subtiligase)具有酶促PEG选择性偶联的作用；4)较近也有学者采用重组DNA技术(4)，通过表达转谷氨酰胺酶(transglutaminase)介导微生物体内PEG点特异性N-末端偶联目标蛋白。在上述WetzelR等1990年提出的通过控制pH值实现多肽N-末端alfa氨基的高选择性偶联的基础上，美国Amgen公司的KinstlerOB和Gabrial等迸一步详细描述了通过降低pH值可以使单甲基聚乙二醇醛基(PEG-ALD)特异性偶联rhG-CSF和复合干扰素等N-末端氨基的方法及其产物，详见USP5，824,784/USP5,985,265/USP7，090,8354B2和US2006/0233746Al以及CN1896103A等专利；Kinstler等将这种通过降低pH值实现PEG-ALD选择性偶联蛋白N-末端反应称为还原性烷基化反应(reductivealkylation)。事实上，在RoyerGI等于1977年的美国专利USP4，002，531和Shaw等在1990年的美国专利USP4，904，584中对此也都已有述及，它是指PEG-ALD与蛋白质的氨基反应分两步进行，即先形成Shiff碱，进而亚胺被还原形成不可逆的PEG-ALD与蛋白质烷基化偶合物，偶联的选择性发生在第一步。还原性垸基化反应出现N-末端选择性的原理是在不同pH值条件下，rhG-CSF分子中赖氨酸上的印silon氨基和N-末端蛋氨酸上的alfa氨基的解离常数(pKa)不同，故印silon氨基和alfa氨基与PEG醛基(PEG-ALD)的偶联反应速率不同，而出现选择性；据计算在pH4.5的条件下，rhG-CSF分子上N-末端alfa氨基与PEG-ALD的偶联反应机率是赖氨酸上的印silon氨基的50倍以上；故当偶联反应持续较长时间时，将会出现绝大多数PEG-ALD偶联在rhG-CSF分子N-末端alfa氨基上，形成单一、定点的PEG-rhG-CSF化合物；因此，形成单一、蛋白N-末端高选择性的条件包括低pH值和较长的反应时间，此外还需要相对较低的PEG-ALD投入量。事实上，近中性、偏碱性或碱性条件下可加速PEG-ALD与蛋白分子氨基的偶联，只是此时会失去PEG-ALD对蛋白N-末端的选择性，而形成多修饰PEG-蛋白质的混合物。在主要涉及PEG化偶联rhG-CSF的专利USP5，824，784中，KinstlerOB对药用PEG-rhG-CSF分子特别保护了分子量在6kDa25kDa(6，000-25,000道尔顿)的PEG分子与rhG-CSF的单一、N-末端氨基的偶联产物。同时，美国Amgen公司也开发出PEG化rhG-CSF新药(PEG-rhG-CSF),即Neulasta(pegfilgrastim)，该新药产品是rhG-CSF蛋白N-末端偶联20kDa分子量PEG的化合物；Neulasta可实现一个化疗周期注射一针的疗效，且安全性上也与普通rhG-CSF(filgrastim)相当，但其单剂用量却高达6mg(6毫克)，是大剂量普通rhG-CSF连续应用十天剂量总和的两倍(即300ug/剂/天X10X2=6mg)，因此Neulasta在药品经济学上存在缺陷。然而本申请发明人所描述的一类长效制剂产物其PEG的分子量恰恰在此专利权利要求的范围之外，且令人意外的是本发明专利申请公布的一类PEG-rhG-CSF化合物分子，作为长效制剂与上述新药Neulasta(pegfilgrastim)相比，具药学上明显的长效、高效和低免疫原性等特征，故预计其临床应用剂量将显著低于Neulasta。FeeCJ(USP2006/0128945Al)公布了一种利用凝胶层析进行蛋白质PEG修饰的技术，提出由于蛋白质和PEG化蛋白质在凝胶层析流动相中的速率差异，使用层析柱进行PEG化偶联反应可能更易产生单一的偶联产物，但FeeCJ的方法〔6)并未涉及需要添加催化剂的PEG化偶联反应，也非蛋白质N-末端的特异性偶联技术。最近LeeBK等(5)描述了利用一种固相PEG化技术点特异性修饰重组人干扰素alfa-2a(IFNa-2a)的方法，并获得了与IFNa-2a蛋白N-末端偶联的PEG-IFN,但此方法是通过使用与KinstlerOB等十分相似的催化反应条件才获得了蛋白N-末端高选择性的偶联产物，因此，从本质上讲，该方法仍然是依据上述还原性烷基化反应的原理，通过控制反应体系的pH值而使PEG-ALD高选择性偶联蛋白N-末端，且由于反应时间的限制使偶联反应率降低，出现较多的游离IFNa-2a;同时该法也并未涉及rhG-CSF的PEG偶联；更未如本发明申请所达到的效果，即利用加长的强阳离子交换层析同时实现PEG-ALD特异性rhG-CSFN-末端偶联与一步纯化获得单一、定点N-末端偶联PEG-rhG-CSF产物；此外，实验表明不同的介质、柱床高度和层析条件等因素均可显著影响层析柱点特异性偶联的结果，包括PEG偶联反应率、偶联位点、偶联产物及其种类以及终产物的分离效果等。综上所述，体外PEG蛋白N-末端点特异性偶联反应有多种，其主要策略是通过提高PEG活化基团对N-末端alfa氨基的选择性而实现，而本发明则是通过离子交换层析将rhG-CSF分子上的赖氨酸印silon氨基"封闭"而实现PEG-ALD与rhG-CSFN-末端蛋氨酸alfa氨基的特异性偶联，并同时实现PEG-rhG-CSF偶联产物的纯化。PEG偶联rhG-CSF而形成的PEG-rhG-CSF新分子种类繁多，其性质可有很大的差异，即使是PEG与rhG-CSFN-末端氨基的特异性偶联产物其性质也可能完全不同；就PEG分子而言，不同的分子量、不同的分子结构(单链、双链、多链)、不同的活性基团、甚或相同活性基团不同的碳原子个数(如丙醛、戊醛等)等都会显著影响偶联化合物分子的某些性质；就rhG-CSF分子而言，是否同时伴有其他偶联位点或是否含有某一赖氨基酸氨基的偶联产物等都可能会明显改变PEG-rhG-CSF的理化、药学和药理学的性质，这些改变包括，但不限于，蛋白质的稳定性、体内外活性、血浆半衰期、体内分布及其免疫原性或抗原性。因此，既往许多PEG偶联蛋白质或多肽的专利，包括Kinstler等的USP5，824，784/USP5，985，265等，由于权利要求范围过于宽泛，使其中PEG偶联蛋白的性质差异很大甚或性质完全相反，大大影响了这些专利的实际应用价值与意义；更不能据此联想到本发明申请所涉及的采用柱层析的方法、以特异的、可控制的方式直接影响rhG-CSF的药学和药理学性质，并开发出与Neulasta(pegfilgrastim)相比，同时具备长效、高效和低免疫原性特征的新的长效制剂。参考文献〔1〕WetzelR，HalualaniR,StultsJT,QuanC.Ageneralmethodforhighlyselectivecross-linkingofunprotectedpolypeptidesviapH-controlledmodificationofN-terminala-aminogroups.BioconjugateChemistry1990;1:114-122。(2)GaertnerHFandOffordRE.Site-specificattachmentoffunctionalizedpoly(ethyleneglycol)totheaminoterminusproteins.BioconjugateChemistry1996:7:38-44。(3〕ChangTK,JacksonDY，BurnierJP,WellsJA.Subtiligase:atoolforsemisynthesisofproteins.ProcNationalAcadScience1994:91:12544-12548。(4)SatoH，YamamotoK，HayashiE，TakaharaY.Transglutaminase-mediateddualandsite-specificincorporationofpoly(ethyleneglycol)derivativesintochimericinterleukin-2.BioconjugateChem2000:11:502—509。〔5〕LeeBK,KwonJS,KimHJ，YamamotoSandLeeEK.Solid-phasePEGylationofrecombinantinterferona_2aforsite-specificmodification:processperformance,characterization,andinvitrobioactivity.BioconjugateChem.2007;18:1728-1734。〔6〕FeeCJ.Size-exclusionreactionchromatography(SERC):ANewTechniqueforproteinPEGylation.Biotechnologyandbioengineering2003;82(2):200-206。
发明内容针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种柱层析聚乙二醇蛋白氮末端点特异6性偶联的新方法，即柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联聚乙二醇的方法，以及利用该方法所获得的一类聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子偶联化合物(PEG-rhG-CSF)及其作为一类具药学上长效、高效、低免疫原性特征的蛋白质化合物长效制剂的应用。发明概述(SummaryofTheInvention)本发明首次公开了一种PEG与rhG-CSF蛋白N-末端点特异性偶联的新方法，即通过离子交换层析同时实现PEG与rhG-CSF蛋白N-末端点特异性偶联及其同步实现单一、定点PEG-rhG-CSF化合物的纯化。其中所述偶联方法中对PEG的选择条件是可与蛋白质氨基偶联的各种活化的单甲基PEG(mPEG)分子，主要包括mPEG-ALD、PEG-琥珀酰亚胺a甲基丁酸酯(mPEG-Succinimidyla—methylbuta丽te，mPEG-SMB)、mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SuccinimidylPropionate,mPEG-SPA)等各种mPEG-N-羟基琥珀酰亚胺活化酯(mPEG_N-Hydroxysuccinimideactiveesters，mPEG-NHSester),优选mPEG-ALD;mPEG的分子量大于25kDa，优选2640kDa，最优选30kDa;mPEG分子可为单链、双链或多链，优选单链；mPEG-ALD，其分子式为mPEG-(CH2)r-CH0，其中r为13，r的更适范围为23，即mPEG-丙醛和mPEG-丁醛。所述偶联方法中对rhG-CSF的选择条件是rhG-CSF或rhG-CSF突变体(rhG-CSFm)的氨基酸序列应符合SEQIDNO.1所示的氨基酸序列公式；其中所述rhG-CSFm为N-末端敲除110个氨基酸而N-末端氨基酸仍为蛋氨酸的rhG-CSF;本发明所述重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)优先采用原核细胞表达体系即大肠杆菌高效表达；尚包括人工合成和各种其他原核细胞、真核细胞、昆虫、植物或动物表达体系；同时rhG-CSF/rhG-CSFm可以是全部的氨基酸序列组成的蛋白，也可以是经过突变的rhG-CSF序列组成的rhG-CSF变异体，甚或是部分氨基酸序列组成的rhG-CSF类似物，但其唯一的特征是体外活性与rhG-CSF相当或不低于3X10E7IU/mg蛋白；上述各种rhG-CSF蛋白均在本发明所涉及的范围之内。所述偶联方法中的层析介质、柱及条件的选择条件是1)层析介质可选用各种离子交换、疏水性、凝胶和亲和等层析介质，其中优选阳离子交换介质，如MacroCapSP、S印haroseFastFlow等；2)层析柱柱床高度优选推荐柱高的上限；3)rhG-CSF蛋白的上样量为介质实测最大载量的30-50%;4)以较低的上样流速、较长的上样时间(35小时)、较高反应率的pH值上样活化的mPEG，以获得更适宜的PEG化反应条件；5)活化的mPEG的上样量按活化的mPEG与rhG-CSF的反应量比为l50mol:lmol进行，优选220mol:lmo1，以利于单修饰的PEG-rhG-CSF的生成；6)以0.5M1M氯化钠盐溶液梯度洗脱，以利各反应产物的有效分离，结果如图l所示。经上述条件的方法获得的单修饰PEG-rhG-CSF洗脱峰样品经液质联用胰蛋白酶酶解肽图分析，重要而出乎意外地发现:活化的PEG的偶联位点为rh-CSF的N-末端，如30kDa、40kDa或20kDa分子量的PEG-ALD均可与rhG-CSF蛋白N-末端形成单一、定点的特异性偶联产物，即PG-N-30，PG-N-40，PG-N-20(详见实施例3);且单修饰PEG-rhG-CSF洗脱峰样品的纯度经高效凝胶色谱(SEC)和高效液相色谱(HPLC)测定证实其纯度大于95%，如图3，图4所示。本发明还发现，选用mPEG-ALD，仅将上述反应体系的pH值下调到4.0，可使单修7饰PEG-rhG-CSF洗脱峰面积占总洗脱峰面积显著降低为62%，未反应rhG-CSF洗脱峰占总洗脱峰面积可显著增加达38%，多修饰PEG-rhG-CSF洗脱峰消失；单修饰PEG-rhG-CSF洗脱峰的样品经液质联用胰蛋白酶酶解肽图分析确定PEG-ALD的偶联位点仍为rh-CSF的N-末端；提示在上述离子交换层析条件下，酸性pH值条件并非PEG-ALD选择性偶联rh-CSFN-末端的主要因素；同样方法，选用可与蛋白质氨酸反应的PEG-ALD和PEG-NHSester(聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺活化酯)修饰剂，采用上述阳离子交换层析，反应体系的pH值分别在5.06.0和6.07.0，均可获得峰面积大于90%的PEG与rh-CSF的N-末端单一、定点偶联产物(如图l和图5所示)；在液相中，采用与上述层析柱PEG化反应相同的反应物比例、条件和持续时间，mPEG-ALD和mPEG-SPA与rhG-CSF的偶联反应产物，经高效凝胶测定表明，通常仅有约23%45%为单修饰的PEG-rhG-CSF，其余36%47%为多修饰PEG-rhG-CSF化合物；1930%未反应的rhG-CSF，与层析柱上PEG化偶联反应产物比例明显不同；本发明通过上述实验令人意外地发现在一定条件下，阳离子交换介质吸附rhG-CSF蛋白，并可"封闭"位于rhG-CSF分子表面的赖氨酸印silon氨基，从而使PEG-ALD或PEG-NHS特异性偶联rhG-CSF分子N-末端蛋氨酸的alfa氨基，形成单一、N-末端定点PEG-rhG-CSF，如PG-N-30等(30kDaPEG-ALD与rhG-CSF蛋白N-末端单一、定点特异性偶联产物)。与此同时，所收集到的单一、N-末端定点PEG-rhG-CSF化合物的纯度大于95%以上(如图2，图3所示)；说明层析柱PEG化反应可同步实现特异性rhG-CSFN_末端单一、定点偶联，以及PEG-rhG-CSF偶联化合物的纯化。发明详述(DetailedDescriptionofTheInvention)本发明所述柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联聚乙二醇的方法，步骤包括选择阳离子交换介质，装载于层析色谱柱中，柱床高度为常规推荐高度的上限，并将其连接到液相层析系统上；使用相当于56倍柱体积的PH3.56.0的20mM醋酸钠缓冲液和质量百分比为0.005%聚山梨醇酯80充分平衡色谱柱；用进料泵，以810ml/min的流速，将rhG-CSF或rhG-CSFm原液加入层析柱中，上样量为介质实测最大载量的10%70%;再在1315ml/min的流速下，用56倍柱体积的pH3.56.0的20mM醋酸钠缓冲液冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；按raPEG:rhG-CSF或rhG-CSFm的反应量比为150mol:lmo1的比例，以0.53ml/min的流速上样加入分子量范围为2640kDa的单甲基PEG，所述不同分子量的mPEG投入总量X按公式(1)计算(1)X=550XiiiXMWpeG/MWg-CSF式中X为不同分子量的raPEG投入总量，m为加入的rhG-CSF蛋白含量，丽peg和MWg-csf分别为mPEG和G-CSF的分子量；再按公式(2)计算还原剂氰基硼氢化钠的加入量(2)NaBH3CN加入量=IOXMW还原剂XX/MWPEG式中MW还原剂为还原剂氰基硼氢化钠的分子量，X为不同分子量的mPEG投入总量，MWPEG为mPEG的分子量；连续上样240±5分钟；反应体系的pH为3.56.0;再以1315ml/min的流速，用586倍柱体积的pH3.56.0的20rnM醋酸钠缓冲液冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；随后用pH3.56.0的20rnM醋酸钠缓冲液与0.5M1M氯化钠的混合液，以洗脱方式08%、8%18%和18%100%洗脱，持续150士2分钟，获得三个洗脱峰，即Pl，P2和P3，分别是多修饰PEG-rhG-CSF、单修饰PEG-rhG-CSF和未反应rhG-CSF洗脱峰，其中P2的峰面积占总峰面积的90±1%，为单修饰的PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm，即聚乙二醇与rhG-CSF或rhG-CSFm蛋白N-末端单一、定点特异性偶联化合物；其中上述rhG-CSF或rhG-CSFm的氨基酸序列应符合SEQIDNO.1所示的氨基酸序列公式。所述SEQIDNO.1氨基酸序列公式如下-1_2_3_4_5-6-7_8_9-10XaaXaaXaaXaaX犯XaaX朋MetThrProLeuGly5ProAlaSerSerLeu10ProGinSerPheLeu15LeuLysCysLeuGlu20GinValArgLyslie25GinGlyAspGlyAla30AlaLeuGinGluLys35LeuCysAlaThrTyr40LysLeuCysHisPro45GluGluLeuValLeu50LeuGlyHisSerLeu55GlylieProTrpAla60ProLeuSerSerCysProSerGinAlaLeuGinLeuAlaGlyCysLeuSerGinLeuHis65707580SerGlyLeuPheLeu85TyrGinGlyLeuLeu90GinAlaLeuGluGly95lieSerProGluLeu100GlyProThrLeuAsp105ThrLeuGinLeuAsp110ValAlaAspPheAla115ThrThrlieTrpGin120GinMetGluGluLeu125GlyMetAlaProAla130LeuGinProThrGin135GlyAlaMetProAla140PheAlaSerAlaPheGinArgArgAlaGlyGlyValLeuValAlaSerHisLeuGinSer145150155160PheLeuGluValSer165TyrArgValLeuArg170HisLeuAlaGinPro175*承*其中所述rhG-CSFm为N-末端敲除110位氨基酸而N-末端氨基酸仍为蛋氨酸的rhG-CSF。rhG-CSF由175个氨基酸组成，所述的rhG-CSF突变体(rhG-CSFm)即指N-末端有110个氨基酸缺失而N-末端氨基酸仍为蛋氨酸的rhG-CSF。上述氨基酸序列公式中，-10Xaa为N-末端10个氨基酸缺失，即rhG_CSF_165;-9Xaa为N-末端9个氨基酸缺9失，即rhG-CSF-166;-8Xaa为N-末端8个氨基酸缺失，即rhG-CSF-167;-7Xaa为N-末端7个氨基酸缺失，即rhG-CSF-168;-6Xaa为N-末端6个氨基酸缺失，即rhG-CSF-169;-5Xaa为N-末端5个氨基酸缺失，即rhG-CSF-170;-4Xaa为N-末端4个氨基酸缺失，即rhG-CSF-171;-3Xaa为N-末端3个氨基酸缺失，即rhG-CSF-172;-2Xaa为N-末端2个氨基酸缺失，即rhG-CSF-173;-1Xaa为N-末端1个氨基酸缺失，即rhG-CSF_174。上述单甲基PEG指可与蛋白质氨基偶联的各种活化的单甲基PEG分子，优选mPEG-ALD或mPEG-N-羟基琥珀酰亚胺活化酯中的PEG-琥珀酰亚胺oc甲基丁酸酯或mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酯。进一步的，上述柱层析粒细胞集落剌激因子氮端定点偶联聚乙二醇的方法中所述阳离子交换介质优选MacroCapSP或S印haroseFastFlow。所述rhG-CSF或rhG-CSFm优选采用原核细胞表达体系中的大肠杆菌表达制备。所述rhG-CSF或rhG-CSFm的上样量优选为介质实测最大载量的30-50%。所述单甲基PEG的分子量优选30kDa;mPEG分子优选单链；所述单甲基PEG的上样量按mPEG:rhG-CSF或rhG-CSFm的反应量比优选为220mol:lmo1的比例。所述单甲基PEG优选mPEG-ALD;其分子式为mPEG-(CH2)r-CHO，其中r选23，即raPEG-丙醛或mPEG-丁醛。其中mPEG-丙醛的分子结构式如下所示；OIImPEG-CH2-CH2-C-H其中mPEG-丁醛的分子结构式如下所示；OIImPEG—CH2-CH2-GH2-C—H所述柱层析rhG-CSF或rhG-CSFm氮端定点偶联单甲基PEG的反应体系的pH优选为5.06.0。本发明所述柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联聚乙二醇方法制得的一类聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子，其特征在于所述聚乙二醇化的重组人粒细胞集落刺激因子分子结构式为CH:,-(CH2CH2-0)n-(CH2)r-NH-rhG-CSF或CH3-(CH2-CH2-0)n-(CH2)r-NH-rhG-CSFm，式中n为570~2200，r为13;同时所述聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子还应具备下列特征1)rhG-CSF或rhG-CSFm与mPEG偶联的分子比例为1:1，偶联位点为rhG-CSF或rhG-CSFm分子N-末端氨基；2)在体外抗酶解试验中将胰蛋白酶与PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm在37'C共同孵育4小时，取样经SDS-PAGE法测定，PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm的酶解百分比应低于50%;3)在比活性测定中，以Lowry法测定待测PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm的蛋白浓度，NFS60细胞/MTT法测体外活性，计算出每毫克蛋白的活性即得比活性，PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm的比活性应大于或等于2.0X10E7U/rag蛋白；4)PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm的血浆半衰期应比Pegfilgrastim(20kDaPEG-ALD与rhG-CSFN-末端偶联产物，即PG-N-20)的血浆清除半衰期长50%以上；5)在免疫原性测定中，PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm在第12周rhG-CSF抗体阳性率应小于20%。其中上述聚乙二醇化的重组人粒细胞集落刺激因子分子式中所述n为5701000，n的更适范围为700土100;r更适范围为23。本发明所述方法制备的一类聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子同时具备分子量和分子结构上的均一性，是单链、单一大分子PEG与rhG-CSF或PEG-rhG-CSFmN-末端定点偶联产物；所述聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子首选分子量30kDaPEG-ALD与rhG-CSFN-末端定点偶联产物，即PG-N-30分子。本发明所述方法制备的一类聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子在体外溶解性和抗酶解性稳定性上明显优于普通rhG-CSF，在体外细胞活性上大于或等于2.0X10E7U/mg蛋白；在体内应用时，与上述Neulasta(Pegfilgrastim，20kDaPEG-ALD与rhG-CSFN-末端偶联产物，即PG-N-20)相比，具有血浆半衰期明显延长、体内活性明显增高和免疫原性降低等长效制剂药代动力学与药效学特征；在粒细胞减少的动物模型上，采用每日连续给药的模式，达到等效水平的PG-N-30的用量低于普通rhG-CSF用量的10倍；采用一个化疗周期注射一针的给药模式，PG-N-30的疗效明显优于PG-N-20，达到相同的有效性PG-N-30的给药剂量可显著低于PG-N-20用量的2倍以上。基于此，本发明所述一类聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子，如PG-N-30和PGm-N-30(30kDaPEG-ALD与rhG-CSFm蛋白N-末端定点偶联产物)，同时具备长效、高效和低免疫原性的特征，在每日连续应用或一个化疗周期应用一次的治疗模式上，均能表现出很好的比较优势，但从药品经济学的角度，每日连续给药或较短给药间隔的给药方式可能是更优的治疗模式。本发明所述聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子在制备用于防治因肿瘤或白血病化疗所致的粒细胞减少症、骨髓及外周血干细胞移植以及原发性慢性粒细胞减少症的胃肠外制剂类药物中的应用。进一步实现的用于防治因肿瘤或白血病化疗所致的粒细胞减少症、骨髓及外周血干细胞移植以及原发性慢性粒细胞减少症的胃肠外制剂，其中含有治疗有效量的本发明所述聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子和药学上可接受的载体。本发明所述由PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm分子制成的胃肠外制剂，明显具备长效、高效和低免疫原性的特征，可实现l-4周注射一次，或可实现一个治疗周期(疗程)用药一次的临床应用模式，执行通常所述的长效制剂功能；然而药效学试验发现随着PEG-rhG-CSF如PG-N-30给药间隔的逐渐加大(如间隔1天、2天等)，要达到与连续应用rhG-CSF相当的疗效，PG-N-30的给药剂量需要成倍增加，要实现一个化疗周期注射一针的给药模式，PG-N-30的给药剂量甚或要达到连续应用rhG-CSF总量的5倍(详见表6-2，表7)，这一结果大大出乎意外，这表明体内仍存在强大的PG-N-30清除机制，一个化疗周期应用一次或较长给药间隔的治疗模式远非经济的或最佳的给药模式，因此每曰连续给药或较短给药间隔的给药方式可能是更优的治疗模式。试验证实采用每天连续注射的治疗模式，PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm连续应用的剂量显著低于普通rhG-CSF;根据应用指征与治疗目的的不同，作为长效制剂一次11应用或采用每天连续注射治疗的PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm的剂量在0.lug300ug/kg体重/1天4周。上述rhG-CSF或rhG-CSFm采用原核细胞表达体系(大肠杆菌)的表达制备rhG-CSF和rhG-CSFm基因克隆与高效表达取人新鲜骨髓细胞进行培养，以美洲商陆分裂素(PWNmitogen)进行激活。提取人骨髓细胞mRNA，RT-PCR方法扩增得到hG-CSF基因。应用多维多参数核苷酸链分析技术，对人G-CSFmRNA原序列进行全面详细分析处理，找到G-CSFmRNA原序中基因阻遏片段，使用PCR和定点突变的方法修改人天然G-CSF基因序列(不改变其编码氨基酸序列)使其适宜于细菌体内表达，将修改后的基因构建在pMD18-T载体上，载体转化到T叩IO菌株中保存。以修改的r力G-C5^基因为模板，利用PCR(聚合酶链式反应)体外扩增r力G-C5F基因。基因经过WeI和I酶切，克隆入大肠杆菌表达载体，并验证质粒的正确性。重组质粒命名为vector-r力C-C5F。将重组质粒vector-r力G-C5^转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。筛选高效表达目标蛋白rhG-CSF的菌株。rhG-CSF和rhG-CSFm的制备rhG-CSF大肠杆菌工程菌株经高密度发酵培养、发酵后处理、rhG-CSF蛋白包涵体洗涤、复性及分离纯化等工艺(详见实施例l)，获得高纯度的rhG-CSF或rhG-CSFm蛋白。在严格无菌操作下，将rhG-CSF大肠杆菌工程菌接种于LB/A卿平板培养，倒置于细菌培养箱中37'C培养12-15小时；选取单一菌落，转接在12mlLB/Amp培养试管中，37°C250rpm振荡培养12小时；取10ml发酵液转接在1000mlLB/Amp发酵液中摇瓶培养(37°C，250rpm振荡)，当菌液浓度达0D6001.52.5时；再接种于15升发酵罐中培养(每升发酵液含胰蛋白胨12克、酵母浸膏24克、磷酸二氢钾3.8克、磷酸氢二钾12.5克、硫酸镁0.5克、甘油6.3克、纯水0.9升、葡萄糖20克和氨苄青霉素0.1克)；设发酵参数为温度37。C、pH7.0、溶氧35%及搅拌转速与溶氧联动。当OD,值达20时，为工程菌对数增长的中期，加入IPTG诱导，持续2小时后终止发酵。冷却发酵液，使其降温至4-8°C。用大容量低温冷冻低速离心机4000rpm离心菌液30分钟，收集菌体。向收集的工程菌菌体沉淀中加入工程菌破碎缓冲液(50raMTris,lmMEDTA，pH7.5缓冲液)。经高压匀浆机在10000psi压力下破碎菌体两遍。破菌后液体经高速冷冻离心机于4°C，lOOOOg下离心20分钟获得工程菌包涵体(IB)粗品。用包涵体洗涤液(50rnMTris,lmMEDTA，pH7.5,2.5%曲拉通x100，0.15MNaCl)反复洗涤三遍，即将包涵体洗涤液与包涵体经高速液体搅拌机充分混合，再在4°C10000g高速离心50分钟收集包涵体，如此反复三遍完成包涵体洗涤与纯化。将已纯化的包涵体按10克湿重比500毫升的比例溶解于包涵体溶解变性液中(50mMTris，lmMEDTA，8M盐酸胍，lmM二巯基赤藓醇)，置4'C下12小时，获得包涵体溶解变性液，在经4°C10000g高速离心40分钟，收取上清。按1:100体积比将包涵体溶解变性液缓慢加入20mM醋酸钠缓冲液(pH6.0)，150mM12氯化钠，3M尿素，0.005%聚山利醇酯80(polysorbate80)复性溶液中，4'C静置24小时，经0.45pm孔径滤膜过滤后，进行蛋白质提纯。rhG-CSF蛋白复性液经过S印haroseFastFlow离子交换层析，平衡缓冲液为20mM醋酸钠缓冲液(pH4.5),150mM氯化钠，0.005%聚山梨醇酯80;60ml/分钟上样，用01M氯化钠梯度洗脱，收集A280d蛋白洗脱峰液。再用缓冲液lOmM醋酸钠缓冲液(pH4.5)，0.005%聚山梨醇酯80缓冲液平衡Superdex75pr印grade凝胶层析柱，按30m1/分钟的流速上样，上样120分钟后，收集出现的A280蛋白吸收峰，即为rhG-CSF原液。采用敲除rhG-CSFN-末端110氨基酸残基、保留N-末端氨基酸仍为蛋氨酸的方法获得rhG-CSF突变体(rhG-CSFm)，即rhG-CSF-165174。同样的方法处理可获rhG-CSFm原液。实施例4中提供的数据显示，敲除rhG-CSFN-末端110氨基酸残基几乎不影响rhG-CSF的体外活性，详见表3。以PEG-丙醛与rhG-CSFN-末端特异性定点偶联方法为优选例，描述PEG化rhG-CSF及其制备工艺选择MacroC邵SP或S印haroseFF阳离子交换介质，装载层析色谱柱，柱床高度达推荐高度的上限，并将其连接到AKTAExplorer100液相层析系统(AmershamBioscience,Sweden)上，使用相当于5倍柱体积的20mM醋酸钠缓冲液pH3.56.O(缓冲液A)和0.005%聚山梨醇酯80充分平衡色谱柱；用进料泵，以10ml/min的流速，将rhG-CSF原液加入色谱柱中，上样量为介质实测最大载量10%70%，更适范围为30-50%，再在15ml/min的流速下，用大约5倍柱体积的缓冲液A冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；以0.53ml/min的流速，加入0.22mM2.2mM30kDa的PEG-丙醛(PEG-propionaldehyde)和2.2mM22mMNaB他CN溶液250ml1500ml，连续上样约240分钟；反应体系的pH为3.56.0，更适为pH5.06.0;再以15ml/min的流速，用大约5倍柱体积的缓冲液A冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；随后用缓冲液8(即缓冲液八+lmol氯化钠)，以洗脱方式08%、8%18%和18%100%洗脱，持续约150分钟，即可记录到如图l所示的离子交换层析谱图，由图中看到，共可获得峰-1，峰-2和峰-3三个洗脱峰，即P1，P2和P3，其中P2的峰面积占总峰面积的90%;P2经还原型SDS-PAGE、高效凝胶色谱(SEC)和高效液相色谱(HPLC)纯度分析为单修饰PEG-rhG-CSF，纯度大于95%(如图2，3，4所示)，该产物通过液质联用胰蛋白酶酶解肽图分析，确定是30kDa分子量的PEG-ALD与rh-CSFN-末端的定点偶联，即PG-N-30(详见实施例3)。同法可得PG-N-10、PG-N-20、PG-N-40以及PGm-N-10、PGm-N-20、PGm-N-30、PGm-N-40等。类似的，以PEG-NHSester(聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺活化酯)与rhG-CSFN-末端特异性定点偶联方法为例，描述PEG化rhG-CSF及其制备工艺选择MacroCapSP阳离子交换介质，装载层析色谱柱，柱床高度达推荐高度的上限，并将其连接到AKTAExplorer100液相层析系统(AmersharaBioscience,Sweden)上，使用相当于5倍柱体积的20mM醋酸钠缓冲液pH3.56.O(缓冲液A)和0.005%聚山梨醇酯80充分平衡色谱柱；用进料泵，以10ml/min的流速，将rhG-CSF原液加入色谱柱中，上样量为介质实测最大载量的10%70%，更适范围为30-50%;再在15ml/min的流速下，用大约5倍柱体积的缓冲液A冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；13以0.53ml/min的流速，加入0,22rnM2.2mM30kDa的PEG-NHSester(聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺活化酯)溶液250ml1500ml，连续上样约240分钟；反应体系的pH为4.57.0，更适为pH6.07.0;再以15ml/min的流速，用大约5倍柱体积的缓冲液A冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；随后用缓冲液B(即缓冲液A+lmo1氯化钠)，以洗脱方式08%、8%18%和18%100%洗脱，持续约150分钟，即可记录到如图5所示的离子交换层析谱图，由图5可以看到单修饰PEG-rhG-CSF的峰面积大于90%的总峰面积，经液质联用胰蛋白酶酶解肽图分析确定为30kDa分子量PEG-NHS与rh-CSF的N-末端单一、定点偶联产物(详见实施例3)。以现有常规方式进行的在液相反应体系中PEG-ALD与rhG-CSF氨基特异性偶联的方法及结果取上述rhG-CSF原液经超滤浓縮使蛋白浓度达2rag/ml，按840mol:lraol比例将分子量为30kDa的PEG丙醛(PEG-propionaldehyde)溶解于2mg/ml的rhG-CSF原液；较适的比例是30kDa的PEG-ALD与rhG-CSF原液摩尔比例为820mol:lmol;反应液为20mM50mM醋酸钠缓冲液，pH5.06.0;再按1:15(w/w)比例加入浓度为7.5mg/ml的氰基硼氢化钠(NaBH3CN)，反应液于4'C25。C下，静置4小时，按1:100(v/v)比例加入lmM稀盐酸溶液(pH3.5)终止反应。用缓冲液20mM50mM醋酸钠缓冲液，pH3.59.0，150mM500mM氯化钠和0.005%聚山梨醇酯80溶液，平衡S印haroseFastFlow离子交换层析柱，按50ml/分钟流速连续上样PEG-rhG-CSF反应液，经01M氯化钠溶液梯度洗脱，收集A280蛋白洗脱峰；获得三个洗脱峰，分别为多修饰PEG-rhG-CSF、单修饰的PEG-rhG-CSF和rhG-CSF的洗脱峰。经计算，仅有约45%的PEG-rhG-CSF为单修饰的PEG-rhG-CSF，另36%为多修饰PEG-rhG-CSF化合物；余19%为未反应的rhG-CSF，结果如图6所示。以现有常规方式进行的在液相反应体系中PEG-NHS与rhG-CSF氨基特异性偶联的方法及结果取上述rhG-CSF原液经超滤浓縮使蛋白浓度达12mg/ml，按550mol:lmol比例将分子量为30kDa的PEG-NHS溶解于2mg/ml的rhG-CSF原液；反应液为20mM50函PBS缓冲液，pH6.09.0，150mM氯化钠；反应液于4'C25。C下，静置15180分钟。用缓冲液20mM50mMPBS缓冲液，pH4.57.0，150mM氯化钠和0.005%聚山梨醇酯80溶液，平衡S印haroseFastFlow离子交换层析柱，按50ml/分钟流速连续上样PEG-rhG-CSF反应液，经01M氯化钠溶液梯度洗脱，收集A280蛋白洗脱峰；获得三个洗脱峰，分别为多修饰PEG-rhG-CSF、单修饰的PEG-rhG-CSF和rhG-CSF的洗脱峰。经计算，仅有约23%的PEG-rhG-CSF为单修饰的PEG-rhG-CSF，另47%为多修饰PEG-rhG-CSF化合物；余30%为未反应的rhG-CSF，结果如图7所示。PEG-rhG-CSF和PEG-rhG-CSFm的理化性质和生物活性本发明首次公开了PG-N-30，PG-N-40,PG-N-20，PG-N-10等的体外理化性质和生物活性数据，详见实施例4。本发明发现，分子量为30kDa的大分子PEG与rhG-CSFN-末端偶联后并未显著影响rhG-CSF的二级结构和等电点，而rhG-CSF的溶解性、抗酶解稳定性却有明显提高，这是此类PEG-rhG-CSF和PEG-rhG-CSFm分子具有体内外生物活性的基础之一(体外理化性质和生物活性数据如表1所示)。表lPG-N-30原液理化性质项目结果HPLC纯度(髙压液相色谱)98%SEC纯度(高效凝胶色谱)98%NFS60/MTT体外活性(U/mg)5.Ox10E7IU/mg分子量(MALDI-TOF)50.667kDa等电点(pl)6.0,与rhG-CSF一致圆二色谱分析与rhG-CSF相似体外溶解性3mg/ml，4'C下静放24月无变化体外抗酶解稳定性按l:25加入胰蛋白酶4h后，残留90%本发明的实验数据还显示(详见表3)，采用NFS60细胞/MTT法同时测定PEG-rhG-CSF和rhEPO的体外活性，发现rhG-CSF蛋白氮末端偶联PEG丙醛所获得的PG-N-IO,PG-N-20，PG-N-30和PG-N-40其体外活性随着偶联PEG分子量的增大，体外活性具降低趋势；而PG-N-10的体外活性明显高于普通rhG-CSF，通常高达50%，这一结果大大令人意外，因为，通常认为PEG大分子的偶联会显著降低rhG-CSF的活性，显然，这一发现具有潜在而重要的临床应用价值；此外，PG-N-20和PG-N-30的体外活性相差约30%，但与PG-N-30相比，PG-N-40的分子量增加了约30%,而其体外活性却降低了2倍以上，出现明显的活性"拐点"。这同时提示，双链PEG(如40kDaPEG-ALD为双链结构)对体外活性的影响大于单连PEG(如30kDaPEG-ALD为单链结构)。因此，本发明确认，首选单链PEG-ALD偶联rhG-CSF的N-末端氨基。PEG-rhG-CSF和PEG-rhG-CSFm的药代动力学与药效动力学试验本发明首次公开了PG-N-30与PG-N-20在健康Beagle犬的系统、规范的药代动力学和药效动力学试验结果(如表4，5、图19，20所示)，皮下注射相同剂量的PG-N-30和PG-N-20后，PG-N-30的消除相半衰期较PG-N-20明显延长，分别是33.5±4.0和21.7±6.7小时；AUC明显大于PG-N-20,PG-N-30的Cax为PG-N-20的120.5%，相对生物利用度为158.7%，且血浆清除率显著低于PG-N-20，表明PG-N-30皮下注射后在体内滞留时间明显长于PG-N-20;因此PG-N-30的长效作用优于PG-N-20。同时显示这种药代动力学参数的改变，也带来了药效学的相应反应，即效应消除相半衰期(W柳)显著延长、效应峰浓度(ANCC,)和基线上效应曲线面积(AOBEC(。—192W)的明显提高；因此PG-N-30比PG-N-20更高效。这一结果出乎意外并异乎寻常，因为PG-N-20就是目前已上市并取得了卓越疗效、安全性和高销量的Neulasta;本发明的试验表明虽然Neulasta在市场上获得了成功，但其并非"最佳的"rhG-CSF的长效制剂；显然，PG-N-30的长效性和高效性更优于Neulasta。PEG-rhG-CSF和PEG-rhG-CSFm的药效学与免疫原性本发明公布的实验结果显示(详见表6-l，表7)，在'"Cs-r照射所致小鼠白细胞减少和化疗所致大鼠白细胞减少的模型上，在每天连续给药的模式下，注射相同剂量的PG-N-30和rhG-CSF，结果表明，两种受试药均可导致白细胞(WBC)和中性粒细胞(ANC)呈量-效依赖性增高，但出乎意料的是，当注射rhG-CSF的剂量是PG-N-30用量的十倍时才能达到等效水平的WBC和ANC的增幅；或相同注射剂量的PG-N-30致WBC和ANC的增高值为rhG-CSF的三倍；这表明在每日连续给药的治疗模式下，PG-N-30具明显的高15效特征，其使用剂量甚或可以低于普通rhG-CSF的剂量；显然，这一发现具有潜在而重要的临床治疗学意义。本发明还发现，在上述两种动物模型上，随着PG-N-30给药间隔的逐渐加大(如间隔1天、2天等)，要达到与连续应用rhG-CSF相当的疗效，PG-N-30的给药剂量需要成倍增加，要实现一个化疗周期注射一针的给药模式，PG-N-30的给药剂量甚或要达到连续应用rhG-CSF总量的5倍(详见表6-2，表7)，这一结果大大出乎意外，这表明体内仍存在强大的PG-N-30清除机制，一个化疗周期应用一次或较长给药间隔的治疗模式远非经济的或最佳的给药模式。本发明发现，在氟尿嘧啶致小鼠白细胞减少模型模型上，采用一个化疗周期应用一次的给药方式，结果表明，单剂应用1200ug/kg的PG-N-30与应用2400ug/kg的PG-N-20等效(如图21所示)；采用相同的给药模式，在环磷酰胺致大鼠白细胞减少模型上，证实单剂应用600ug/kg的PG-N-30与应用1200ug/kg的PG-N-20等效(如图22所示)；因此，在上述两种动物模型上，均证实在一个化疗周期应用一次的治疗模式上，PG-N-30的疗效也明显优于PG-N-20;因此预计PG-N-30的临床用量将显著低于Neulasta。本发明首次证实，PG-N-30可能是更佳的、或更有效的制剂，在每日连续应用和一个化疗周期应用一次的治疗模式上，均能表现出很好的比较优势，但从药品经济学的角度，每日连续给药或较短给药间隔的给药方式可能是更优的治疗模式。本发明还公开了上述PEG-rhG-CSF和PEG-rhG-CSFm免疫原性的试验资料，在正常大鼠上，采用1次/周、连续应用12周的给药方式，结果表明，PG-N-20、PG-N-30和PG-N-40的免疫原性均明显低于rhG-CSF，且PG-N-30和PG-N-40的免疫原性均显著低于PG-N-20。本发明所涉及的PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm偶联化合物为临床药用制剂的有效成分，该制剂中还可以包括稀释剂(diluents)、稳定剂(stabilizers)、防腐剂(preservatives),溶解剂(solubilizers)、孚L化剂(emulsifiers)、佐剂(adjuvants)和载体(carriers)等各类制剂所需的辅料。具体的如1)稀释液Tris-HCL、磷酸、醋酸等缓冲液；2)pH值和离子强度；3)去污剂和溶解剂聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯80;4)充填剂(bulkingsubstances):乳糖、甘露醇。详见Remington'sPharmaceuticalScience,18thEd(1990，MackPublishingCo.，Easton,Pa.18042)Pages1435:1712。有效成分的有效剂量是指考虑体重、年龄等因素的有效的治疗或预防剂量。本发明所涉及的PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm其有效剂量范围在0.lug-300ug/kg体重/剂，较适合的有效剂量范围在0.5ug-200ug/kg体重/剂。本发明所涉及的PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm临床药用制剂，为长效、高效、低免疫原性制剂，通常每l-2周注射一针，或一个疗程应用一次；甚或可达3-4周的长效效果；也可采用每天注射一次的连续给药方式或间隔13天的给药方式；PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm临床药用制剂的应用间隔设计，还与应用的指征和病人的实际情况有关。PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm临床药用制剂，可皮下、肌肉、静脉和腹腔内注射；也可经吸入、舌下或透皮给药。本发明的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子可应用于防治各种粒细胞减少症，常见的指正包括肿瘤或白血病化疗所致的或艾滋病化疗药如AZT所致的粒细胞减少症、骨髓及外周血干细胞移植以及原发性慢性粒细胞减少症等。本发明所提供的资料和方法同样适用于其他细胞因子和抗体片段Fab'，scFv和Fc聚乙二醇化与长效、高效、低免疫原性制剂的开发，如重组人干扰素alfas、干扰素betas、肿瘤坏死因子受体蛋白等等。图1PEG-ALD与rhG-CSFN-末端特异性定点偶联离子交换层析谱图其中峰1为二修饰或多修饰的PEG-rhG-CSF，峰2为单修饰PEG-rhG-CSF，峰3为未反应的rhG-CSF。图2SDS-PAGEPG-N-30分子量测定(银染)。显示PG-N-30的分子量为66.2kDa，为单修饰PEG-rhG-CSF。图3高效凝胶色谱(SEC)测定PG-N-30纯度其中主峰面积大于95%，经检定为单修饰PEG-rhG-CSF，其前的小峰为多修饰PEG-rhG-CSF。图4高效液相色谱(RT-HPLC)测定PG-N-30纯度其中主峰面积大于98%以上，经检定为单修饰PEG-rhG-CSF。图5PEG-NHSester与rhG-CSFN-末端特异性定点偶联离子交换层析谱图显示单修饰PEG-rhG-CSF的峰面积大于90y。的总峰面积，经液质联用胰蛋白酶酶解肽图分析确定为30kDa分子量PEG-NHS与rh-CSF的N-末端单一、定点偶联产物(详见实施例3)。图6高效凝胶色谱分析PEG-ALD与rhG-CSF偶联反应产物其中峰-1为多修饰PEG-rhG-CSF，占总峰面积的33.12%，峰_2为二修饰PEG-rhG-CSF，占总峰面积的2.68%，峰_3为单修饰PEG-rhG-CSF，占总峰面积的45.60%，峰-4为未反应rhG-CSF，占总峰面积的18.60%。图7高效凝胶色谱分析PEG-NHS与rhG-CSF偶联反应产物其中，峰-1为多修饰PEG-rhG-CSF,占总峰面积的44.6%，峰_2为二修饰PEG-rhG-CSF，占总峰面积的2.7%，峰-3为单修饰PEG-rhG-CSF，占总峰面积的22.78%，峰-4为未反应rhG-CSF，占总峰面积的29.92%。图8表达r力-C5F的重组质粒构建。图9SDS-PAGErhG-CSF的表达量分析其中，箭头所指为目标蛋白rhG-CSF的表达带。图10MALDI-TOF测定rhG-CSF分子量。图ll高效液相色谱(HPLC)法测定rhG-CSF原液纯度。图12高效凝胶色谱法(SEC)测定rhG-CSF原液的纯度。图13-1为rhG-CSF原蛋白酶切后M'TPLGPASSLPQSFLLK"片段分析检测结果显示经过一级质谱扫描以及精确质量数扫描，可以断定此肽段m/^894.6左右。图13-2为pH8.0条件下的PEG-ALD单修饰产物PEG-rhG-CSF酶解后对于M'TPLGPASSLPQSFLLK"肽段的一级质谱图，精确质量扫描及二级质谱分析结果显示m/p894.3的片段依然非常清晰的存在，根据其丰度可以看出含量相对较高。这说明与rhG-CSF原蛋白相比，pH8.0条件下的修饰产物有很大一部分位点不在N末端。图13-3为pH4.5条件下的PEG-ALD单修饰产物PEG-rhG-CSF即PG-N-30经胰蛋白酶酶解后对于M'TPLGPASSLPQSFLLK'7肽段的一级质谱图、精确质量扫描及二级质谱分析结果显示m/^894.3的片段几乎不存在，含量非常低，根据其丰度可以看出其含量应该低于510%。这说明与pH8.0条件下的修饰产物相比，pH4.5条件下的修饰产物只有非常小的一部分不在N末端，也即是修饰产物的位点主要都集中在N末端。图14-1PEG-ALD(30kDa)的MALDI-T0F-MS分子量测定结果。图14-2实施例2峰2MALDI-TOF-MS分子量测定结果。图15等电聚焦测定结果。图16圆二色光谱测定rhG-CSF和PEG-rhG-CSF二级结构其中三线示rhG-CSF、PG-N-20和PG-N-30。图17-1PG-N-30(3mg/mL/支)在4。C条件下静置24月后，经过高效凝胶检测结果其中峰1为PG-N-30多聚体占0.5%,峰2为PG-N-30二聚体1.1%，峰3为PG-N-30占98.4%。图17-2rhG-CSF(3mg/mL/支)在4。C条件下静置30天后，经过高效凝胶检测结果其中峰1为rhG-CSF占41.2%，峰2为rhG-CSF聚集体占58.8%。图18rhG-CSF和PG-N-30体外酶解反应图。图19Beagle犬皮下注射同剂量PG-N-30和PG-N-20(200yg-kg-0后的药时曲线。图20-1Beagle犬皮下注射PG-N-30和PG-N-20后不同时间ANC计数的变化。图20-2Beagle犬注射PG-N-30200yg'kg—1后药物浓度与ANC计数的变化比较。图21PG-N-30对氟尿嘧啶致小鼠白细胞减少模型动物中性粒细胞水平的影响。图22PG-N-30对环磷酰胺致大鼠白细胞减少模型动物中性粒细胞水平的影响。具体实施例方式下面的实施范例有助于进一步阐述本发明，但本发明所涉及的内容与范围不仅限于这些范例所述。实施例1表达与制备rhG-CSF及rhG-CSFm表达rhG-CSF及rhG-CSFm:取人新鲜骨髓细胞进行培养，并用美洲商陆分裂素(Sigma公司，美国)进行激活。提取人骨髓细胞mRNA,RT-PCR方法扩增得到hG-CSF基因，经测序(由北京博尚生物技术有限公司完成)证实为hG-CSF基因，其cDNA序列如SEQIDNO.2所示，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。采用DNAStrider软件分析hG-CSF基因DNA序列分析；使用PCR(聚合酶链式反应))和定点突变的方法修改人天然G-CSF基因序列，获新的修饰后的人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)基因编码序列，其核苷酸序列如SEQIDN0.3所示，将此基因构建在PMD18-T载体上，载体转化到T叩IO菌株中保存。以引物rhG-CSF一F(5-GATCCTAGCATATGACTCCATTAGGTCCT-3)为前引物，引物rhG-CSF—R(5-GATCCTAGAATTCTCAGGGCTGCGCAAG-3)为后引物，以pMD18_T/r/^-C5"尸为模板，利用PCR体外扩增r/G-C57^序列(PCR反应条件引物浓度为20Wnol/L，10X缓冲液5W;25mmol/LMgCl24W;1Ommol/L四种dNTP混合液lW;上下游引物各TaqDNA聚合酶0.5nl;模板DNA1W，加水补至经97°C预变性10分钟，94'C变性60秒，55'C退火60秒，72'C延伸60秒，30个循环后72匸延伸10分钟，4°C18保存)。取反应后产物电泳检测(琼脂糖胶浓度为0.8%)片段的分子量。将PCR得到片断和pGLl质粒利用M/eI、I核酸内切酶进行双酶切消化。然后利用PCR产物回收试剂盒(购自OMEGA公司)回收纯化酶切的片段。利用T4连接酶(购买于MBI公司)连接，将反应组成体系(r/^-C5",基因片段6"1;pGLl片断2ul;连接液缓冲液(10X)lu1;T4连接酶lyl)在22。C下进行连接反应，时间为4小时，经连接后得到重组环境诱导型表达质粒pGLl-r/^-C5F。同上述方法，分别使用下列所述前引物及后引物rhG-CSF_R(5-GATCCTAGAATTCTCAGGGCTGCGCAAG-3)以上述方式及条件进行PCR扩增，并将扩增产物克隆进入pGLl质粒的7W/eI、￡cofI两个酶切位点之间，构建rhG-CSF突变体的表达质粒。rhG-CSF--174——F:5-GATCCTAGCATATGCCATTAGGTCCTGCA--3rhG-CSF--173—_F:5_GATCCTAGCATATGTTAGGTCCTGCATCT--3rhG-CSF-172__F:5-GATCCTAGCATATGGGTCCTGCATCTTCT--3rhG-CSF--171——F:5-GATCCTAGCATATGCCTGCATCTTCTTTA--3rhG-CSF-170——F:5-GATCCTAGCATATGGCATCTTCTTTACCA--3rhG-CSF-169——F:5_GATCCTAGCATATGTCTTCTTTACCACAA--3rhG-CSF-168——F:5-GATCCTAGCATATGTCTTTACCACAAAGC--3rhG-CSF-167——F:5-GATCCTAGCATATGTTACCACAAAGCTTC--3rhG-CSF--166——F:5_GATCCTAGCATATGCCACAAAGCTTCCTG--3rhG—CSF-165-—F:5_GATCCTAGCATATGCAAAGCTTCCTGCTC--3将含有重组质粒pGLl-r力G-C5"F转化进入大肠杆菌DH5a。将单菌落挑取转入含有100微克/毫升的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C，225转/分钟下培养过夜。利用质粒试剂盒提取重组质粒pGLl-rfG-C5F，验证质粒的大小。并用#&1、fcoyI核酸内切酶双酶切分析，筛选含有r/^-C5^基因片段的重组质粒转化子；重组质粒图谱见图8。将经过验证的重组质粒pGLl-r/^-C5F转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。挑取LB平板中筛选后的阳性克隆，在无菌条件下用接种环接l2环于5ml并加有终浓度为50150微克/毫升的氨苄青霉素的发酵培养基中，3040'C条件下，150300转/分钟摇床振荡培养816小时，制得种子液；以1%5%的接种量转接入装有501111培养基的300ml三角瓶中。37t:剧烈振荡培养3h，使细菌处于对数生长中期，0De。。值约为0.8。从50ml对数生长期菌液中取lmL做对照，向其余菌液中加入lmol/LIPTG溶液，使其最终浓度为lmmol/L。加入IPTG后菌液继续培养l4h，12000rpm离心10min，取上清与沉淀分别保存待用，最后离心收获细菌，检测目的蛋白的表达。SDS-PAGE结果见图2，rhG-CSF含量占菌体总蛋白的25%左右，如图9所示。同上述方法，以构建的rhG-CSF突变体表达质粒同样经筛选可以获得高效表达目标蛋白的即从N-末端第2到第ll个氨基酸逐一缺失的10个rhG-CSF突变体的工程菌株及其rhG-CSF突变体，即rhG-CSF-174，rhG-CSF-173,rhG-CSF-172，rhG-CSF-171，rhG-CSF-170,rhG-CSF-169，rhG-CSF-168,rhG-CSF-167，rhG-CSF-166，rhG-CSF-165;其氨基酸序列如SEQIDNO.l的氨基酸序列公式所示。rhG-CSF或rhG-CSFm在大肠杆菌表达体系中的表达制备从液氮罐中取出上述rhG-CSF菌种，37'C水浴速融；在严格无菌操作下，将rhG-CSF大肠杆菌工程菌接种于LB/Amp(配方组成为100ml中含胰蛋白胨1克、酵母浸膏0.5克、氯化钠0.5克、氢氧化钠4毫克、琼脂粉1.5克和氨苄青霉素5毫克)，置37'C培养箱(SANYOMC0-17AIC)培养12-15小时，选取单一菌落，转接在12mlLB/Amp(配方组成为100ml中含胰蛋白胨1克、酵母浸膏0.5克、氯化钠0.5克、氢氧化钠4毫克和氨苄青霉素5毫克)培养管中，37°C250rpm振荡培养(HWY111恒温摇床)12小时；取10ml发酵液转接在1000mlLB/Amp发酵液中摇瓶培养(37°C，250rpm振荡)8小时；再接种于15升发酵罐(B.BraunBI0STATC)中培养，每升发酵液含胰蛋白胨12克、酵母浸膏24克、磷酸二氢钾3.8克、磷酸氢二钾12.5克、硫酸镁0.5克、甘油6.3克、纯水0.9升、葡萄糖20克和氨节青霉素0.1克；设发酵参数为温度37。C、pH7.0、溶氧35%及搅拌转速与溶氧联动。当OD6。。值达20时，为工程菌对数增长的中期，加入IPTG诱导，持续2小时后终止发酵。冷却发酵液，使其降温至4-8'C。采用Sorvall大容量低温冷冻低速离心机(SorvallRC3B)离心(4000rpm，30分钟)收集细菌。向收集的工程菌菌体沉淀中加入工程菌破碎缓冲液(50mMTris,lmMEDTA，pH7.5缓冲液)。经APV高压匀浆机(APV2000)10000psi压力下破碎菌体。破菌后液体经高速冷冻离心机(SorvallRC5B)SLA-3000转头11000rpm转速离心(4'C，20分钟)获得包涵体(IB)粗品。使用包涵体洗涤液(50mMTris，lmMEDTA，pH7.5，2.5%曲拉通x100，0.15MNaCl)三遍，与包涵体充分混合，再经低温(4°C)高速离心(SorvallRC5B，11000rpm，50分钟)收集包涵体，完成包涵体洗涤与纯化。将已纯化的包涵体按10克湿重比500毫升的比例溶解于包涵体溶解变性液中(50mMTris，lmMEDTA,8M盐酸胍，lmM二巯基赤藓醇)，4'C，12小时，获得包涵体溶解变性液，离心40分钟(SorvallRC5B,11,000rpm)，收取上清。按1:100体积比将包涵体溶解变性液缓慢加入20mM醋酸钠缓冲液(pH6.0)，150mM氯化钠，3M尿素，0.005%聚山利醇酯80(polysorbate80)复性溶液中，4'C静置24小时，经0.45pm孔径滤膜过滤后，进行蛋白质提纯。rhG-CSF蛋白复性液经过离子交换层析(层析设备AKTApurifier,层析柱INdEX200/500,层析介质S印harosebigbead),平衡缓冲液为20mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)，150mM氯化钠，0.005%聚山梨醇酯80;用01M氯化钠梯度洗脱，分离结果如图3所示，收集A280蛋白洗脱峰液。用上述平衡缓冲液平衡凝胶层析柱(层析柱BPGIOO，层析介质Superdex75pr印grade),按30ml/分钟的流速上样，每次上样持续5分钟(上样量约150ml),上样120分钟后，收集出现的A280蛋白吸收峰，即为rhG-CSF原液。MALDI-TOF(基质辅助激光解析-电离时间飞行质谱)测定rhG-CSF分子量(如图10)，以及高效液相色谱(HPLC)法和高效凝胶色谱法(SEC)测定rhG-CSF原液，结果如图11和图12所示，方法同实施例3所述方法相同。结果表明rhG-CSF的分子量约为18.688kDa;而rhG-CSF原液HPLC和SEC纯度均大于98%。实施例2PEG-丙醛与rhG-CSFN-末端定点偶联制备PEG_rhG_CSF装载MacroCapSP强阳离子交换色谱柱(2.6cmX20cm)，并将其连接到AKTAExplorer100液相层析系统(AmershamBioscience,Sweden)上，使用20mM醋酸钠缓冲液pH5.5(缓冲液A)和0.005%聚山梨醇酯80500ml充分平衡色谱柱；用进料泵，以lOml/min的流速，将rhG-CSF原液0.5rag/ml1500ml加入色谱柱中；再在15ml/rain的流速下，用大约500ml缓冲液A冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；以3ml/min的流速，加入5mg/ml30kDa的PEG-丙醛(PEG-propionaldehyde)和0.lmg/mlNaBH3CN溶液1500ml，连续上样约240分钟；反应体系的pH为5.5;再以15ml/min的流速，用大约500ml缓冲液A冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；随后用缓冲液B(即缓冲液A+lmo1氯化钠)，以洗脱方式08%、8%18%和18%100%洗脱，持续约150分钟，即可记录到如图l所示的离子交换层析谱图，由图1看到，共可获得峰1，峰2和峰3三个洗脱峰，即Pl，P2和P3，其中P2的峰面积约占总峰面积的90%;P1和P3分别占总峰面积的4%和6%。P2经还原型SDS-PAGE、高效凝胶色谱(SEC)和高效液相色谱(HPLC)纯度分析为单修饰的PEG-rhG-CSF，纯度大于95%(如图2，3，4所示)。该产物通过液质联用胰蛋白酶酶解肽图分析确定30kDa分子量PEG-丙醛的偶联位点为rh-CSF的N-末端，即PG-N-30(详见实施例3)。在上述层析柱PEG蛋白N-末端定点偶联法中，若仅改变反应体系的pH值，如在pH4.0和pH6.0下(详见表2),洗脱峰的组成和比例将会改变，但单修饰PEG-rhG-CSF经液质联用胰蛋白酶酶解肽图分析检定仍是30kDa分子量的PEG-丙醛与rh-CSFN-末端的定点偶联，即PG-N-30。表2反应体系pH值的改变对层析柱PEG蛋白N-末端定点偶联的影响pH=4.0pH=5.0pH=6.0单修饰PEG-rhG-CSF62%80%68%多修饰PEG-rhG-CSF02.1%28%未反应rhG-CSF38%17.9%4.0%实施例3液质联用胰蛋白酶酶解肽图分析PEG-ALD与rh-CSF的偶联位点1)测定方法选择液相色谱仪Agillent1100和质谱仪LCQDecaXPMS进行分析，具体方法如下液相色谱仪操作条件流动相为A:0.1%A:0.1%TFA的水溶液，B:0.1%TFA的ACN溶液；色谱条件色谱柱为ZorbaxSBC18(2.lX150mra，Agilent),流速为0.2ml/ml，梯度为0-60min，5%B_60B，60-120min，60%B_90%B，检测波长为214nm;质谱仪操作条件Sheathgas:60arb;Auxgas:O;喷雾电压4.5kV;检测方式Tripleplay;一级质谱Massrange:m/z300-2000;Zoomscan:Datadependentmode;MS/MS:Datad印endentmode;数据处理软件Bioworks3.1;质谱数据解析软件Turbosequest3.1。通过液相色谱自动进样系统将酶解样品注入色谱系统警醒分析。样品处理操作条件待测未修饰蛋白样品处理①取200ri(蛋白浓度lmg/raL)待测样品，加入10uL8M脲，超声10min分散样品，采用0.2M的Tris-HCl调节pH至pH8.0;②按照摩尔比50:1(蛋白胰蛋白酶)加入胰蛋白酶溶液，37'C恒温孵育8h;胰蛋白酶购自美国Promega公司；◎二硫键还原向酶解产物中加入1.4mo1/1的二硫苏糖醇水溶液IOW，震荡混合，37'C反应10分钟；待测修饰蛋白的处理方式与未修饰蛋白处理方式相同，但延长酶切时间至12小时。2)rhG-CSF的氨基酸序列及其可能的酶切位点分析m'tplgpassl'。pqsfllk"cle2。qvrk24iqgdga3。alqek35lcatyk"lchpeelvllghslgipwaplspafasafqrraggvlvashlqsflevsyrvlrhlaqp。理论上，胰蛋白酶的酶切位点为赖氨酸和精氨酸(Lys及Arg)的羧基端，经胰蛋白酶处理酶切可获得的rhG-CSF的肽段为①M'TPLGPASSLPQSFLLK17②CLEQVRK24③IQGDGAALQEK35④LCATYK"⑤LCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQR147⑥AGGVLVASHLQSFLEVSYR'67⑦hlaqp175由于PEG-ALD的修饰位点也为Lys及N末端的Met,因此我们可将注意力集中在Lys41位之前的那些酶切多肽片段的分析即可。理论上讲，rhG-CSFLys41位之前胰蛋白酶酶切可获得下列4个多肽片段①m'tplgpasslpqsfllk'7;②cleqvr『；③iqgdgaalqek35;lcatyk41在实际的酶切片段测定与分析中，我们获得了与理论值完全符合的结果，即已将理论上的酶切片段逐一找到，图13-1为酶切片段①M'TPLGPASSLPQSFLLK17，即在m/z:894.6左右；因原图太多，其余片段未收录。3)PEG-ALD单修饰rhG-CSF的偶联位点分析分析不同pH条件下的PEG-ALD修饰rhG-CSF的产物，即PEG-rhG-CSF，结果发现，在pH=8.0的条件下，单修饰的PEG-rhG-CSF经酶切后m/z=894.3的片段非常清晰的存在，根据其丰度可以看出含量相对较高，如图13-2所示，而其他②CLEQVRK24;③IQGDGAALQEK35;④LCATYK"，则丰度降低或相应片段消失。而在pH=4.5的条件下，却相反，上述片段①M'TPLGPASSLPQSFLLK17m/z=894.3几乎消失(如图13-3所示)，其余三个酶切片段均清晰存在，并与等量的rhG-CSF相应片段的丰度一致；事实上。理论和实验均证实，当PH=4.5条件下，单修饰的PEG-rhG-CSF绝大多数为蛋白N-末端修饰的PEG-rhG-CSF;说明在确认为单修饰的PEG-rhG-CSF的前提下，可以通过判断酶切片段①M'TPLGPASSLPQSFLLK"(m/z=894.3)是否存在及其丰度而判断PEG偶联位点是否位于N-末端。4)样品测定与分析测定图2峰-2收集液样品和图5峰-2收集液样品，结果均未测到酶切片段①M'TPLGPASSLPQSFLLK17(m/z=894.3)的存在，而其他三个酶切片段即②CLEQVRK24;③IQGDGAALQEK35;LCATYK"均清晰可辨，且丰度同等量的普通rhG-CSF酶切图谱，说明上述两个样品单修饰的PEG-rhG-CSF均为PEG-ALD或PEG-NHS与rhG-CSF蛋白N-末端定点偶联的产物。实施例4PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm的理化性质与体外活性1)MALDI-TOF-MS分子量测定在基质辅助激光解析-电离时间飞行质谱仪BrukerDaltonicsAutoflex3(BrukerDaltonicsBillerica公司，美国)上，按操作程序进行MALDI靶的清洗和晾干，采用ZipTipC4(Millipore公司，美国)枪头脱盐、浓縮待测样品；吸取10ul待测样品和标准品点靶；设仪器操作程序条件为延迟提取时间(Delayedextraction)190ns、检测模式为Linearionmode/positiveionmode、激光步页率(Laserfrequency)50Hz、加速电压(AceceleratingVoltage)20KV、图形叠加(sumshots)400次、校正模式为Externalcalibration;通过标准样品的校正，进行样品测定，并对数据处理可获MALDI-T0F-MS分子量测定图谱；如图10、图14_1和图14-2所示。图14-1为实施例2中所用修饰剂PEG-ALD(30kDa)的MALDI-TOF-MS分子量测定结果，为32439.3道尔顿，结果表明MALDI-TOF-MS法测定PEG-ALD(30kDa)的分子量与其标记分子量接近；图14-2所示为上述实施例2中所获峰2测定结果，PG-N-30的分子量为50667.491道尔顿，说明为单修饰PEG-rhG-CSF。2)高效液相色谱(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)蛋白度测定在Agilent1100色谱仪(美国安捷伦公司生产)上，选用碳4VydacC4蛋白色谱柱(公司)，以A相三氟乙酸水溶液(取1.0ml三氟乙酸加水致1000ml)和B相三氟乙酸乙腈溶液(取1.0ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈致1000ml)为流动相；在室温下，设流速为1ml/min、压力为76bar,进行梯度洗脱(070%B相)；待测样品上样体积20ul,上样量不低于30ug，于波长280nm检测。按面积归一化法计算各峰面积。结果如图4，图11所示。3)高效凝胶色i普(SizeExclusionChromatography,SEC)蛋白纯度测定在Agilent1100色谱仪(美国安捷伦公司生产)上，选用凝胶过滤色谱柱Superdex200,HR10/30(GEHealthcareBiosciences公司)，流动相为50mM的磷酸钠缓冲液(内含有O.IM的硫酸钠)，pH6.7;设流速为0.5ml/min、压力为16bar、温度为25。C;检测波长280nm，波宽4nm;参比波长360nm，波宽100nm;待测样品上样量不低于20ug;采用面积归一法进行计算各峰面积。结果如图3，图6，图7，图8，图12，图17-1，17-2所示。4)等电点测定在Phastsystem电泳仪(PharmaciaBiotech,瑞典)上，选择等电聚焦用预制胶PhastGelIEF58(GEHealthcareBiosciences公司,美国)；准备固定液20%(W:V)三氯乙酸、脱色液30%甲醇+10%乙酸混合溶液和染色液0.02%PhastGelBlueR溶液；按"PharmaciaPhastsystem的使用和维护手册"所述设置电泳程序、染色/脱色步骤和清洗程序等，上样量为lul(含12ug蛋白)，根据预制胶PhastGelIEF58所提供的标准蛋白计算判断样品的等电点。如图15所示，rhG-CSF、PG-N-20和PG-N-30的等电点一致，说明PEG偶联在rhG-CSF的N-末端并未改变其等电点。5)园二色光谱测定二级结构待测样品经G-25凝胶层析柱(GEHealthcare,USA)脱盐置换到20rnM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.5)，调节蛋白浓度致0.2mg/ml。按规程操作园二色光谱仪(Jasco-810Spectropolarimeter，Jasco,Tokyo,Japan)，设置参数sensitivity:lOOmdeg，bandwidth:1.0腦,rosolution:0.5nm,response:0.5sec，accumulation:4，scanspeed:500nm/min。测定结果如图16所示。结果表明，PG-N-30、PG-N-20与rhG-CSF的园二色谱图形几乎完全吻合，提示rhG-CSF蛋白分子的氮末端偶联20kDa和30kDa分子量的PEG可以很好地保持其二级结构。6)体外活性采用体外NFS60细胞/MTT法测定并比较了rhG-CSF和各种PEG-rhG-CSF的体外活性，结果如表3所示。NFS细胞/MTT比色法详细方法见中华人民共和国药典2005年版三部附录XE。NFS60细胞购自中国药品生物制品检定所，NFS60细胞在含10%新生牛血清、20ng/mlrhG-CSF的RPMI1640培养基(含青霉素10E5IU/L和链霉素10E5IU/L)中37°C、5%二氧化碳培养，控制细胞浓度为每lml含1.0X10E54.0X10E5个细胞，传代2436小时用于活性测定；离心收集NFS60细胞，用RPMI1640培养基清洗细胞3次；配成lml含2.OX10E5个细胞的细胞悬液；在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养液板中每孔加入细胞悬液50ul,于37。C、5%二氧化碳培养40-48小时；每孔加入20uL噻唑蓝试剂(MTT试剂，Sigma,USA),继续培养5小时；每孔加入lOOuL裂解液(由盐酸14ml、TritonX-100溶液50mL加异丙醇致500mL制成)，混匀后，放入酶标仪(Bio-Tek公司，USA)，以630nm为参比波长，于波长570nm处测定吸光度值。表3rhG-CSF体外活性测定结果rhG-CSFNFS60细胞/MTT法rhG-CSF1.0±0.32〉<10E8rhG-CSF-1659.0±0.29><10E7rhG-CSF-1749.5±0.37〉<10E7PG-N-101.5±0.43〉<10E8PG-N-201.0±0.38)<10E8PG-N-307.5±0.32><10E7PG-N-401.1±0.36><10E7PG-165N-307.3±0.34><10E7PG-174N-307.1±0.41><10E7di-PG-402.1±0.56><10E6从表3中可以看到PG-N-10比rhG-CSF的体外活性明显为高；rhG-CSF蛋白氮末端偶联PEG丙醛所获得的PG-N-10,PG-N-20,PG-N-30和PG-N-40其体外活性随着偶联PEG分子量的增大，体外活性具降低趋势，且PG-N-40的体外活性的降低尤为显著，较PG-N-30体外活性降低2倍以上，出现明显的活性"拐点"，而PE-N-IO、PE-N-20和PE-N-30的体外活性相差在30%之内。偶联两个20kDaPEG的di-PG-40其体外活性显著低于同等分子量的PG-N-40;而PG-165N-30和PG-174N-30的体外活性与PG-N-30相差不大。7)PG-N-30制剂的稳定性在10mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)、0.005%聚山梨醇酯80、5%山梨醇的溶液中，蛋白浓度为3mg/mlPE-N-30，在4'C下保持24个月，经SEC测定未发现蛋白聚集或降解(如图17-1所示)，而rhG-CSF在此条件下保存l个月即出现少量蛋白聚集，为可溶性聚集体(如图17-2所示)；说明PEG化rhG-CSF明显增加了蛋白的溶解性或在水中的稳定性。8)PE-N-30体外抗酶解稳定性用超纯水透析待测样品24小时，冻干(冷冻干燥机，Alphal-2，MatinChrist,USA)待测样品后，用1。/。碳酸氢铵水溶液溶解致1.5rag/ml，按l:25(w/w)加入TPCK处理过的胰蛋白酶(TPCKtreatedTRYPS頂，Sigma，USA)与待测样品PG-N-30和rhg-CSF在37'C恒温下共同孵育，分别在15、30、60、120和240分钟取样，SDS-PAGE法测原蛋白酶解百分比，结果如图18所示，结果表明，酶解4小时后，PG-N-30尚有90%未被酶解，而rhG-CSF在1小时即被酶解约50%。说明PEG30-rhG-CSF的抗酶解稳定性远远高于普通rhG-CSF。实施例5PEG-rhG-CSF药代动力学与药效动力学试验选健康Beagle犬进行药代动力学和药效动力学试验，经单次皮下注射相同剂量即200ug/kg的PG-N-20和PG-N-30,在给药0，1，3，6，8，10，12，24，48，72，96，120，144,168和192小时后从前肢头静脉采血，每一取血时间点同时取6只动物，按常规方法制备血清，-2(TC保存，釆用ELISA法(美国R&D公司，晶美公司分装)测定血药浓度；且对格采血点的全血测定中性粒细胞计数(ANC)，结果见表4，表5和如图19、图20-1所示。_表4.比格犬皮下注射不同分子量PEG-rhG-CSF(200ug'kg—。后PK主要参数比较(^±、n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表5.比格犬皮下注射不同分子量PEG-rhG-CSF(200ug'kg—1)后的PD主要参数比较(f±、n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>上述试验结果大大出乎意外，并首次证实，PG-N-30与PG-N-20(即是已上市的Neulasta)相比，血浆清除半衰期显著延长、血药清除率(CL/F)明显降低、血药浓度(CM)和平均药时曲线下面积(AUC(。-函))均显著增加；同时这种药代动力学参数的改变，也带来了药效学的相应反应，即效应消除相半衰期(t1/2(E))显著延长、效应峰浓度(ANCCK1X)和基线上效应曲线面积(A0BEC(。—192W)的明显提高；这表明虽然Neulasta在市场上取得了很好的疗效和销量，但其并非"最佳的"rhG-CSF的长效制剂；显然，PG-N-30的长效作用比Neulasta更优。在探索血药浓度与血ANC的变化规律中发现，两者呈负相关趋势(如图20-2所示)；说明rhG-CSF受体对血PG-N-30具明显的清除作用。这一点在Neulasta的临床应用中也得到了证实。实施例6PEG-rhG-CSF的药效学试验在放射线照射('37Cs-r照射一次，剂量为3.78Gy，照射时间4.7分钟)BALB/C小鼠致白细胞减少的模式上，每天皮下应用同等剂量12，48和120ug/kg的PG-N-30和rhG-CSF，连续15天，于给药后第5，10和15天取血测中性粒细胞计数(ANC)等，结果表明(表6-1所示)，自第5天起PG-N-30和rhG-CSF组ANC即显著高于模型对照组；且各剂量组间ANC的增高具剂量依赖性趋势；令人惊异地发现，注射12ug/kg的PG-N-30所致ANC的增高与注射120ug/kg的rhG-CSF的结果相当；而注射PG-N-30致ANC的增高值比注射相同剂量的rhG-CSF致ANC的增加高3倍以上。但是，PG-N-30如果采用隔一日、隔两日或一个化疗周期使用一次的给药模式，则随着给药间期的延长，给药剂量显著增加25倍才能达到与连续应用12pg/kg的rhG-CSF15天等效，如表6-2所示，这说明在体内存在对PG-N-30的受体清除机制的情况下，一个化疗周期应用一次或较长给药间隔的治疗模式远非经济的或最佳的给药模式。在环磷酰胺致大鼠白细胞减少的动物模型上(腹腔注射)，每天皮下应用同等剂量10，30和100ug/kg的PG-N-30和rhG-CSF，连续10天，于给药后第4，7和10天取血测中性粒细胞计数(ANC)等，结果如表7所示，所得到的结论与前放射致小鼠白细胞减少的动物模型上的结论完全一致，即注射10ug/kg的PG-N-30所致ANC的增高与注射100ug/kg的rhG-CSF的结果相当；而注射PG-N-30致ANC的增高值比注射相同剂量的rhG-CSF致ANC的增加高3倍以上。这表明在每日连续给药的治疗模式下，PG-N-30具明显的高效特征，其使用剂量甚或可以低于普通rhG-CSF的剂量。但是，与放射致小鼠白细胞减少的模型应用结果一样，如果PG-N-30采用一个化疗周期注射一针的给药模式，则需要注射500ug/kg/cycle(化疗周期)才能获得与连续应用rhG-CSF10g/kg/d疗效相当的结果(见表7)。表6-l连续皮下注射PG-N-30对放射致白细胞减少小鼠ANC的影响X士SD(n=10)药物与剂量(Ug/kg)给药后5天给药后10天给药后15天ANC(个/mm3)ANC(个/mm3)ANC(个/mm3)PG-N-3012790.48±206.64*2040.06±154.8*o6605.04±83.5*o48979.48±216.2*2279.43±203.7*o13321.44±167.0*o120rhG-CSF1248120模型对照组正常对照组1255.49±350.1*776.55±164.3*866.52±185.9*1256.64±230.7'280.5±78.22787±937.33127.28±338.5*1064.96±122.91348.48士203.02628.92±212.4210.2±53.8*2210.3±991.1*〇16615.2±395.6*of2181.60±260.6**2679.10±259.9**5128.45±354.25*1025.7±318.22122.5±457.5注与模型组数值相比*P<0.01，与相同剂量阳性对照组数值比OP<0.01表6-2连续皮下注射PG-N-30对放射致白细胞减少小鼠ANC的影响X±SD(n=10)药物与剂量(|ag/kg)给药后5天ANC(个/腿3)给药后10天ANC(个/ram3)给药后15天ANC(个/mm3)PG-N-3048|ag/kg/2d72吗/kg/3d900|ag/kg/cyclerhG-CSF12叫/kg/d模型对照组正常对照组877.73±202.9'929.60±187.2858.00±264.6:776,55±164.3:280.5±78.22787±937.3*1298.33±163.01469.18±228.71103.5±179.3*1064,96±122.9210.2±53.82210.3±991.1*1886.64±489.62675.76±728.71677.38±276.12181.60±260.61025.7±318.22122,5±457.5*注与模型组数值相比*P<0.(H;与12jLig/kg/d阳性对照组数值比OP<0.01表7皮下注射PG-N-30对化疗致白细胞减少大鼠ANC的影响X±SD(n=10)药物与剂量(|ag/kg)给药后4天ANC(个/mm3)给药后7天ANC(个/mm3)给药后10天ANC(个/mm3)PG-N-30lOpg/kg/d3(Wkg/d100叫/kg/d500|ag/kg/cyclerhG-CSFlOpg/kg/d30ng/kg/d10(Wkg/d模型对照组正常对照组1934.0±323.8*2769.9±327.7*2906.0±655.7*4114.2±1498.1*1531.1±37L5*1752.6±265.0*1706.1±400.4*612.7±274.23760.0±2114*6416.0±994.5*o9618.0±1270.0*o17543.8±1181.44179.96±661.63807.3±445.5*5897.8±928.8*7633.5±484.3*2072.0±439.0*4075.4土141.2*20586.7土1414.4*o30503.1±3018.4*oO70905.7±1914.4*o9455.27±1298.411651.1±1594.8*14166.3±1117.1*21232.9±2130.3*9079.2±1513.26337.9±1748.4注与模型组数值相比*P<0.01,阳性对照组数值比*<0.05。与相同剂量阳性对照组数值比OP<0.01，与10pg/kg/d在5-氟尿嘧啶(5-Fu)致小鼠白细胞减少的动物模型上(尾注射120mg/kg的5_Fu)，于化疗药注射后第3天，一次皮下注射PG-N-30600ug/kg(低剂量组)，1200ug/kg(中剂量组)和2400ug/kg(高剂量组)，以及PG-N-202400ug/kg和rhG-CSF60ug/kg/日连续9天；分别在给药后第0，3，6，9天采血测ANC等，结果如图21所示；在环磷酰胺(cy)致大鼠白细胞减少的动物模型上(腹腔注射cy35mg/kg，连续三天)，于化疗药注射后第2天，一次皮下注射PG-N-30300ug/kg(低剂量组),600ug/kg(中剂量组)和1200ug/kg(高剂量组),以及PG-N-201200ug/kg和rhG-CSF30ug/kg/日连续10天；分别在给药后第0，3，5，7,IO天采血测ANC等，结果如图22所示；上述两个试验均表明一次皮下应用高、中、低剂量的PG-N-30和高剂量的PG-N-20均能在给药后第3天有效纠正粒细胞减少，同时中剂量的PG-N-30与高剂量的PG-N-20导致粒细胞的反应程度与模式相当，两者相差一倍的用量，因此，在上述两种动物模型上，证实在一个化疗周期应用一次的治疗模式上，PG-N-30的疗效也明显优于PG-N-20;因此预计PG-N-30的临床用量将显著低于Neulasta。实施例7PEG-rhG-CSF的免疫原性试验在健康SD大鼠上，受试化合物(每组15只大鼠)按每周注射一次、每次10ug/kg的给药模式，连续给药、观察12周，于第1周和第8，10，12周抽血测定ANC和抗PEG-rhG-CSF抗体；采用间接ELISA法测定PEG_rhG-CSF抗体(美国R&D公司，即将PEG-rhG-CSF(抗原)用pH9.6的Na2C03-NaHC03溶液稀释成10ug/ml浓度，包被于96孔酶标板上，每孔100ia，4'C过夜。用2%BSA封闭液37。C封闭2h后，各孔加入100"l用样品稀释液稀释的待检血清样品，同时设阳性和阴性对照孔，37t孵育lh。洗涤后每孔加lOOy1辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠IgG(l:6万)，37'C再孵育lh。洗涤后各孔加100u1酶反应底物TMB，37。C反应20min。用50y1终止液终止反应，在酶标微板读数仪上读取各孔450，处的OD值。抗体阳性率的判断以同期赋形剂对照组动物血清标本所测得OD值的2.1倍作为产生抗体的阈值，凡给药后血清标本测得的OD值大于或等于阈值者，判定为阳性。结果如表8所示，结果表明PG-N-20，PG-N-30，PG-N-40的免疫原性均低于rhG-CSF，而PG-N-30和PG-N-40的免疫原性均低于PG-N_20。表8大鼠连续应用各种PEG-rhG-CSF的免疫原性比较受试化合物第12周第10周第8周阳性％抗体阳性抗体阴性抗体阳性抗体阴性抗体阳性抗体阴性rhG-CSF53.3%A878769PG-N-2015.0%*312312213PG-N-306.6%*△114114015PG-N-400.0%*△015114114PG-165N-3013.3%*213015015PG-174N-306.6%*△114213114PBS00.()%*△015015015注糸与rhG-CSF相差异显著P〈0,05;△与PG-N-20相比差异显著P<0.05。序列表<110>天津派格生物技术有限公司，中国科学院过程工程研究所<120>柱层析粒细胞集落剌激因子氮端定点偶联方法及其产物〈141〉2008-12-1<160〉3〈210〉1<211>175〈212〉PRT〈213>重组人粒细胞集落刺激因子<221>rhG-CSF或rhG_CSFm的氨基酸序列公式<222〉(1)…(175)<400>1_1MetThrLysCysGinGluValLeu50CysPro65SerGlySerProAspPheProAla130PheGin145PheLeu-2XaaProLeuLys35LeuSerLeuGluAla115LeuArgGlu-3-4XaaXaaLeuGly5GluGin20LeuCysGlyHisGinAlaPheLeu85LeuGly100ThrThrGinProArgAlaValSer165-5Pro-6-7XaaXaaAlaSerValArgLysAlaSerLeu70TyrProlieThrGly150TyrThrTyr40LeuGly55Ginl>euGinGlyThrLeuTrpGin120GinGly135GlyValArgVal-8-9XaaXaaSerLeu10lieGin25LysLeulieProAlaGlyLeuLeu90AspThr105GinMetAlaMetLeuValLeuArg170-10XaaProGlyCysTrpCys75GinLeuGluProAla155HisGinSerPheLeuLeu15AspGlyAlaAlaLeu30HisProGluGluLeu45AlaProLeuSerSer60LeuSerGinLeuHis80AlaLeuGluGlylie95GinLeuAspValAla110GluLeuGlyMetAla125AlaPheAlaSerAla140SerHisLeuGinSer160LeuAlaGinPro氺*氺175<210〉2〈211>528〈212>DNA〈213〉重组人粒细胞集落刺激因子<221〉天然编码人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)基因〈222〉(1)…(528)<400>2atgacccccc認gtgaggaaagctgtgcccccctgagct3gcggcctttggtcccacctc卿tgg犯gttcgcctctgttcctgg鄉tgggccctgcacatccagggaccccgaggacctgccccagtcctctaccatggacacactaactggg犯tctttccagcgtgtcgtaccgcagctccctgcgatggcgcagctggtgctgccaggccctgggggctcctggcagctggacggcccctgccccgggcaggacgttctacgcccccagagctgcgctccaggctcggacactcagctggcagc郷ccctgggtCgCCg￡LCtctgcagcccaggggtcctggcaccttgcgctcctgctcaa卿agctgtgctctgggcatgctgcttgag■gggatatcttgccaccaccccagggtgcttgctagccaagccctgagtgctt卿gtgccacctaccccctgggctccaactccatccccgagttgcatctggcagcatgccggcctctgcagagc60120180240300360420480〈210〉3〈211〉528〈212〉腿〈213〉重组人粒细胞集落刺激因子<221>修饰后的编码人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)基因〈222〉(1)…(528)〈400〉3atgactccataagctgtgcccccctgagctagcggcctttggtcccacctc卿tgg鄉ttcgcctctgttcctggaggtaggtcctgc卿tccsgggaccccgaggacctgccccagtcctctaccatggacacact■ctggg^tctttccagcgtgtcgtaccgatcttctttacgatggcgcagctggtgctgccaggccctgggggctcctggcagctggacggcccctgccccgggc鄉acgttctacgcccaca^gctgcgctcc鄉ctcggacactcagctggcagcaggccctgggtcgccgactctgcagcccaggggtcctggcaccttgcgctcctgctcaa卿agctgtgctctgggcatgctgcttgagttgccaccacccc鄉gtgcttgctagccaagccctgagtgctt卿gtgccacctaccccctgggctccaactccatccccgagttgcatctggcagcatgccggcctctgcagagc6012018024030036042048030权利要求1.一种柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联聚乙二醇的方法，步骤包括选择阳离子交换介质，装载于层析色谱柱中，柱床高度为常规推荐高度的上限，并将其连接到液相层析系统上；使用相当于5～6倍柱体积的pH3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液和质量百分比为0.005％聚山梨醇酯80充分平衡色谱柱；用进料泵，以8～10ml/min的流速，将rhG-CSF或rhG-CSFm原液加入层析柱中，上样量为介质实测最大载量的10％～70％；再在13～15ml/min的流速下，用5～6倍柱体积的pH3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；按mPEG∶rhG-CSF或rhG-CSFm的反应量比为1～50mol∶1mol的比例，以0.5～3ml/min的流速上样加入分子量范围为26～40kDa的单甲基PEG，所述不同分子量的mPEG投入总量X按公式(1)计算(1)X＝5～50×m×MWPEG/MWG-CSF式中X为不同分子量的mPEG投入总量，m为加入的rhG-CSF蛋白含量，MWPEG和MWG-CSF分别为mPEG和G-CSF的分子量；再按公式(2)计算还原剂氰基硼氢化钠的加入量(2)NaBH3CN加入量＝10×MW还原剂×X/MWPEG式中MW还原剂为还原剂氰基硼氢化钠的分子量，X为不同分子量的mPEG投入总量，MWPEG为mPEG的分子量；连续上样240±5分钟；反应体系的pH为3.5～6.0；再以13～15ml/min的流速，用5～6倍柱体积的pH3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液冲洗柱子，去除不与色谱介质发生静电吸附的物质；随后用pH3.5～6.0的20mM醋酸钠缓冲液与0.5M～1M氯化钠的混合液，以洗脱方式0～8％、8％～18％和18％～100％洗脱，持续150±2分钟，获得三个洗脱峰，即P1，P2和P3，其中P2的峰面积占总峰面积的90±1％，为单修饰的PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm，即聚乙二醇与rhG-CSF或rhG-CSFm蛋白N-末端单一、定点特异性偶联化合物；其中上述rhG-CSF或rhG-CSFm的氨基酸序列应符合SEQIDNO.1所示的氨基酸序列公式，其中所述rhG-CSFm为N-末端敲除1～10位氨基酸而N-末端氨基酸仍为蛋氨酸的rhG-CSF；上述单甲基PEG指能与蛋白质氨基偶联的各种活化的单甲基PEG分子，为mPEG-ALD或mPEG-N-羟基琥珀酰亚胺活化酯中的PEG-琥珀酰亚胺α甲基丁酸酯或mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酯。2.如权利要求1所述柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联聚乙二醇的方法，其特征在于所述阳离子交换介质为MacroCapSP或S印haroseFastFlow。3.如权利要求1所述柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联聚乙二醇的方法，其特征在于所述rhG-CSF或rhG-CSFm采用原核细胞表达体系中的大肠杆菌表达制备。4.如权利要求1所述柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联聚乙二醇的方法，其特征在于所述rhG-CSF或rhG-CSFm的上样量为介质实测最大载量的30-50%。5.如权利要求1所述柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联聚乙二醇的方法，其特征在于所述单甲基PEG的分子量选30kDa;mPEG分子选单链；所述单甲基PEG的上样量按mPEG:rhG-CSF或rhG-CSFm的反应量比为220mol:lmol的比例。6.如权利要求1或5所述柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联聚乙二醇的方法，其特征在于所述单甲基PEG选mPEG-ALD;其分子式为mPEG-(CH2)r-CHO，其中r选23，即mPEG-丙醛或mPEG-丁醛。7.如权利要求1所述柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联聚乙二醇的方法，其特征在于所述柱层析rhG-CSF或rhG-CSFm氮端定点偶联单甲基PEG的反应体系的PH为5.06.0。8.权利要求1所述柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联聚乙二醇方法制得的一类聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子，其特征在于所述聚乙二醇化的重组人粒细胞集落刺激因子分子结构式为CH3-(CH2CH2-0)n-(CH2)r-NH-rhG-CSF或CH3-(CH2-CH2-0)n-(CH2)r-NH-rhG-CSFm，式中n为5702200，r为13;同时所述聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子还应具备下列特征1)rhG-CSF或rhG-CSFm与mPEG偶联的分子比例为1:1，偶联位点为rhG-CSF或rhG-CSFm分子N-末端氨基；2)在体外抗酶解试验中将胰蛋白酶与PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm在37'C共同孵育4小时，取样经SDS-PAGE法测定，PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm的酶解百分比应低于50%;3)在比活性测定中，以Lowry法测定待测PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm的蛋白浓度，NFS60细胞/MTT法测体外活性，计算出每毫克蛋白的活性即得比活性，PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm的比活性应大于或等于2.0X10E7U/mg蛋白；4)PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm的血浆半衰期应比Pegfilgrastim即PG-N-20的血浆清除半衰期长50%以上；5)在免疫原性测定中，PEG-rhG-CSF或PEG-rhG-CSFm在第12周rhG-CSF抗体阳性率应小于20%。9.如权利要求8所述的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子，其特征在于所述聚乙二醇化的重组人粒细胞集落刺激因子分子结构式中n为700土100;r为23。10.权利要求8所述聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子在制备用于防治因肿瘤或白血病化疗所致的粒细胞减少症、骨髓及外周血干细胞移植以及原发性慢性粒细胞减少症的胃肠外制剂类药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种柱层析粒细胞集落刺激因子氮端定点偶联聚乙二醇的方法，其中所述偶联方法中1)层析介质优选阳离子交换介质；2)层析柱柱床高度优选推荐柱高的上限；3)rhG-CSF蛋白的上样量优选为介质实测最大载量的30-50％；4)以较低的上样流速、较长的上样时间(3～5小时)、较高反应率的pH值上样活化的mPEG；5)活化的mPEG的上样量按活化的mPEG与rhG-CSF的反应量比为1～50mol∶1mol进行；6)以0.5M～1M氯化钠盐溶液梯度洗脱。本发明还公开了所述方法制得的偶联化合物，即聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子，其结构式为CH₃-(CH₂CH₂-O)n-(CH₂)r-NH-rhG-CSF或CH₃-(CH₂-CH₂-O)n-(CH₂)r-NH-rhG-CSFm，式中n为570～2200，r为1～3；以及所述偶联化合物作为制备防治粒细胞减少症制剂的应用。文档编号C07K14/435GK101585864SQ200910013710公开日2009年11月25日申请日期2009年1月5日优先权日2009年1月5日发明者旋张,祁庆生,苏志国,雷建都,马光辉申请人:天津派格生物技术有限公司;中国科学院过程工程研究所