具有血小板GPⅡb－Ⅲa受体专一性的新型重组抗栓剂人胰岛素原－KGD嵌合肽的研制的制作方法

专利名称：具有血小板GPⅡb－Ⅲa受体专一性的新型重组抗栓剂人胰岛素原－KGD嵌合肽的研制的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更确切地说基于现代基因工程技术与蛋白质工程下游纯化技术研制的新型抗栓剂，其设计、制备及应用特点。
背景技术：
胰岛素原是胰岛素的前体蛋白质。胰岛素是一类激素，正常状况下由人体胰腺胰岛β细胞分泌，主要功能调节血糖降解代谢，促进血糖的氧化分解，所以有降低血液中葡萄糖含量的效果。正常情况下，血液中葡萄糖的形成与降解达成动态平衡，维持在一稳定浓度范围内。当体内的胰岛素分泌不足，或者体内因病理原因对胰岛素激素反应失敏后，会造成体内细胞对葡萄糖利用率的下降，体内血液中的葡萄糖不能被有效降解，造成体内血糖浓度升高，并引发一些列代谢紊乱。这就是人们所指的糖尿病症。胰岛素作为治疗糖尿病的特效药物，为人类广泛关注。早在上世纪初，加拿大科学家班廷首次将胰岛素引入对糖尿病疾病治疗中，取得了显著的疗效，此后胰岛素在世界范围内广泛推广，取得了巨大的社会效益与经济效益。人们对胰岛素的研究已有多年的历史，胰岛素分子是第一个成功地使用基因工程技术生产的多肽类药物，胰岛素分子也是第一个被测得完全氨基酸序列的蛋白质分子，并且，胰岛素分子也是被较早地测定出完全空间结构的蛋白质或多肽分子之一。虽然迄今为止，人们对胰岛素多肽分子的研究已经取得了丰硕的成果，但是对胰岛素分子的研究仍然在世界上许多著名的实验室及大型跨国制药公司中广泛进行，仍然不断地取得新的进展，这些进展也在不断地深化着人们对胰岛素分子的认识，开拓着胰岛素分子的应用领域。
胰岛素分子由两条单链组成，一般将其中较长的一条单链命名为B链，将较短的一条单链命名为A链，其中A链内有一对链内二硫键，B链与A链之间连接有两对链间二硫键，这三对二硫键将整个胰岛素分子连成一个致密的、高度有序的立体结构，确保胰岛素分子正确空间构象的形成，与其胰岛素受体相互作用，发挥其相应的生物学功能。迄今的研究已经表明，这三对二硫键在维持胰岛素分子正确空间构象形成，发挥生物学功能上作用不同。Tsou等通过理论计算表明，胰岛素分子的三对二硫键，只有两对是维持其正确空间构象所必需的，也就是说，三对二硫键在维持构象、发挥胰岛素生物学功能上地位是不同的[Tsou CL，Sci.Sin.，1962，11，1535-1558；Jiang RQ，Du YC，Tsou CL，Acta.Biochim.Biophys.Sin.，1963，3，176-180；Lundblad RL and Noyes CM.Chemical Reagents for Protein Modification，pp2-6，CRC Press，BocaRaton，FL，U.S.A.]。Dai和Hua等通过对A链链内二硫键缺失突变体的研究表明，当把(A6-A11)A链链内二硫键通过定点突变技术缺失后，胰岛素分子仍能形成近似天然的空间结构，表现为突变体的放射免疫活性基本上与野生型胰岛素分子相似，但突变体几乎丧失了全部的胰岛素生物活性，表现为突变体的胰岛素受体结合活性相对与野生型胰岛素分子而言，几乎全部丧失，仅保留了约0.15％的胰岛素激素活性[Dai Y and Tang JG.，Biochem.Mol.Biol.Int.，1994，33，1049-1053；Dai Y and Tang JG.Biochemica Biophysica Acta，1996，1296，63-68；Hua QX，HuSQ，Frank BH，Jia W，Chu YC，Wang SH，Burke GT，Katsoyanns PG and Weiss MA.J.Mol.Biol.，1996，264，390-403.]。这些研究表明，A链链内二硫键在维持胰岛素分子大部分的空间结构方面是不必需的，但对于维持胰岛素分子活性区域的完整性方面却是至关重要的。
对A链链内二硫键缺失的胰岛素突变体的立体结构进一步分析表明，突变体基本保留了野生型胰岛素分子的空间立体结构，具有相似的α-螺旋分布与β-折叠分布，胰岛素分子骨架基本与野生型一致，B链羧基端(B30位置)与A链氨基端(A1位置)之间的空间距离为5-10A，非常适合插入小片段外源多肽[Hua QX，Hu SQ，Frank BH，Jia W，Chu YC，Wang SH，Burke gt，Katsoyanns PG and Weiss MA.J.Mol.Bio.，1996，264，390-403.]。鉴于胰岛素突变体分子较小，分子量只有5.6kDa，具有两对链间二硫键以及稳定的α-螺旋与β-折叠，使整个分子结构致密而稳定，所以非常适合作为分子支架用于呈递外源肽序列。我们以前基于此分子支架研制成功的嵌合含Arg-Gly-Asp(RGD)序列的RGD-胰岛素原突变体的结构特征与活性特点也已证明了这一点[唐建国，井健，杨志红。以无活性胰岛素为骨架含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的抗栓新药的研究，发明专利，专利号99109419.0]。
Lys-Gly-Asp(KGD)序列是蛇毒抗栓肽Barbourin[Scarborough RM，Rose JM，Hsu MA，Phillips DR，Fride VA，Campbell AM，Narmizzi L，and Charo IF.J.Biol.Chem.，1991，266，9359-9362]与Ussuristatin-2[Kiyotaka Oshikawa et al.J.Biol.Chem.，1999，125，31-35.]中的功能序列，它位于多肽分子一个伸展向外的突环的顶端，Lys-Gly-Asp序列(KGD)与其后紧接的色氨酸残基(Trp)构成一个回环结构，KGD序列是功能位点，负责与血小板上纤维蛋白原受体GPIIb-IIIa识别并相互作用，从而强烈抑制血小板聚集现象发生。蛇毒抗栓肽Barbourin与Ussuristatin-2是去整合素蛋白家族中的两员，但与源自蛇毒的其它去整合素多肽相比，它们是依据KGD序列作为功能位点与血小板上GPIIb-IIIa受体相互作用，而非RGD(Arg-Gly-Asp)序列作为功能位点与血小板上GPIIb-IIIa受体相互作用。KGD功能位点与RGD功能位点在一级结构上的差别仅仅在于由Arg(精氨酸残基)变为Lys(赖氨酸残基)，但却引起生理功能方面的重大改变。有研究显示，KGD功能位点两边的氨基酸序列也参与了对GPIIb-IIIa受体的识别与结合过程[Minoux H，Chipot C，Brown D，Maigret B.J.Comp.Mol.Des.，2000，14，317-327.]。含有KGD功能序列的Barbourin与Ussuristatin-2蛇毒抗栓肽不仅仍然保留了很强的血小板聚集抑制活性，而且在受体识别方面表现出了较高的专一性。Barbourin与Ussuristatin-2去整合素依赖其KGD功能位点能够专一性地识别并结合血小板上纤维蛋白原受体GPIIb-IIIa，而对血小板上或其他细胞上的其他整合素受体，如粘接蛋白受体αVβ1、玻璃粘接蛋白受体α5β1等则亲和力很低[Scarborough RM，Rose JM，Hsu MA，Phillips DR，Fride VA，Campbell AM，Narmizzi L，and Charo IF.J.Biol.Chem.，1991，266，9359-9362；Kiyotaka Oshikawa et al.J.Biol.Chem.，1999，125，31-35.]。血小板聚集是体内血栓形成的最后一个关键步骤，血小板聚集主要是通过GPIIb-IIIa受体与细胞外相应配体，如纤维蛋白原、纤维粘结蛋白等进行相互作用实现的。Barbourin与Ussuristatin-2对GPIIb-IIIa受体具有识别与结合专一性，也就意味着Barbourin与Ussuristatin-2去整合素能够专一性地高效抑制血小板聚集，而不会去影响其他整合素受体发挥其正常的生理功能，从而高效而安全地抑制血小板聚集，抑制体内血栓的形成，降低因受体专一性问题而可能导致的一些副作用，实现更好的用药安全。
这一点，优于我们以前研制的RGD-类抗栓药物[唐建国，井健，杨志红。以无活性胰岛素为骨架含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的抗栓新药的研究，发明专利，专利号99109419.0]。去整合素Barbourin与Ussuristatin-2是近几年才研究清楚的具有GPIIb-IIIa受体专一性的天然蛇毒抗栓肽[Scarborough RM，Rose JM，Hsu MA，Phillips DR，Fride VA，Campbell AM，Narmizzi L，and Charo IF.J.Biol.Chem.，1991，266，9359-9362；Kiyotaka Oshikawaet al.J.Biol.Chem.，1999，125，31-35.]。研究表明，去整合素Barbourin是一种含有73个氨基酸残基的单链小肽，分子量约为7.7kD，其中含有六对二硫键，对其进一步的结构分析表明，整个分子形成一个紧密地、高度有序的结构。其中，六对二硫键将分子紧紧束缚，构成一个疏水的分子内核，而KGD功能位点则位于一个伸展向外的环肽区域的顶端，Lys和Asp残基侧链向外充分伸展，可以十分方便地与外界物质相互接触，在KGD功能位点两侧，分别有一个β-折叠片结构起支撑作用，在一定程度上稳定了长链环肽区域的结构稳定性。这些都是KGD功能位点发挥其正常生理学功能所必需的。这些结构特点与胰岛素多肽分子的空间结构具有较大的相似性。去整合素Barbourin与Ussuristatin-2是具有高度受体专一性的、高效的血小板聚集抑制剂，在抗血栓形成方面具有显著的特点，但它们都是源自蛇毒毒液的，对人体而言，具有很强的免疫原性，直接注射人体后会产生强烈的免疫反应，所以并不适合作为药物直接应用于临床医疗实践中。为了有效利用去整合素Barbourin与Ussuristatin-2抗栓肽的显著优点，避免其强烈的免疫原性对人体的伤害，基于以往的研究经验[唐建国，井健，杨志宏。以无活性胰岛素为骨架含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的抗栓新药的研究，发明专利，专利号99109419.0；Jing J and Tang.JG.Biotechnol.Lett.，2000，22，1，47-52.]，以及人胰岛素多肽分子空间结构与去整合素多肽Barbourin的相似性，我们考虑将Barbourin中的KGD功能位点通过基因工程的技术与方法，移植到(A6-A11)-A链链内二硫键缺失的人胰岛素原多肽分子上，构建嵌合KGD功能序列的人胰岛素原-KGD突变体，从而实现对人体无免疫原性的，人源化的、且具有高度GPIIb-IIIa受体专一性的新型重组抗栓剂的研制。

发明内容
随着国际上对整合素受体及其配体广泛而深入的研究，人类发现了KGD功能序列的独特性能[Scarborough RM，Rose JM，Hsu MA，Phillips DR，Fride VA，Campbell AM，Narmizzi L，and Charo IF.J.Biol.Chem.，1991，266，9359-9362.]，即KGD功能序列不仅象RGD功能序列一样具有高的血小板聚集抑制活性，而且这种抑制是由KGD功能序列专一性地与血小板上GPIIb-IIIa受体识别与作用的结果。血小板上含量最丰富的受体即是GPIIb-IIIa受体，而且GPIIb-IIIa受体也主要分布于血小板。所以对GPIIb-IIIa受体具有专一性，也即对处于血栓形成态时的血小板具有了专一性，因为此时血小板上的GPIIb-IIIa受体大量暴露，且处于激活状态。所以，含有KGD-功能序列的重组抗栓剂极有可能成为新一代GPIIb-IIIa受体专一性的抗栓剂。
人胰岛素分子是人源性多肽分子，对人胰岛素及胰岛素原结构的研究也积累了大量数据，其立体三维结构特征已十分清楚[Baker EN，Blundell TL，Cuffed JF，Cutfield SM，Dodson EJ，Dodson GG，Hodgkin DM，Hubbard RE，Isaaes NW，and Reynolds CD.Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.，1988，319，369-456；Hua QX，Hu SQ，Frank BH，Jia W，Chu YC，Wang SH，Burke GT，Katsoyanns PG and Weiss MA.J.Mol.Biol.，1996，264，390-403；Snell CR，Smyth DG.J.Biol.Chem.，1975，250，6291-6295；Weiss MA，Frank BH，Khait I，Pekar A，Heine R，Shoelson SE，andNeuringer LJ.Biochemistry，1990，29，8389-8401.]。A链链内二硫键缺失后的人胰岛素分子保留了几乎全部的放免活性，它的立体空间结构基本上与天然人胰岛素分子相同，所以对人体而言，不具有免疫原性，不会引起免疫反应。同时，A链链内二硫键缺失后的胰岛素分子几乎丧失了全部的胰岛素受体结合活性，所以不再具有胰岛素激素的活性，因而在作为呈递KGD功能序列的分子支架时不会表现出其原有的胰岛素激素活性，人胰岛素原-KGD嵌合分子将仅仅表现出KGD功能序列的生物活性，所以又是一个安全的分子支架。鉴于以往的研究经验，人胰岛素上用于嵌合外源KGD功能序列的位点选定在B链末端B28位与A链氮端A2位点之间，去整合素Barbourin是一类具有高度受体选择性与GPIIb-IIIa受体亲和性的高效抗栓剂[Scarborough RM，Rose JM，Hsu MA，Phillips DR，Fride VA，Campbell AM，Narmizzi L，andCharo IF.J.Biol.Chem.，1991，266，9359-9362.]，用于呈递的KGD功能序列源自去整合素Barbourin功能区域的多肽序列Cys-Ala-Lys-Gly-Asp-Trp-Asn-Cys(CAKGDWNC)序列，KGD两端的边侧序列与天然去整合素Barbourin中KGD功能序列两端的边侧序列一样，这样能够比较好地保证活性KGD功能构象的形成与维持，发挥KGD功能序列的生物活性。在KGD功能序列的两端引入两个半胱氨酸，在人胰岛素原-KGD嵌合肽分子中提供一对二硫键支持，能够有效稳定人胰岛素-KGD嵌合分子中KGD区域的分子结构，保证KGD区域活性构象的稳定性，达到与血小板上GPIIb-IIIa受体识别与相互作用的效果。人胰岛素原-KGD嵌合体分子的结构预测与分析也证明了以上结论。
依据人胰岛素原-KGD嵌合肽分子结构计算与分析的结果，通过现代基因工程技术，我们构建了全长的人胰岛素原-KGD嵌合肽的全长基因，并在大肠杆菌中实现了高效表达。表达产物的分离纯化工艺与流程方案为自主设计，首先对诱导表达的菌体进行超声破碎，再经过包涵体的分离、变复性过程，以及分子筛层析与离子交换层析过程，制备出具有较高蛋白质分子均一性的重组嵌合蛋白质分子。对人胰岛素原-KGD重组嵌合体蛋白质分子的理化学性质研究包括蛋白质分子均一性与荷质比的测定；蛋白质分子精确分子量的测定；蛋白质分子内自由巯基数目的检测；重组蛋白质分子氨基酸组成的分析与检测；重组体蛋白质分子的等电点分析。这些研究内容基本上涵盖了有关人胰岛素原-KGD嵌合体蛋白质的所有理化学性质与基本特征。对人胰岛素原-KGD重组嵌合体蛋白质分子的生物学活性分析包括抗栓活性的测定；抗血小板聚集抑制程度分析；胰岛素激素活性分析等。以上研究结果表明，人胰岛素原-KGD重组嵌合型多肽分子是一类具有GPIIb-IIIa受体专一性的，同时具有较高抗栓活性、无胰岛素受体结合活性的抗栓制剂。
人胰岛素原-KGD嵌合肽是基因工程生产的产品，属重组蛋白质制剂。它是在蛋白质分子设计的指导下构建的。分子设计理论预测与实际测定结果基本上是一致的，表明，我们设计的人胰岛素原-KGD嵌合体是一类具有较高的抗血小板聚集抑制活性，同时又不具有胰岛素激素活性的抗栓制剂。尤其是，我们设计的KGD序列为CAKGDWNC，它较好地在无活性胰岛素分子支架上展示了活性构象，表现出了较高的GPIIb-IIIa受体识别与结合活性，是一类GPIIb-IIIa受体专一性识别与结合的抗栓制剂。在这一点上优于我们以前构建的嵌合含RGD(Arg-Gly-Asp)功能序列的抗栓剂。并且，基于较高的血小板上GPIIb-IIIa受体选择性能与专一性受体识别与结合特征，嵌合CAKGDWNC序列的重组抗栓剂有可能提高临床用药安全型，降低药物副作用，而这是临床医疗实践过程中最希望看到的。
鉴于我们以前研制的含RGD功能序列的重组人胰岛素原突变体良好的性能[唐建国，井健，杨志红。以无活性胰岛素为骨架含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的抗栓新药的研究，发明专利，专利号99109419.0.]，我们设计的含有KGD功能序列的重组人胰岛素原嵌合型突变体是一类更安全有效的新型抗栓剂，它具有更加优良的性状，具有更加美好的发展前景。
经过军事医学科学院文献情报中心全面系统的文献检索，可以确认，目前该成果在国内尚无先例，在国际上也尚无相同的研究产品，此项研究成果具有较高的创新性，鉴于其实际应用价值，它极有可能成为具有我国自主知识产权的、有极大专利保护价值的国家一类新药。
本项研究的特点可以归纳为以下几个方面(1)人胰岛素原-KGD嵌合肽是一类新型的重组抗栓制剂；(2)人胰岛素原-KGD嵌合肽具有较高的抗血小板聚集抑制活性；(3)人胰岛素原-KGD嵌合肽是GPIIb-IIIa受体专一性的抗栓剂；(4)人胰岛素原-KGD嵌合肽不具有胰岛素激素活性，人胰岛素原突变体在此仅作为分子支架使用；(5)人胰岛素原-KGD嵌合肽是人源性的，对人体的免疫原性极低，甚至不具有免疫原性；(6)人胰岛素原-KGD嵌合肽分子量小，仅为6.3kD，属小分子量蛋白质，因而其下游加工、纯化工艺相对简单，能够大量生产；(7)人胰岛素原-KGD嵌合肽的整个生产过程不产生对环境有害的物质，不污染环境。


图1、人胰岛素原-KGD嵌合肽一级结构(含二硫键)示意图；图2、人胰岛素原-KGD嵌合肽突变体分离纯化图谱。其中图(A)为Sephacryl S200HR分子筛层析图谱；图(B)为DEAE-Sephadex离子交换层析图谱。
图3、12％SDS-PAGE(图A)及Native-PAGE(图B)电泳检测人胰岛素原-KGD嵌合肽突变体。其中，图A中Lane1，蛋白质分子量参照物；Lane2，pET21a载体转化E.coliBL21(DE3)pLysS宿主菌全蛋白；Lane3、4，含有人胰岛素原-KGD嵌合肽基因的重组表达载体pEK214转化E.coli BL21(DE3)pLysS宿主菌全蛋白；Lane5，人胰岛素原-KGD嵌合肽纯化蛋白。图B中Lane1，野生型人胰岛素原；Lane2，人胰岛素原-KGD嵌合肽纯化蛋白。
图4、人胰岛素原-KGD嵌合肽质谱检测图；图5、人胰岛素原-KGD嵌合肽突变体的胰岛素受体结合分析图谱。其中，(●)代表人胰岛素原-KGD嵌合肽重组突变体蛋白质；(■)代表天然人胰岛素制剂。
图6、人胰岛素原-KGD嵌合肽突变体对血小板聚集抑制图谱。图A为ADP刺激下血小板聚集透射光图谱；图B为人胰岛素原-KGD嵌合肽对血小板聚集抑制曲线图。
具体实施例方式
实施例1.人胰岛素原-KGD嵌合肽基因的构建实验材料菌株E.coli DH5α、BL21(DE3)pLysS、JM109均为市售产品。
引物寡核苷酸引物DNA片段为北京赛百盛公司合成。引物15’CCCAAGCTTGAATTCACATG A3’；引物25’GAAGAAGCGGCTTTAGCCAGCTTCCCTTTGCCCACCTGCACATA3’；引物35’CATAAGCCGCTGTC 3’；引物45’GTGGCGCTGATCACCC3’。
化学试剂与酶类常用限制性内切酶类、T4DNA连接酶、Klenow片段、T4DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶、Taq DNA聚合酶、RNase、ATP、dNTPs、IPTG、TEMED等购自Promega公司、华美生物技术公司或Takara生物技术公司。pET21a vector购自美国Novagen公司。DNA wizard plus Miniprep DNA purification system购自Promega公司。超纯尿素、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺及Tris均为上海生工进口分装(U.S.A)。二硫苏糖醇为Takara生物技术公司产品。Trypton、Yeast Extract为美国Oxiod公司产品。Sephacryl S200HR层析介质、SephadexDEAE离子交换层析介质购自瑞典Pharmacia Biotech公司。Amicon Centricon 30微量离心管为Millipore公司产品。其它化学试剂均为国产分析纯产品。胰岛素原标准品、DTNB试剂、人胰岛素原胎盘膜受体、3.8％枸橼酸钠、PRP(富含血小板血浆)、PPP(贫含血小板血浆)、0.9％生理盐水为本室自制。胰岛素标准品、ADP(腺嘌呤二核苷酸)为美国Sigma公司产品。125I-胰岛素购自北京海科瑞生物技术公司；常用分子生物学溶液按《分子克隆》(第三版)实验手册配制。
实验设备SGI图形工作站及相关蛋白质分子结构计算软件包为美国SGI公司产品；微量蛋白电泳仪、蛋白转膜电泳仪为美国Bio-Rad公司产品；Chrono-LOG双道检测仪、γ-计数器为美国Cole-Parmer公司产品；紫外检测仪与层析记录仪为北京联合仪器厂产品；FPLC快速蛋白液相色谱仪为瑞典PharmaciaBiotech公司产品；质谱仪为美国HewlettPackard公司产品；紫外分光光度计为岛津公司产品。
实验方法与结果1.人胰岛素原-KGD嵌合型突变体作为新型抗栓剂的分子设计应用SGI工作站，基于高分辨率蛋白质分子结构计算与模拟软件包Insight II(2000版)对人胰岛素原-KGD突变体进行分子设计与结构模拟。我们设计了一系列含有KGD功能位点的氨基酸残基序列，插入至(A6，A11)二硫键缺失突变的人胰岛素分子的B28位与A2位之间，构建人胰岛素原-KGD嵌合型重组蛋白质分子结构。
人胰岛素原-KGD突变体的分子设计主要分为两部分进行首先，应用SGI图形工作站以及高性能蛋白质分子结构计算软件包，我们对源自美国Brookheaven蛋白质数据库的天然人胰岛素原晶体结构数据进行计算与结构优化，将天然人胰岛素多肽分子的(A6-A11)A链链内二硫键进行缺失突变，用Ser残基分别替换A6位的Cys与A11位的Cys，得到A链链内二硫键被删除后的人胰岛素多肽分子的空间立体结构。然后，进一步删除B链中的B29-B31位的氨基酸残基，以及A链上A1位的氨基酸残基。结构计算与优化后，得到突变体分子的立体空间结构以及相应的数据集。基于此突变体的分子结构数据，作为搭建人胰岛素原-KGD突变体的分子骨架。
人胰岛素原-KGD突变体分子设计的第二步在上一步得到系列二硫键缺失人胰岛素突变体分子结构信息的基础上，在B链B28位与A链A1位之间插入一系列含KGD功能位点的氨基酸残基序列，以替代人胰岛素原中的C肽序列，构建嵌合含KGD序列的人胰岛素原突变体分子。对它们进行结构计算与优化，确定出最有希望展现出高抗血小板聚集活性与高的GPIIb-IIIa受体结合活性的KGD功能构象及相应的人胰岛素原-KGD突变体。最后的计算结果表明，KGD功能序列位于分子整体结构的表面，KGD序列暴露于分子外侧，位于一个环肽区域的顶端，氨基酸残基侧链基团伸展向外，与含KGD功能序列的天然去整合素Barbourin分子结构中KGD的功能位点的空间构象极为相似[Minoux H，Chipot C，Brown D，and Maigret B.，J.Comp.Mol.Des.，2000，14，317-327.]，人胰岛素原-KGD突变体嵌合肽具有表现出较高的血小板聚集抑制活性与较高的GPIIb-IIIa受体识别与结合活性的结构条件。
2.人胰岛素原-KGD嵌合肽基因构建构建方法为自主设计。以(A6，A11)二硫键缺陷型胰岛素原突变体基因为模板，使用引物1和引物2进行PCR反应，合成DNA片段作为上游DNA片段；同样，使用引物3和引物4进行PCR反应，合成DNA片段作为下游DNA片段。利用上游DNA分子与下游DNA分子的互补粘性区域，搭桥扩增，使用引物1和引物4进行二次PCR反应，形成长约200bp的DNA分子。将其克隆至pET21a质粒，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，筛选并检测重组克隆。构建后的人胰岛素原-KGD嵌合肽突变体基因经DNA序列分析检测，符合预期设计要求。人胰岛素原-KGD嵌合肽突变体基因的核苷酸序列如所附“氨基酸序列与碱基序列.SEQ”所示。
实施例2.人胰岛素原-KGD嵌合肽突变体在大肠杆菌表达体系中的表达与纯化对重组有突变体基因的大肠杆菌表达菌株进行发酵培养。当培养液中菌体生长达到对数期时，加入IPTG进行基因的诱导表达，表达时间5-7小时。然后，收集发酵培养的湿菌体，离心。将上述发酵培养的菌体悬浮于STET溶液，进行超声破碎大肠杆菌等处理，将处理过的溶液离心，10,000g，4℃，10分钟，收集离心后沉淀，用包涵体裂解液溶解沉淀，4℃搅拌过夜，在溶液中加入二硫苏糖醇，终浓度达到15-20mM，室温静置2小时，用5倍体积的预冷水扩大溶液总体积，以3N HCl调节pH至5.0附近，进行等电点沉淀，静置沉淀体系3小时，高速离心收集沉淀，12,000rpm，4℃，20分钟，转移至2升0.05N，pH10.5甘氨酸钠缓冲溶液，反应24小时，对溶液超滤浓缩至15mL以内，上样到用同样缓冲液平衡过的分子筛层析柱中(Sephacryl S200-HR，3.0cm×50cm)，室温条件下用同样缓冲液洗脱，流速1.0mL/min，洗脱结果如附图2(A)所示，其中峰2即为含有人胰岛素原-KGD嵌合肽重组分子的洗脱部分，集合洗脱液，对0.02M Tris-HCl，pH7.6，30％甘油的溶液透析3-6小时，将透析后的样品溶液上样到DEAE Sephadex离子交换层析柱中，用含0.6M NaCl的Tris-HCl，pH7.6溶液进行浓度梯度洗脱，流速0.8mL/min，进一步纯化重组多肽分子，洗脱图谱如附图2(B)所示，其中第三个紫外吸收峰即对应于人胰岛素原-KGD嵌合肽重组分子。收集相应洗脱溶液，脱盐处理后，进行真空冷冻干燥处理，即得到人胰岛素原-KGD嵌合肽重组蛋白质产品。用上述工艺流程得到的人胰岛素原-KGD嵌合肽分子用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，显示为均一的染色条带，如附图3所示，上述实验结果与氨基酸组成分析、质谱检测实验的结果一致。表明人胰岛素原-KGD嵌合肽重组蛋白质得到了较好的纯化，能够满足进一步理化学性质分析及生物活性测定的要求。
实施例3.人胰岛素原-KGD嵌合肽重要理化学性质的研究1、分子量测定质谱检测实验由北京军事医科院分析测试中心质谱测定室完成。具体步骤参考美国HP公司质谱测定仪的产品使用说明手册及检测软件包使用说明书，结果如附图4所示。测定的人胰岛素原-KGD嵌合肽分子量为6303Dalton，与其理论计算值(MW＝6322Dalton)相比，误差为0.3％，在质谱测定允许误差范围内，证明测定结果真实可靠。测定结果表明，人胰岛素原-KGD嵌合肽重组蛋白纯化产物保持了比较好的结构完整性，同时质谱检测也显示，杂蛋白峰较少，表明纯化产物的分子均一性较好。
2、自由巯基数目的测定调节多肽浓度，使之达到适当范围，取15-30uL待测样品，加入1mLDTNB溶液中，25℃保温，反应0.5小时，然后测定412nm吸光值，根据吸光值大小判断多肽中二硫键含量，并对照标准曲线计算巯基数量。若待检分子中含有自由巯基(-SH)，则会出现显色反应，反应溶液体系呈现橙黄色；若待检分子中无自由巯基，则反应溶液体系不呈现任何反应[Ellman GL.，Arch.Biochem.Biophys.，1959，82，70-77.]。对获得的人胰岛素原-KGD嵌合肽重组蛋白质干粉进行实验，结果表明无任何显色现象出现，表明该物质中无自由巯基存在，所有的半胱氨酸都形成了二硫键连接，以-S-S-键形式存在。
3、SDS-PAGE与Native-PAGE电泳检测SDS-PAGE电泳实验表明(附图3A)，人胰岛素原-KGD嵌合肽重组蛋白分子位于小分子蛋白区域，符合其理论分子量数值(MW＝6.9kD)。电泳结果显示为一条主染色条带，表明蛋白纯度较高，杂蛋白较少，表明蛋白质的纯化效果较好。在SDS-PAGE电泳中，由于去污剂SDS和还原剂DTT的作用，破坏了蛋白质分子固有的天然结构，使得所有的蛋白质分子基本上按照分子量大小进行排列分布，所以还不能完全反映蛋白质分子本身固有的荷电性质，为此，还进行了Native-PAGE电泳。在Native-PAGE电泳中，不添加SDS及DTT成分。Native-PAGE电泳实验结果如附图3B所示。在Native-PAGE电泳中，蛋白质或多肽在电场中的泳动速率不仅仅取决于蛋白质或多肽分子量，还取决于其上所带的电荷，所以，反映的是蛋白质或者多肽分子整体的荷质比情况，实验结果表明，人胰岛素原-KGD嵌合肽重组蛋白分子的泳动率高于野生型人胰岛素原分子，说明其荷质比高于胰岛素原分子。同时，实验结果表明，人胰岛素原-KGD嵌合肽重组蛋白质表现为一条主要的电泳条带，说明人胰岛素原-KGD嵌合肽分子结构具有比较好的结构完整性与较高的蛋白质纯度。
实施例4.人胰岛素原-KGD嵌合肽的胰岛素激素活性测定采用胰岛素受体结合分析方法测定相关胰岛素激素活性指标，这是国际上通用的测定胰岛素激素活性的方法。实验中所使用的胰岛素受体为自制的，是从人胎盘组织中提取的胎盘膜人胰岛素受体[Fujita-Yamaguchi Y，Choi S，Sakamoto Y，and Hakura K.J.Biol.Chem.，1983，258，5045-5049.]。当待测样品具有与胰岛素受体结合的能力时，放射性125I-胰岛素分子与胎盘膜人胰岛素受体的结合会受到抑制，并且这种抑制随着待测样品浓度的升高而加强。通过γ-放射性计数器监测参与胰岛素受体结合的125I-胰岛素情况，作为判断待测样品与胰岛素受体作用的指标。以待测样品浓度对数值为横坐标，放射性标记胰岛素与受体结合后形成沉淀的放射性γ-计数值为纵坐标，绘制胰岛素受体竞争性结合曲线。对照采用天然非碘标胰岛素，其胰岛素受体竞争结合曲线作为标准曲线。通过与天然胰岛素的受体结合活性比较，判断待测样品的胰岛素激素活性。在实验操作过程中，以人胰岛素原-KGD嵌合肽重组蛋白作为待测样品。以天然非碘标胰岛素多肽制剂作为阳性对照，测定人胰岛素原-KGD嵌合肽重组蛋白的胰岛素激素活性。实验结果如附图5所示。实验结果表明，人胰岛素原-KGD嵌合肽的IC50值为0.04％。实验结果显示，随着使用浓度的升高，125I-胰岛素与胰岛素受体的结合不受影响，说明人胰岛素原-KGD嵌合肽不具备胰岛素受体结合活性，不表现胰岛素激素活性，这与分子设计与结构模拟的结果是一致的。说明(A6，A11)二硫键删除后的人胰岛素原分子是能够作为外源肽的分子支架，形成的嵌合重组多肽分子不表现胰岛素激素活性，适合呈递外源KGD-功能序列。
实施例5.腺嘌呤核苷酸二磷酸(ADP)刺激下的血小板聚集抑制实验研究人胰岛素原-KGD嵌合肽的抗栓活性实验用富含血小板血浆(简称PRP，platelet-rich plasma)取自兔。该方法为测定药剂抗栓活性的常规方法，为卫生部规定和国际通用。用光浊度计监测反应进行中血小板聚集情况，透射光强度将随着血小板聚集率的上升而升高。用生理盐水溶解人胰岛素原-KGD嵌合肽多肽，配制不同的浓度，用于测定ADP刺激下血小板聚集的抑制情况。实验对照为不含任何蛋白及多肽成分的0.9％NaCl的生理盐水，整个反应过程用光浊度仪监测反应体系透射光信号强弱。首先将新鲜血液45mL与5mL 3.8％枸橼酸钠混匀，注入到硅化的无菌离心管中，1000rpm离心15分钟，吸取上层PRP血浆，计数血小板并调至3×106个/mL。将剩余的血液以3000rpm离心20分钟，吸去上层透明PPP溶液，将PRP溶液300uL与缓冲液(对照)或待测样品混匀后加入到测试管中，在37℃保温3分钟。用PPP调零点，然后将对照管(含PPP溶液)和测试管放入测试孔中，在测试管中加入诱导剂ADP至终浓度为10uM，迅速搅拌，并随时间坐标记录血小板聚集光透射图谱，3分钟后结束记录，血小板聚集仪自动给出样品的最大聚集率。光透射记录图谱如附图6(A)所示，样品对血小板聚集的抑制率＝(对照的最大聚集率-样品的最大聚集率)/对照的最大聚集率×100％。以抑制率对样品浓度作曲线，当抑制率达到50％时待测样品的浓度为其IC50值。实验过程中光信号强度变化情况如图6A所示。实验结果显示人胰岛素原-KGD嵌合肽对血小板聚集表现出较为强烈的抑制效应。从血小板聚集抑制曲线图中求出最大半抑制浓度值IC50为830nM，如附图6B所示。同样反应条件下，天然去整合素抗栓肽的IC50值一般在10-7-10-8M之间[McLane MA，Vijay-KumarS，Marcinkiewicz C，Calvete JJ，and Niewiarowski S，FEBS lett.，1996，291，139-143；Lazarus RAand McDowell RS.Opin.Biotechnol.，1993，4，438-445；Calvete JJ，Schafer W，Soszka T，Lu W，Gook JJ，Jameson BA，and Niewiarowski S，Biochemistry，1991，30，5225-5229.]，其它人工合成的抗栓肽或抗栓蛋白制剂的IC50值一般在10-3-10-7M之间[Lee G，Chan W，Hurle MR，DesJarlais RL，Waston F，Sathe GM，and Wetzel R.Protein Eng.，1993，6，745-754；Lu X，RahmanS，Kakkar VV，andAuthi KS.J.Biol.Chem.，1996，271，289-294.]。相比较而言，人胰岛素原-KGD嵌合肽是一种较强的抗血小板聚集多肽，具有实际应用价值，并且其性能好于目前已经构建的一些重组抗栓制剂。这也说明人胰岛素原-KGD嵌合肽重组嵌合分子中的功能性KGD序列展示出其功能活性构象，能够较好地识别并结合血小板上GPIIb-IIIa受体，表现出较强的抑制血小板聚集的活性。血小板聚集主要是通过血小板上纤维蛋白原受体GPIIb-IIIa与细胞外基质的相互作用发生的。GPIIb-IIIa受体被强烈拮抗时，血小板与血小板之间、以及血小板与细胞外基质之间的相互作用被抑制。血小板聚集抑制实验清晰地表明人胰岛素原-KGD嵌合肽具有与受体GPIIb-IIIa相互作用的能力。应当说，这一能力的表现是嵌合于C肽位置的KGD-功能序列表现出来的。说明KGD-功能序列展示出相应的活性构象，发挥出其受体识别与结合特点，从而表现出相应的生物学功能。由于KGD-功能序列是专一性地识别并结合血小板GPIIb-IIIa受体，构建的人胰岛素原-KGD嵌合肽只具有专一性的GPIIb-IIIa受体识别与结合活性与抗血小板聚集抑制活性，而无胰岛素激素活性，其(A6，A11)-二硫键缺失的人胰岛素原分子支架为人源性的，对人体而言不具有外源物质免疫原性，因而应用于人体不会产生免疫反应。综上所述，人胰岛素原-KGD嵌合肽是一类安全的、高效的重组抗栓多肽制剂，极有希望应用于实际临床医疗中，达到治病救人的疗效。
序列表<110>北京师范大学<120>具有血小板GPIIb-IIIa受体专一性的新型重组抗栓剂人胰岛素原-KGD嵌合肽的研制<130>
<160>2<170>
<210>1<211>183<212>DNA<213>
<400>1tttgtcaatc agcacctttg tggttctcac ctggtggagg ctctgtacct ggtgtgtggg60gaacgtggtt tcttctacac accctgtcgt gaggctaagg gtgactggaa tgacgactct120tgtattgtgg agcaggcttg caccagcatc gcttccctct accaactgga gaactactgc180aac 183<210>2<211>61<212>PRT<213>
<400>2Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr15 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Cys Arg Glu Ala20 25 30Lys Gly Asp Trp Asn Asp Asp Ser Cys Ile Val Glu Gln Ala Cys Thr35 40 45Ser Ile Ala Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn50 55 60
权利要求
1.一种新型抗栓剂，其特征在于它是一类以(A6，A11)-二硫键缺失突变胰岛素原为分子载体，在C肽位置插入功能型CAKGDWNC(半胱氨酸-丙氨酸-赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-色氨酸-天冬酰胺-半胱氨酸)特异序列以替代C肽而形成的新型嵌合型重组多肽分子。
2.根据权利要求1所述的新型抗栓剂，其特征在于所说的分子载体为(A6，A11)-二硫键缺失的人胰岛素原，并且其B链B29-B31位氨基酸残基被删除，其A链A1位氨基酸残基被删除。
3.根据权利要求1所述的新型抗栓剂，其特征在于所说的置换C肽的KGD(赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)功能序列为CAKGDWNC(半胱氨酸-丙氨酸-赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-色氨酸-天冬酰胺-半胱氨酸)。
4.根据权利要求1所述的新型抗栓剂，其特征在于所说的抗栓剂分子结构中KGD-功能序列置换的是原胰岛素原突变体中的C肽序列。
5.根据权力要求1或2或3或4所述的新型抗栓剂的制备方法，包括以下步骤(1)人胰岛素原-KGD嵌合肽重组蛋白质的分子结构设计；(2)人胰岛素原-KGD嵌合肽重组蛋白质的基因构建方法；(3)人胰岛素原-KGD嵌合肽重组蛋白质的表达与分离纯化方法；(4)人胰岛素原-KGD嵌合肽重组蛋白质的理化学性质测定；(5)人胰岛素原-KGD嵌合肽重组蛋白质的抗栓活性测定；(6)人胰岛素原-KGD嵌合肽重组蛋白质的胰岛素激素活性测定。
6.权力要求1或2或3或4所述的新型抗栓剂，在预防和治疗心脑血管疾病中的应用以及进行有关血液学、细胞生物学及临床基础研究中的应用。
7.权力要求6中的用途，其特征在于所说的心脑血管疾病为血栓性疾病。
全文摘要
本项发明基于现代生物化学技术，以人胰岛素原突变体[(CysA6Ser，CysA11Ser，ΔB29－B30，ΔA1)－人胰岛素原]为分子支架，在原C肽位置用特异性含Lys－Gly－Asp(KGD)功能序列CAKGDWNC(半胱氨酸—丙氨酸—赖氨酸—甘氨酸—天冬氨酸—色氨酸—天冬酰胺—半胱氨酸)置换，得到人胰岛素原－KGD嵌合肽重组蛋白质分子。在原核细胞大肠杆菌表达体系中实现高效表达，表达产物经过超声破碎、等电点沉淀、分子筛层析及离子交换层析等实验步骤后获得纯化。理化学性质分析及重要生物学功能检测表明，人胰岛素原－KGD嵌合肽重组蛋白质分子均一性良好，具有较高的GPIIb－IIIa受体识别与结合活性与较强的抗血小板聚集抑制活性，而无胰岛素激素活性及免疫原性，是一类安全高效的新型基因工程重组抗栓多肽制剂，极有希望应用于实际临床医疗实践中。
文档编号A61P43/00GK1810836SQ20061000727
公开日2006年8月2日 申请日期2006年2月17日 优先权日2006年2月17日
发明者井健 申请人:北京师范大学