用自由态mpl受体刺激血小板产生的组合物和方法

专利名称：用自由态mpl受体刺激血小板产生的组合物和方法
技术领域：
本发明关于细胞的刺激与生长，特别是指巨核细胞和血小板，尤其是关于所谓的MPL受体作为巨核细胞分化成血小板的诱导物的用途。本发明也涉及能在活体内引起血小板产生的组合物。
背景技术：
本发明至少包含两个宽广的研究领域，首先是与血小板从巨核细胞的发育与产生有关，第二则与生长因子受体家族本文称作为MPL受体的多肽成员有关。这些领域的各研究将在下文中予以概述。A.血小板由巨核细胞产生血小板是循环细胞，它对阻碍血液流出及促成血液凝结很重要。巨核细胞是血小板的细胞来源，它由共同的骨髓前体细胞所发生，此骨髓前体细胞可产生所有造血细胞系统。此共同的前体细胞被称为多能干细胞或PPSC。
目前对于巨核细胞起源细胞的等级划分已可依出现的时间和在活体外培养系统中受到适当生长因子刺激所形成的巨核细胞(MK)群落大小而定。巨核细胞爆裂形成单位(BFU-MK)是最原始巨核细胞的起源细胞，BFU-MK被认为是最主要产生多数的集落形成单位的巨核细胞(CFU-MK)，它是较为分化的MK起源细胞。
当MK经过后来的分化，造成MK细胞失去有丝分裂的能力，但是得到细胞内再复制的能力。胞内再复制是细胞不分裂的情形下所进行的细胞核分裂，胞内再复制最后造成MK成为多倍体。当MK更为成熟时可导致作为血小板特征的细胞质内胞器和细胞膜组成的获得。
血小板经由一尚未完全明了的过程从成熟的MK所产生，此等过程可能是MK物理性断裂或其它机制的结果。对巨核细胞内广泛膜层结构的观察导致对血小板之形成模式有所了解，它是在细胞内据以界定的膜层系统形成初期的血小板。血小板形成的另一模式已经发展出来，系因观察到巨核细胞形成长的细胞质突起，其收缩成血小板大小的间隔，骨髓内及/或肺中的血液流动压力可能造成MK长细胞质在间隔处断裂。这些细胞质突起被Becker及DeBruyn命名为血小板前体，以反映他们在血小板形成过程中可能的前体角色。参见Becker and DeBruyn，Amer.J.Anat.145183(1976)。


图1显示在巨核细胞和血小板发育中所涉及的各种前体细胞，在图最左边的细胞可认为是PPSC，在PPSC右边的细胞可认为是BFU-MK，接下来是CFU-MK。在图中紧邻PPSC右边的细胞正进行胞内有丝分裂，它是一成熟的巨核细胞，由于胞内有丝分裂的结果，此细胞已成为多倍体。其右边下一个结构包括由成熟巨核细胞多倍体核所形成的长细胞质突起，其收缩成血小板大小的间隔。在图最右边显示数个血小板，其经由前一个巨核细胞之细胞质突起形成断裂而产生。
以下是一些以前发表的与巨核细胞成熟及血小板产生有关的文献概要1.Williams，N.and Levine，R.F.，British Journal of Haematology 52173-180(1982).2.Levin，J.，Molecular Biology and Differentiation of Megakaryocytes，pub.Wiley-Liss，Inc.1-10(1990).3.Gewirtz，A.M.，The Biology of Hematopoiesis，pub.Wiley-Liss，Inc.123-132(1990).4.Han，Z.C.，et al.，Inc.J.Hematol.543-14(1991).5.Nieuwenhuis，H.K.and Sixma，J.，New Eng.J.of Med.3271812-1813(1992).6.Long，M.，Stem Cells 1133-40(1993).B.血小板形成的调节许多实验室的数据皆指出血小板产生是由体液因子所调节，早期并不知道此生物过程的复杂性，至今已知数种人类生长因子可能具有此能力。
巨核细胞的调节发生在多重细胞层次，数种细胞因子、细胞增殖因子、可借由扩充起源细胞储池而加强血小板产生。第二组体液生长因子用作成熟因子，作用在较分化的细胞上以促进胞内再复制。此外，有两种独立的生物反馈循环以调节这些过程。
数种对细胞谱系非专一性的造血生长因子对MK之成熟有重要的影响。颗粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、白介素-11(IL-11)、白血病抑制因子(LIF)及红细胞生成素(EPO)每一项皆可个别地在体外促进人类MK之成熟，它们影响MK的大小、数目或染色体倍数。白血病抑制因子、白介素-6及白介素-11对MK成熟的影响在和白介素-3对MK成熟影响关系是部份(如白血病抑制因子和白介素-6)或是全部如白介素-11)加成的。如此数据显示在活体中，细胞因子的组合可能对于促进MK成熟是必需的。
以下是一些以前发表的与巨核细胞调节及血小板产生有关的文献概要7.Hoffman，R.et al.，Blood Cells 1375-86(1987).8.Murphy，M.J.，Hematology/Oncology Clinics of North America 3(3)465-478(1988).9.Hoffman，R.，Blood 74(4)1196-1212(1989).10.Mazur，E.M.and Cohen，J.L.，Clin.Pharmacol.Ther.，46(3)250-256(1989).11.Gewirtz，A.M.and Calabretta，B.，Int.J.Cell Cloning 8267-276(1990).12.Williams，N.，Progress in Growth Factor Research 281-95(1990).13.Gordon，M.S.and Hoffman，R.，Blood 80(2)302-307(1992).14.Hunt，P.et al.，Exp.Hematol.21372-281(1993).15.Hunt，P.et al.，Exp.Hematol.211295-1304(1993).C.MPL受体骨髓增殖白血病病毒(MPLV)是鼠类的一种具有复制缺陷的逆转录病毒，它可造成被感染的哺乳动物发生急性白血病。目前已发现，MPLV表达基因包括编码逆转录病毒外壳(或蛋白质外壳)的基因一部份，此基因与细胞因子受体家族包括GM-CSF、G-CSF和EPO相关序列相融合。
以上所描述MPLV基因的表达有一种有趣的生物特性，即可使鼠类各种不同起源细胞在增殖及末期成熟方面不受生长因子的影响。此外，一些被MPLV急性转化的骨髓细胞培养物含有巨核细胞，显示MPLV基因与巨核细胞的成长和分化之间有一关连。
目前已知在哺乳动物中有一MPLV病毒基因(称作v-MPL)之同源基因，称为细胞MPL基因(或c-MPL)。利用v-MPL所衍生的探针，可以将相应的人类c-MPL基因的cDNA克隆出来。参照PCT已公告的专利申请WO 92/07074(1992年4月30日公告；在后文中讨论)。序列分析已显示由c-MPL基因编码的蛋白产物是属于高度保守之细胞因子受体超家族，正象同源性的v-MPL基因产物一样。
基于用Northern印迹分析，发现正常小鼠骨髓，脾脏及其胎儿肝脏中，皆可观察到它的表达，但在其它组织中则不能，因为这细胞基因c-MPL被认为在造血过程中起功能性的作用。特别的是，c-MPL在巨核细胞上也表达，它显示出人类细胞基因，人的c-MPL可在纯化且可表达CD34抗原的巨核细胞、血小板和其它细胞中表达，此点为早期造血起源细胞之指标。此外，当具有CD34之细胞暴露在合成的寡脱氧核苷酸下，且此等寡聚脱氧核苷酸对c-MPL mRNA或信息为反义者时，将使巨核细胞起源者CFU-MK之集落形成能力明显的被抑制，但是对于红血球或颗粒巨噬细胞之起源者并无影响。
总言之，由以上数据和观察可知c-MPL编码的蛋白质可能为细胞因子受体，该细胞因子专一地调节巨核细胞之生成，换言之，c-MPL可以编码一细胞表面受体，本文中称为MPL受体，其可与可活化受体的配基相结合，并可能导致巨核细胞之产生。
PCT专利公告WO 92/07074是关于人类及鼠类的c-MPL基因所编码的蛋白质序列，这基因产物如上文中所述被认为是一受体，其至少是由三个区域或结构域(domain)组合而成，包括一细胞外结构域、一跨膜结构域及一细胞内(或细胞质)的结构域。当这些区域互相接合时，它们即可组成一完整的MPL受体。此PCT公告也提及一可溶形式的受体，此受体实质上相当于成熟MPL蛋白质的细胞外结构域。此蛋白质的细胞内结构域含有一疏水区位，当其通过跨膜区与此蛋白质的细胞外结构域相接触时，即造成此蛋白质整体集结及不溶解。在另一方面，当c-MPL基因产物细胞外区域与穿膜区域及细胞内区域分离时，它即为可溶的，因此，此蛋白质细胞外形式称为受体的“可溶”形式。
有为数不少的研究人员正在进行可与c-MPL受体专一结合的配体之分离及鉴定，目前预期此配体将可刺激成熟的巨核细胞及(或)血小板之产生，然而至今尚无人报告有关于此配体之纯化或最终结构。在另一方面，根据先前所发表有关MPL受体(即完整的c-MPL基因产物)的文献，可预期MPL受体的可溶形式会与循环自由态的MPL配体相结合，而可抑制巨核细胞及(或)血小板之形成。
以下是一些与v-MPL及c-MPL受体及基因有关的以前的文献概要16.Wendling，F.，et al.，Leukemia 3(7)475-480(1989).17.Wendling，F.，et al.，Blood 73(5)1161-1167(1989).18.Souyri，M.，et al.，Cell 631137-1147(1990).19.Vigon，I.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895640-5644(1992).20.Skoda，R.C.，et al.，The EMBO Journal 12(7)2645-2653(1993).21.Ogawa，M.Bolld 81(11)2844-2853(1993).22.Methia，N.，et al.，Blood 82(5)1359-1401(1993).23.Wendling，F，et al.，Blood 80246a(1993).D.对能刺激血小板生成之物质的需要最近已有报告指出，在北美、西欧和日本之医学中心对于输血用血小板之使用有增加之趋势，参阅Gordon，M.S.and Hoffman，R.，Blood 80(2)302-307(1992)。血小板用量的增加可归因于医学技术的进步及心脏外科及骨髓、心脏和肝脏移植等技术之大幅进展。此外，对于癌症病人及HIV-1流行病以剂量加重作为解救的治疗手段，也造成对于血小板的需求大增。
使用血小板可能造成以血液为媒介的传染病传播和异源免疫等问题。此外，生产纯化过的血小板需昂贵的花费，因此使用血小板将使得整体医疗费用增高，因此对于一种新的及改良过的方法来生产人类所需的血小板是有急切需要的。
以下将描述先前对于增进血小板产生的研究范例。
美国专利5,032,396报告白介素-7(IL-7)能够刺激血小板的产生。白介素-7也称为淋巴细胞形成素-1，是-种淋巴细胞生长因子，能够在骨髓中刺激B和T细胞前体细胞的生长。已公告的PCT申请序号88/03747，其申请日期1988年10月19日及欧洲专利申请序号88309977.2，其申请日期1988年10月24日，揭示利用重组DNA技术以DNA、载体及有关方法来产生哺乳动物白介素-7蛋白质。该美国专利中之数据显示，白介素-7能在正常且以低于致死量照射的老鼠体内增加循环血小板的量。
美国专利5,087,448发现当以白介素-6处理哺乳动物，可刺激其体内巨核细胞和血小板之增殖。人类重组白介素-6是一具有多种生物活性的糖蛋白，其分子量为26,000。该专利中之数据显示在活体外，白介素-6具有增加巨核细胞集落之功效。
以上所引用的专利皆无提及任何有关于MPL受体之叙述，MPL受体是本发明所论及者。
尽管有以上的发现，但人们对于哺乳动物体内的巨核细胞和血小板新颖刺激物仍然有强烈需求。
发明概述本发明的目的是提供一种刺激巨核细胞和血小板在需此处理之哺乳动物体内生成的方法。
本发明的另一目的是提供一种治疗哺乳动物血小板缺乏症的方法，例如需此治疗之人类。
本发明的另一目的是提供一种治疗哺乳动物(如人类)血小板缺乏症的组合物。
有关本发明这些和其它的目的将在下文中详尽描述，本项发明之发明人发现当给与哺乳动物自由态的MPL受体(稍后定义)将使得此哺乳动物体内血小板数目增加。本发明也提供用于诱导血小板产生之组合物，此组合物包括有效量的自由态MPL受体配合一种或多种药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂以制成用于诱发和增强哺乳动物体内血小板产生之药剂组合物。
附图简述由附图中可以清楚地明了本发明的许多特性及优点，其中图1描述巨核细胞和血小板发展与成熟之总览。
图2显示MPL-P(人类)和Mpl(鼠类)区域概要的比较，此外对于一种例示之可溶性受体(Mpl-S)亦作概要描述。
图3数据证明在巨核细胞培养物中添加可溶性受体(MPL-X)可强化血小板前体形成之发展。
图4数据显示在小鼠模型中，MPL-X在活体中对血小板数目之影响。
图5数据显示在小鼠模型中，MPL-X在活体中对白细胞(WBC)数据之影响。
图6数据显示在小鼠模型中，MPL-X在活体中对红细胞(RBC)数目之影响。
发明详述本领域的技术人员将可由下列详述明了本发明的其它方面及其优点，下列描述详细说明了本发明的实际应用。
本发明是奠基于一意想不到的发现上，此发现为自由态MPL受体可刺激血小板在哺乳动物体内增加数目。目前相信它是由于增加巨核细胞形成片段的速率来加速血小板产生。然而根据先前的了解，MPL受体可能与巨核细胞形成过程有一些关连，此项技术中之了解为当受体与巨核细胞结合时，它需要配体的刺激以使巨核细胞成熟及(或)产生血小板。根据以上的假说有理由地推测MPL受体系不附着在细胞表面(即自由态的MPL受体)，而是与结合在细胞上的MPL受体竞争配体，因此移除了正常状况下可刺激细胞产生巨核细胞和血小板之配体，其最后影响是只有少数细胞进行巨核细胞和血小板之产生。
然而本发明人发现了的与上述所推测的结果是相反的，他观察到在哺乳动物体内给予自由态的MPL受体的实验有增加巨核细胞和血小板的产生的影响。
为避免被特定机制或作用理论束缚，本发明人已设定一假说以解释此处所述的影响。此假说认为配体通常可刺激结合着的MPL受体而使较不成熟的细胞(如PPSC、BFU-MK、CFU-MK)产生成熟的巨核细胞，但是一旦这些成熟的巨核细胞被产生，它为了形成血小板前体，此配体必需被移开。如果此配体不从成熟的巨核细胞移开，此成熟的巨核细胞则仍然保有成熟型式而不会产生血小板。
利用以上的假说做为模型，自由态的MPL受体的施用将可使成熟的巨核细胞进一步形成血小板前体再断裂成血小板。同时，MPL配体被自由态的MPL受体加以移开，也可能抑制再形成额外的成熟巨核细胞。如果这假说的模型是正确的，则可以说，当同时给予配体及自由态的MPL受体时，将可促成较大的血小板生成量，因为它将增加成熟巨核细胞的产生及刺激成熟的巨核细胞产生血小板。先给予配体再给予自由态的MPL受体可能更进一步增进此效果。总之在考量先前的血小板形成及MPL受体/配体活性的模式下，本发明人相信此种发现完全不是先前所推测的。
定义以下的定义将解释本专利申请中之关键名词及术语的意义。
“血小板数目增加”意指血小板的数目是显著的增加并超过特定实验动物之正常血小板范围，血小板数目增加可能以视时间而定的形式发生，并可能是具循环性的，先增加再恒定或减少，或一直恒定的等等。
举例而言，参考图4，它至少出现三个血小板数目增加的循环，第一个循环发生大约在7-8天时，第二个及更增强的循环发生大约在19到20天之间，第三个及更增强的循环发生在大约在28至29天之间。这些循环发生在特定模式系统下的数只小鼠上，在其它的哺乳动物系统或模型则可能或不能再现。
血小板数目增加优选至少高于正常范围平均值40-50％，但可更高，如可高于血小板正常平均数目的两倍。应该记住在特定条件下血小板数目明显的增加，像是5-10％，在临床上即已足够。血小板数目增加是所给予之自由态MPL受体至哺乳动物体中的剂量(此乃其他参数中之一项)之函数，因此可以在一大范围内作修正。
血小板的数目可以用各种标准的方法来测定，例如可用已商品化的血球记数器来测定。此类仪器是以粒子大小来做为“计算”颗粒数和细胞分型之依据。像是Sysmex或Coulter Counter等仪器。此类方法的讨论可参阅Bloom，A.L.和Thomas，D.P.(eds.)，Haemostasis andThrombosis(Second Edition) Churchill Livingstone936(1987)。
被处理的“哺乳动物”没有特别限制，但以人较佳。其它可能被处理的哺乳动物包括狗、猫、牛、马等等。跨种活性(即一种动物的MPL受体也在另一种动物中表现活性)也是可预期的，特别是当两不同种动物的MPL受体有高的同源性(如80％或以上)时，这也是本发明的另一方面。举例而言，小鼠的自由态MPL受体能够用在人类身上以增加血小板数目。然而，为了获得最高的活性还是以相同种的MPL受体治疗该种动物。
“给药”可以用任何便利的方法实行。例如以丸剂注射、持续性注入、由植入物持续释出或是其它适合的技术实行之。静脉给药是较佳的方法。自由态MPL受体的多重给药也是可实行的。
“增加血小板数目的有效剂量”是指足以在特定的哺乳动物体内显著提高血小板数目的剂量。如果需要或想要，可以在预备试验中决定一适当量，而不需要过多之试验，此量依所治疗之哺乳动物所需增加的程度而定。一般每天每公斤的体重给予1微克至100微克之剂量，较佳的剂量是每天每公斤的体重给予10微克到100微克，在1到20天之后可预期诱导治疗上显著的生物效应。自由态的MPL受体可以在停用一天或更多天后，每天给药并持续一段时间。较佳的剂量是在三天间隔下每天每公斤的体重给予丸剂注射10微克的剂量以做为血小板产生的刺激物。
除自由态MPL受体以外，可以同时地或连续地与本发明MPL受体配合，使用一种或多种的淋巴因子或细胞因子。此等淋巴因子及(或)细胞因子为；白介素-1α(IL-1 alpha)、白介素-1β(IL-1beta)、白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-11(IL-11)、集落刺激因子-1(CSF-1)、颗粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、颗粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、红细胞生成素(EPO)、干扰素-α(INF-alpha)、干扰素-β(INF-beta)干扰素，或γ(INF-gamma)干扰素。当有MPL配体可供利用时，其亦可包括在其中。任何这些成份可能与自由态的MPL受体有加成或协同作用。
“自由态MPL受体”是指MPL受体分子不受一般细胞组成，特别是细胞膜的束缚。最好是，把自由态MPL受体称作为受体“可溶的”形式。MPL受体“可溶的”形式可能是本领域那些技术人员所熟知的或以后要发展的这种形式。通常受体可溶的形式基本上缺乏受体分子之跨膜区域。
已知MPL受体之跨膜区域为极疏水性的，因此本发明的目的，最好是要将MPL受体上的所有疏水性穿膜区域移去。虽然不认为MPL受体细胞内区域是不可溶解性，但为本发明的目的，最好仍将此区域也从MPL受体移去。
概言之，“可溶的”是指不受细胞所束缚的物质，且最好不要包括(即少于10个残基)全长分子的跨膜区域或细胞内区域。可溶的MPL受体(即本文中所提及的MPL-X)能溶解在水性溶液及体液中，如血液、血清、唾液、脑脊髓液、尿液等。也可能利用MPL受体细胞外区域，其系直接地附在此受体细胞内区域上。这里所指的“MPL受体”词最好是指此受体的细胞形式(即c-MPL基因产物)，而不是由病毒所衍生出来的形式(即v-MPL)。
在1992年4月30公告的PCT申请WO 92/07074中对于完整的MPL受体及其组成区域有详尽的描述。有关鼠类MPL受体的详细资料可以在Wigon，et al.，EMBO 82607-2615(1993)中找到。此外，序列编号1和2分别表示鼠类MPL受体基因和蛋白质之全长序列，而序列编号3和4分别表示人类MPL受体基因和蛋白质之全长序列。
鼠类序列(序列编号2)中之该区域如下信号肽 aa 1(Met)至 aa 18 (Ser)细胞外的 aa 19 (Gln)至 aa 483 (Trp)跨膜 aa 484 (Ile)至 aa 505 (Leu)细胞质的 aa 506 (Lys)至 aa 626 (Pro)再次参照鼠类序列(序列编号2)，一些优选的可溶序列是aa 19 (±10aa) 至 aa 483 (±10aa)，和aa 19 (±10aa) 至 aa 484 (±10aa)，其与aa 506 (±10aa) 至 aa 626 (±10aa)融合。
目前已知人类序列至少有MPL-P及MPL-K两种形式。在序列编号3和4中分别显示P型的氨基酸和基因序列。人类MPL-P序列中的该区域如下信号肽 aa 1 (Met) 至 aa 25 (Ser)细胞外的 aa 26 (Gln) 至 aa 491 (Trp)跨膜 aa 492 (Ile) 至 aa 513 (Leu)细胞质的 aa 514 (Arg) 至 aa 635 (Pro)参照人类序列(序列编号4)，一些较佳的可溶序列是aa 19 (±10aa) 至 aa 483 (±10aa)，和aa 19 (±10aa) 至 aa 484 (±10aa)，其与aa 506 (±10aa) 至 aa 626 (±10aa)融合。
参阅图2，其中描述一可溶形式受体(MPL-S)之例子。可能从人类或鼠类序列上移去细胞因子受体区域II(CRDII)的很大部份区域，但仍然保有增强血小板生成活性的受体可溶形式。因此现在本发明人亦计划利用已从MPL受体区域上移去所有细胞因子受体区域II的可溶性受体，来增强病人的血小板生成。
以上文中所例示，基于已知的MPL序列，以及此研究领域先前发表的文献或例行实验，具普通技术之人士都可以轻易得到自由态鼠类或人类MPL受体家族以供本发明在这方面的使用。
前述蛋白质的各样生物活性类似物也能应用在本发明的方法及组合物中。因此本文所使用的“MPL受体”一词包括一些蛋白质，其具有与天然哺乳动物MPL受体大体上相同的氨基酸序列，以及在品质上具有相当的生物活性，例如以标准的生物分析法(如类似蛋白质之受体结合亲和性分析法或抗体结合亲和性分析法)的结果。本发明自由态的MPL受体类似物最好是以此蛋白质的可溶形式做为基础。MPL受体可能更进一步成为复合形式，或与其它细胞因子蛋白质或其片段融合，例如白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、白介素-11(IL-11)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、红细胞生成素(EPO)等等。
本发明产生哺乳动物MPL受体之优选方法涉及在哺乳动物细胞中的重组体表达，尽管这些蛋白质也能利用昆虫细胞、酵母、细菌或其它在适当启动子控制下的细胞中以重组体方式制得。在Powels等人所著的Cloning VectorsA Laboratory Manual(Elsevier New York，1985)中描述了可用细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主供作适当的克隆及表达载体之用。各种哺乳动物细胞培养系统皆可用于表达重组蛋白质。
哺乳动物细胞表面系统的例子包括猴子肾脏成纤维细胞的COS-7细胞株(Gluzman，Cell 23175(1981))，及其它可表达相容载体的细胞株，像是C127、3T3、CHO、293、Hela及BHK细胞株。哺乳动物表达载体可能包含数种非转录元件，像是复制起点、适合的启动子和增强子及其它5’端或3’端两侧的非转录序列，像是必需之核糖体结合位点；多聚腺嘌呤位点；供体和受体的剪接序列；及终止序列。自SV40病毒基因组衍生的DNA序列，例如，SV40复制起点、早期启动子、增强子剪接以及多聚腺嘌呤位点，可用于提供异源DNA序列表达所需之遗传元件。以下提供关于利用哺乳动物高度表现载体以产生重组哺乳动物MPL受体之详述。目前已有数种能被构建的载体(Okayama and Berg，Mol.Cell.Biol.3280(1983)；Cosman et al.，Nature 312768(1984)；Cosman et al.，Mol.Immunol.23035(1986)；及Clark et al.，美国专利4,675,285)。
可用本发明方法及组合物治疗的病况通常涉及既存在着的血小板不足症或预期未来将会有血小板不足(像是起因于预定的外科手术)。血小板不足的一般性名词是血小板减少症(thrombocytopenia)，因此本发明方法及组合物一般适用于治疗血小板减少症。
血小板减少症(血小板不足)有诸多成因，包括化学治疗、放射线治疗、外科手术、意外事件血液流失及其它特定的疾病。特定的疾病范例包含血小板减少症以及可以根据本发明来治疗的疾病，包括形成再生障碍性贫血、自发性血小板减少症以及会造成血小板减少症的转移性肿瘤。一些AIDS治疗法也会造成血小板减少症(例如使用AZT)。血小板数目的增加对于一些伤口愈合异常亦有帮助。
对于预期的血小板不足，例如由于预定外科手术的情况，可在需要血小板之前的数天以数小时给予MPL受体。至于紧急的状况，如意外事件和大量血液流失，可随着血液或纯化过的血小板给予MPL受体。
给予的自由态MPL受体特定剂量将受到一些参数影响，包括体重、性别、年龄、接受治疗的病患者之一般状况；被治疗之病况的本质、给药方式、状况之紧急程度以及其它参数。在紧急状况时，给药剂量一般高于慢性状况或较轻的血小板不足病况。
本发明组合物包括“药学上可接受的载剂”，自由态受体于其中为可溶的。载剂材料可为水以供注射，较佳能补充其它通用于投予哺乳动物之溶液。MPL受体的典型治疗是以组合物方式行之，包括已纯化之蛋白质配合生理上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。中性的缓冲食盐水或食盐水与血清白蛋白的混合液皆是规范而适合的稀释液。产品最好是制成冷冻干燥制剂，并以适合的赋形剂溶液(如蔗糖溶液)做为稀释液。若需要亦可加入其它标准载剂、稀释剂及赋形剂。4实例以下的例子将对本发明做更详尽之说明。此外，这些例子提供本发明较佳的具体实例。除非特别指出，否则并不是去限制本发明的范围。下列实例中所描述的许多实验的标准方法，或是适当的替代程序，皆在熟知的分子生物学手册中提及，如Sambrooket al.，“Molecular Cloning，”Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1987)及Ausubel etal.，(Eds)，“Current Protocols in Molecular Biology，”Greeneassociates/Wiley Interscience，New York(1990)。
实例1编码MPL受体的核酸序列之分离编码鼠类(Vigon et al.，Oncogene 82607-2615(1993))及(Skoda et al.，EMBO)12(7)2645-2653(1993))及人类(Vigonet al.，DNAS 895640-5644(1992))同型MPL受体之克隆株的分离已经被发表。这些DNA序列可从GenBank资料库中获得，鼠类受体之代码为X73677和222657，人类受体K，P两型之代码分别为M90102及M90103。目前已有报告指出，在脾脏、骨髓、胎盘及胎儿肝脏等组织中皆可表达MPL之mRNA。表达MPL的细胞株包括HEL。因此，熟知此技术之人士清楚知道如何分离编码MPL之基因。其cDNA可从上述组织来源或细胞株或从其它来源产生，利用RNA Northern(北方)印迹分析法或蛋白质Westerm(西方)印迹分析法来确认该等来源中有MPL之表达。
这个cDNA用作在合适载体上生成cDNA文库的材料来源。这基因库可利用核酸探针杂交的方法加以筛选，以确认细胞含有MPL基因。此外亦可利用抗体从cDNA基因库来筛选，MPL之表达。此抗体是针对一个相当于MPL序列所合成寡聚肽而产生。
此cDNA亦可作为MPL基因PCR扩增之模板。引物是从MPL基因之序列中选择，也可包含有助于MPL之克隆和表达的其他序列。
实例2表达可溶性鼠类MPL的克隆株之分离使用上述确认含MPL之克隆株，或是由能够表达MPL的来源所得到之cDNA，经由PCR技术而得到可表达可溶性MPL之克隆株。用于鼠类MPL PCR放大的引物，可能为以下形式5’端引物TAC AAG CTT GCC GTC ATC ATG CCC TCT TGGGCC CTC(序列编号5)；及3’端引物ACT TCT AGA CTA TCA AGC AGT CTC GGA GCTGGA(序列编号6)PCR反应包括以下各成份1微升的cDNA反应混合物、上述各种寡核苷酸分别含有5皮摩尔、10毫摩尔浓度的Tris-HCl(pH8.3)、50毫摩尔浓度的氯化钾、1.5毫摩尔浓度的氯化镁、各种dNTP分别含有200微摩尔浓度及1单位的Taq聚合酶。DNA扩增是设定94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟，共计35个循环。之后，DNA以琼脂糖凝胶电泳纯化，并以限制性内切酶HindIII及XbaI进行酶解，之后与用限制酶HindIII及XbaI进行酶解过的表达载体pDSRα2连接，以DNA序列分析确认有所期望插入片段之克隆株。
实例3可溶性鼠类MPL在CHO细胞中之表达表达质粒pDSRα2-MPL-MPL-X含有鼠类MPL氨基酸序列之编码序列，其显示在序列编号7和8中。利用磷酸钙所媒介的转染将10微克的质粒导入CHO细胞(Vigler et al.，Cell 11233(1979))。根据载体中的二氢叶酸还原酶基因的表达选择单独细胞集落可溶性MPL之表达由RNA杂交法(Hunt et al.，Exp.Hematol，19779(1991))和Western印迹分析法进行监测，Western印迹分析法是用序列编号2氨基酸459(Gly)到475(Val)之合成肽为抗原而产生的抗体来进行。细胞株B.1-18在此分析中是正反应并被选作进一步的扩增。此细胞株以30纳摩尔的氨甲喋呤(Mtx)驯化以刺激MPL表达之放大。实验在滚桶瓶中以2×107细胞量接种在200毫升的DMEM中，其内容有已补充非必需氨基酸(NEAA)的Ham’s F12(1∶1)、30nM的氨甲蝶呤及5％的胎牛血清(FBS)(试剂来自GIBCO，Grand Island，NY)。当培养3-4天细胞长满时，用培养基以200毫升DMEM予以置换其内含有Ham’s F12、非必需氨基酸、30nM的氨甲蝶呤，无血清。6-7天后收获此条件培养基，并以新鲜不含血清的培养基置换。同样地收集第二次和第三次之培养基。
实例4可溶性鼠类MPL之纯化鼠类MPL基因产物(m-MPL-X)的重组细胞外区域经由连续离子交换及羟基磷灰石色谱分析由CHO细胞条件培养基中加以纯化。含m-MPL-X之条件培养基经由30,000MW阻截(cutoff)滤膜(S10Y30，Amicon，Danvers，MA)超过滤浓缩10倍，并以10毫摩尔浓度的Tris-HCl，pH8.5透析。之后将浓缩液加注至Q-Sepharose柱，快速流过(Pharmacia，Piscataway，NJ)，再以10毫摩尔浓度的Tris-HCl，pH8.5清洗，之后以含0摩尔浓度-1.0摩尔浓度氯化钠的Tris-HCl缓冲溶液，进行线性梯度洗脱。由柱洗脱所得分部部份是以SDS-PAGE及利用对纯化m-MPL-X的抗血清的Western(西方)印迹法进行分析m-MPL-X，之后将含有m-MPL-X之分部部份合并，以10毫摩尔浓度之磷酸钠、0.01毫摩尔浓度氯化钙，pH6.8进行透析，之后再上羟基磷灰石柱(HA-Ultragel，Sepracor，Malborough，MA)。未结合之分部部份内含纯化过m-MPL-X，用PBS稀释，进行无菌过滤，再无菌调配成适当体积，使其保持最终浓度为0.10毫克/毫升。在使用之前，此纯化过的m-MPL-X保存在-80℃。
用鲎变形细胞溶解物分析(Associates of Cape Cod，Inc.，Woods Hole，MA)，其最终产物显示出不含有致热原(pyrogen＜0.004单位/毫克)。利用SDS-PAGE并用Coomassie染色来分析20微克已纯化的m-MPL-X，结果显示有单一条带出现，其分子量为64KD，且没有其它蛋白质条带被检测到。
实例5MPL-X对血小板前体形成的影响豚鼠巨核细胞经过纯化，并以每一孔穴含5000个细胞(于具有96个孔穴的微量浓度测定板)且在有或没有MPL-X(30微克/毫升；其制备如上所述)条件下，培养18小时。其利用Iscove’s培养基做为基础培养基，并补充BSA(100微克/毫升)或是10％已用肝素化的正常人血浆(由AB供给者而来)。培养之后，根据Hunt等人所描述的方法进行细胞镜检并且记录血小板前体之形成，参阅Hunt，P.et al.，Exp，Hematol.21372-281(1993)及Hunt，P.et al.，Exp.Hematol.211295-1304(1993)。数据以二次重复测定之平均值的+/-平均值标准误差(SEM)来表示。
豚鼠巨核细胞培养在不含血清的培养基中或是用肝素化的血浆中，结果显示，在培养18小时后，血小板前体即形成，参阅Hunt，P.et al.，Exp，Hematol.21372-281(1993)及Hunt，P.et al.，Exp.Hematol.211295-1304(1993)。如图3所示，添加MPL-X到巨核细胞培养物中造成正在发育血小板前体形成之细胞数目显著增加。此现象在不含血清条件下的或是有用肝素化过的血浆的培养中皆可观察到。
实例6MPL-X对活体中血小板前体形成的影响MPL-X稀释成100微克/毫升或10微克/毫升后与载剂)PBS加上0.2％的正常Balb/c小鼠血清)混合。此外，100微克/毫升的牛血清白蛋白(BSA)或是热钝化的MPL-X(98℃，15分钟)亦被使用。实验所用的Balb/c小鼠(雌性，6-8周龄，Charles River)在每8小时间隔下，经皮下注射每种试验溶液0.5毫升，每天两次，持续到第42天。在指定之日期，以手术刀由动物侧面尾部将静脉切开小口进行放血，收集20微升的血液并立刻以厂商提供之稀释液稀释，以利用Sysmex细胞分析仪(TOA Medical Electronics，Kobe，Japan)进行分析。得到白细胞(WBC)、红细胞(RBC)及血小板之数目。数据系以所示样品数目的平均值+/-SEM来表示。
为了直接决定MPL-X对血小板量的影响，把蛋白质以每天两次注入正常的Balb/c小鼠体内。将两组独立实验之数据结合以供发表。在实验1中，每组5只小鼠在含有或不含有载剂下，以MPL-X10微克/天或100微克/天持续注射42天。在实验2中，每组4只小鼠在含有或不含有载剂下，以MPL-X100微克/天、热钝化的MPL-X100微克/天或BSA100微克/天持续注射29天。不论何时，两组实验数据皆以相同的时间点收集，之后结合两组实验数据进行数据分析(N＝9，第0，4，7，11，18天；N＝4或5，所有的其它天)。如图4所示，以MPL-X100微克/天注射，造成血小板数目显著增加。在处理4-7天后，首度观察到其功效，血小板数目到达正常值的132％。虽然第11天时血小板数目恢复到正常，但如果继续给予MPL-X，血小板数目又再度升高并达到正常值的219％。在治疗20天之后，血小板数目降回至正常值的150％。当此研究在第42天结束时，血小板数目仍然为正常值的130％。同样如图4所示，给予MPL-X10微克/天、BSA100微克/天或热钝化的MPL-X100微克/天对血小板数目皆无影响。给予MPL-X对其它血球参数皆无影响。图5和图6说明白细胞和红细胞数目的数据。
数据指出当于活体中给予MPL-X可造成循环血小板显著地增加。此反应呈现大约7-10天的周期性。在实验中所采取的任何时间点上，没有其它的血球参数被影响。
***上文中已对本发明作一般性描述及以具体实例来描述，应知熟悉此项技术者可根据上列描述进行各种变化及修饰。因此，本案申请专利范围涵盖属于本发明所申请范围之所有该等变化。
此外，在上文中所引用的文献和其它材料皆在说明本发明的背景，而在特定的情况下系提供有关它实际运作之细节，均并入本文中作为参考资料。
序列目录(1)一般资料(i)申请人Choi，Esther S.
Hokom，Martha M.
Hunt，PamelaNichol.Janet L.
(ii)发明名称刺激血小板产生之组合物及方法(iii)序列数目8(vi)通讯地址(A)地址Amgen Inc.，U.S.Patent Operations/RRC(B)街道1840 DeHavilland Drive(C)城市Thousand Osks(D)州名CA(E)邮递区号91320-1789(v)电脑可读取的形式(A)介质型式软盘(B)电脑可与IBM PC相容(C)操作系统PC-DOS、MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，#1.25版(vi)目前申请资料(A)申请号码(B)申请日期(C)分类(ix)电讯通信资料(A)电话805-447-4955(2)序列编号1资料(i)序列特性(A)长度2046个碱基对(B)型式核酸(C)链型未知(D)拓扑学未知(ii)分子型式cDNA
(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置8..1888(xi)序列描述序列编号1CCTCTTC ATG GTC ACC TCC TGC CTC CTC TTG GCC CTT CCA AAC CAG GCA 49Met Val Thr Ser Cys Leu Leu Leu Ala Leu Pro Asn Gln Ala1 5 10CAA GTC ACC AGC CAA GAT GTC TTC TTG CTG GCC TTG GGC ACA GAG CCC 97Gln Val Thr Ser Gln Asp Val Phe Leu Leu Ala Leu Gly Thr Glu Pro15 20 25 30CTG AAC TGC TTC TCC CAA ACA TTT GAG GAC CTC ACC TGC TTC TGG GAT 145Leu Asn Cys Phe Ser Gln Thr Phe Glu Asp Leu Thr Cys Phe Trp Asp35 40 45GAG GAA GAG GCA GCA ccc AGT GGG ACA TAC CAG CTG CTG TAT GCC TAC 193Glu Glu Glu Ala Ala Pro Ser Gly Thr Tyr Gln Leu Leu Tyr Ala Tyr50 55 60CGA GGA GAG AAG CCC CGT GCA TGC CCC CTG TAT TCC CAG AGT GTG CCC 241Arg Gly Glu Lys Pro Arg Ala Cys Pro Leu Tyr Ser Gln Ser Val Pro65 70 75ACC TTT GGA ACC CGG TAT GTG TGC CAG TTT CCA GCC CAG GTA GAA GTG 289Thr Phe Gly Thr Arg Tyr Val Cys Gln Phe Pro Ala Gln Val Glu Val80 85 90CGC CTC TTC TTT CCG CTG CAC CTC TGG GTG AAG AAT GTG TCC CTC AAC 337Arg Leu Phe Phe Pro Leu His Leu Trp Val Lys Asn Val Ser Leu Asn95 100 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Ser Gln Thr Phe Glu Asp Leu Thr Cys Phe Trp Asp Glu Glu35 40 45Glu Ala Ala Pro Ser Gly Thr Tyr Gln Leu Leu Tyr Ala Tyr Arg Gly50 55 60Glu Lys Pro Arg Ala Cys Pro Leu Tyr Sar Gln Ser Val Pro Thr Phe65 70 75 80Gly Thr Arg Tyr Val Cys Gln Phe Pro Ala Gln Val Glu Val Arg Leu85 90 95Phe Phe Pro Leu His Leu Trp Val Lys Asn Val Ser Leu Asn Gln Thr100 105 110Leu Ile Gln Arg Val Leu Phe Val Asp Ser Val Gly Leu Pro Ala Pro115 120 125Pro Arg Val Ile Lys Ala Arg Gly Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Gln130 135 140Ile His Trp Glu Ala Pro Ala Pro Glu Ile Ser Asp Phe Leu Arg His145 150 155 160Glu Leu Arg Tyr Gly Pro Thr Asp Ser Ser Asn Ala Thr Ala Pro Ser165 170 175Val Ile Gln Leu Leu Ser Thr Glu Thr Cys Cys Pro Thr Leu Trp Met180 185 190Pro Asn Pro Val Pro Val Leu Asp Gln Pro Pro Cys Val His Pro Thr195 200 205Ala Ser Gln Pro His Gly Pro Val Arg Thr Ser Pro Ala Gly Glu Ala210 215 220Pro Phe Leu Thr Val Lys Gly Gly Ser Cys Leu Val Ser Gly Leu Gln225 230 235 240Ala Ser Lys Ser Tyr Trp Leu Gln Leu Arg Ser Gln Pro Asp Gly Val245 250 255Ser Leu Arg Gly Ser Trp Gly Pro Trp Ser Phe Pro Val Thr Val Asp260 265 270Leu Pro Gly Asp Ala Val Thr Ile Gly Leu Gln Cys Phe Thr Leu Asp275 280 285Leu Lys Met Val Thr Cys Gln Trp Gln Gln Gln Asp Arg Thr Ser Ser290 295 300Gln Gly Phe Phe Arg His Ser Arg Thr Arg Cys Cys Pro Thr Asp Arg305 310 315 320Asp Pro Thr Trp Glu Lys Cys Glu Glu Glu Glu Pro Arg Pro Gly Ser325 330 335Gln Pro Ala Leu Val Ser Arg Cys His Phe Lys Ser Arg Asn Asp Ser340 345350Val Ile His Ile Leu Val Glu Val Thr Thr Ala Gln Gly Ala Val His355 360 365Ser Tyr Leu Gly Ser Pro Phe Trp Ile His Gln Ala Val Leu Leu Pro370 375 380Thr Pro Ser Leu His Trp Arg Glu Val Ser Ser Gly Arg Leu Glu Leu385 390 395 400Glu Trp Gln His Gln Ser Ser Trp Ala Ala Gln Giu Thr Cys Tyr Gln405 410 415Leu Arg Tyr Thr Gly Glu Gly Arg Glu Asp Trp Lys Val Leu Glu Pro420 425 430Ser Leu Gly Ala Arg Gly Gly Thr Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ala Arg435 440 445Tyr Ser Leu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln Gly450 455 460Pro 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权利要求
1.一种用于增加哺乳动物血小板数的方法，包括给哺乳动物施用可有效增加血小板数量的自由态MPL受体。
2.根据权利要求1的方法，其中的自由态MPL受体是一种可溶的MPL受体。
3.根据权利要求2的方法，其中的可溶的MPL受体是哺乳动物的。
4.根据权利要求3的方法，其中所说的可溶的哺乳动物的MPL受体选自鼠类和人类。
5.根据权利要求2的方法，其中的可溶的MPL受体选自序列编号2的第19残基(±10氨基酸)到第483残基(±10氨基酸)的多肽序列。
6.根据权利要求2的方法，其中的可溶的MPL受体选自序列编号4的第26残基(±10氨基酸)到第491(±10氨基酸)的多肽序列。
7.根据权利要求2的方法，其中的可溶的MPL受体是可溶在药物学上可接受的液体之中的。
8.根据权利要求2的方法，其中的可溶的MPL受体是可溶在体液之中的。
9.根据权利要求6的方法，其中的哺乳动物是人。
10.根据权利要求6的方法，其中的哺乳动物是正患有血小板缺乏病的。
11.根据权利要求1的方法，其中的用药是从静脉内注射实行的。
12.根据权利要求6的方法，其中所说的血小板增加数量的用药是大约每天每公斤1μg到100μg。
13.一种用于增加哺乳动物体内血小板数目的组合物，包括可增加血小板量的自由态MPL受体及药学上可接受的载体，该受体在该载体中是可溶的。
14.根据权利要求13之组合物，其中的自由态MPL受体是一种可溶性MPL受体。
15.根据权利要求14之组合物，其中的可溶性MPL受体是哺乳动物的。
16.根据权利要求15之组合物，其中的可溶性MPL受体选自鼠类和人类。
17.根据权利要求15之组合物，其中的可溶性MPL受体选自序列编号2第19残基(±10氨基酸)到第483残基(±10氨基酸)的多肽序列。
18.根据权利要求15之组合物，其中该可溶性MPL受体选自序列编号4第26残基(±10氨基酸)到第491残基(±10氨基酸)的多肽序列。
19.根据权利要求15之组合物，其中所说可增加血小板之量是大约从每天每公斤1微克到大约每公斤100微克。
全文摘要
本发明公开了一种增加哺乳动物血小板的方法，其包括给予哺乳动物可有效增加血小板数目之剂量的自由态MPL受体，该受体最好是可溶的。
文档编号A61P35/00GK1143969SQ95192071
公开日1997年2月26日 申请日期1995年1月18日 优先权日1994年1月21日
发明者E·S·蔡, M·M·霍科姆, P·亨特, J·L·尼科尔 申请人:安姆根有限公司